وأيد هذا العمل في جزء من مؤسسة العلوم الوطنية (CBET 0846453) ، والمعاهد الوطنية للصحة (1R01GM089999).

1. تصنيع السيليكون سادة باستخدام معيار SU - 8 ضوئيه 1 (لا يظهر في هذا الفيديو). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأساليب القياسية SU - 8 ضوئيه لإنشاء SU - 8 &quot;سادة&quot; (SU - 8 2050 ، MicroChem ، نيوتن ، MA) لانتاج مكونات مختلفة (سمك الأغشية PDMS مختلفة ، وشارك في ثقافة الغرفة) في غرف الأبحاث. يمكن أن تكون ملفقة قوالب الرئيسي من هذا القبيل في أي مرفق التصنيع الدقيق (على سبيل المثال ، على microfluidics مسبك ستانفورد ؛ <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل PDMS النسخ المتماثل ، فضح SU - 8 سادة لبخار fluorosilane في مجفف تعلق بمصدر فراغ لتسهيل إطلاق سراح من السهل PDMS من سيد أضف قطرة من fluorosilane على منشفة ورقية وتطبيق فراغ لمدة دقيقة. إزالة فراغا ويسمح لمدة 30 دقيقة لترسب fluorosilane. الحفاظ على SU - 8 الماجستير في حاوية مغلقة لاستخدامها في المستقبل. </li></ol> 2. صب متماثلة PDMS من SU - 8 2 ماستر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مصنوعة طبقة وطبقة fluidic سيطرة صب متماثلة PDMS من SU - 8 الرئيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج PDMS قبل البوليمر وعبر رابط ، على وزن 10:01. النسبة وديغا في مجفف لل1hour (أو حتى تتم إزالة فقاعات الهواء من خليط PDMS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع SU - 8 الماجستير في طبق بتري ويسكب الخليط بعناية PDMS على رأس سيد SU - 8. ديغا في PDMS مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 1200 دورة في الدقيقة العفن لدقيقة واحدة للحصول على سمك PDMS موحد حول 100μm على العفن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين طبق بتري الذي يحتوي على PDMS وSU - 8 القالب الرئيسي عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لعلاج PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشفاء PDMS المغطاة SU - 8 الرئيسية من موقد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر العفن PDMS من سيد SU - 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر أربعة ثقوب في القالب PDMS باستخدام قياس 20 إبرة حادة في نهاية البكتيريا لمداخل اثنين ، واحد ومخرج منفذ واحد الهوائية. </li></ol> 3. الرابطة من الأجهزة متعددة الطبقات PDMS : يتم تجميع هذا الجهاز مع ثلاث طبقات ، الطبقة العليا التي تحتوي على القناة الرئيسية ، طبقة الهوائية المتوسطة ، والطبقة السفلية البكتيرية التي تحتوي على قنوات للبكتيريا. يتم تجميعها في ثلاث طبقات على النحو المبين أدناه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب الأغشية PDMS مع الميثانول وبعناية من قشر لهم بهم SU - 8 القالب الرئيسي باستخدام الملقط نظيفة. غشاء مكان على ورقة تفلون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الغشاء الهوائية وطبقة fluidic على الأوكسجين غرفة البلازما. بدوره على البلازما لمدة 40 ثانية (10 SCCM ضغط الأكسجين طاقة ترددات الراديو RF 100W). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التعرض للالبلازما ، محاذاة (في غضون 10 دقيقة) الغشاء على قناة PDMS القاع باستخدام ملقط. مضيفا الميثانول على الغشاء وطبقات PDMS يساعد الحركة الحرة للطبقات ، ويجعل المحاذاة أسهل. في هذه الحالة ، يتم وضع الجهاز على قطعة من الشاش للسماح للأبخرة ميثانول من الفرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج PDMS طبقات الانحياز على موقد في 80 درجة مئوية لمدة 8 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الترابط الغشاء الهوائية على الطبقة السفلية ، كرر الخطوات من 3،2-3،4 لسندات القناة أعلى على الجهاز المركب PDMS تجميعها. </li></ol> 4. تجميع الجهاز PDMS 3،4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر ثقوب في الموانئ مدخل ومخرج تستخدم لبذر خلايا حقيقية النواة والبكتيريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنابيب Tygon (0.01 بوصة OD) إلى الموانئ وتشغيلها عن طريق سحب الطبقة الهوائية مع حقنة 20mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع نموذج PDMS وشريحة زجاجية قبل تنظيفها الى غرفة الأوكسجين البلازما. بدوره على البلازما لمدة 20 ثانية (20 SCCM ضغط الأكسجين طاقة ترددات الراديو RF 300W) من دون تطبيق هذا الفراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وذلك لمنع الاتصال بين الرابطة الجزيرة (PDMS) الجدار إلى الشريحة الزجاجية ، الاتصال فورا حقنة إلى الجهاز وتطبيق الفراغ عن طريق سحب المحقنة وعقد في مكانه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط برفق نموذج PDMS على الزجاج (في حدود 2 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الجهاز PDMS في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li></ol> 5. معالجة السطح الزجاجي مع فبرونيكتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الجهاز تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة بعد توصيل أنابيب Tygon إلى كل منفذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعبئة وتدفق PBS تعقيمها في قناة لإزالة أي حطام في القناة. تطبيق تدفق لمدة 10 دقائق لإزالة فقاعات الهواء. يمكن لفقاعات الهواء الهرب بسهولة PDMS بسبب نفاذية الغاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء محلول الصبغة اللون في القناة الهوائية لمنع تشكيل فقاعات الهواء في القناة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتسهيل خلية حقيقية النواة البذر على الزجاج ، وإدخال 1 ميكروغرام / مل حل فبرونيكتين في الجهاز ، واحتضان لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل فبرونيكتين الزائدة مع 1 مل من وسائط النمو. </li></ol> 6. تشكيل وقياس هاء المتعايشة بيوفيلم في القولونيةالجزر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع البكتيريا المتعايشة (على سبيل المثال ، كولاي BW25113/pCM18) في وسائل الإعلام إلى الحد الأدنى من M9 OD 600 ~ 1 لتشكيل بيوفيلم المتعايشة في الغرف المغلقة / الجزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الجدار الجزيرة إيجابية من خلال تطبيق ضغط السائل. ويستخدم محلية الصنع تحويل ضغط الهواء إلى سائل لمنع تشكيل فقاعة الهواء في القناة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعرض E. المتعايشة مغلق القولونية في الجزر مع صمام ، وتسمح للبكتيريا ان نعلق لمدة 1 ساعة على 32 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البكتيريا غير مرتبط ويروي تعليق تمييع البكتيرية (OD 600 ~ 0.05) في 0.25mL/hr لمدة 12 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف بيوفيلم مع الطازجة وسائط النمو DMEM لإزالة البكتيريا فضفاضة المرفقة والاستعداد للارتباط الخلية حقيقية النواة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة بيوفيلم باستخدام TCS SP5 ايكا مسح بالليزر متحد البؤر مجهر (بانوكبورن ، IL) ، ووضع تصور لهيكل بيوفيلم باستخدام برنامج IMARIS 5. </li></ol> 7. بذر خلايا حقيقية النواة حول الجزر البكتيرية 6-8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين خلايا هيلا من قارورة زراعة الأنسجة وresuspend في وسائل الإعلام عن كثافة DMEM بذر خلايا من 5 × 5 10 / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال خلايا هيلا في الجهاز بمعدل تدفق 2 مل / دقيقة باستخدام مضخة محقنة Picoplus (هارفارد Apparattus ، MA). ضمان أن يتم تخفيض الجدار الجزيرة بحيث بيوفيلم البكتيرية منفصل عن المنطقة الخلية هيلا. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة على مرحلة مجهر الضوء بحيث يمكن تحديد توحيد البذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشبك مأخذ خلية للحد من حركة تعليق خلية في القناة واحتضان لمدة 6 ساعات إلى 37 درجة مئوية في حاضنة 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي الجهاز مع نمو المتوسط ​​عند 0.5 مل / ساعة لإزالة الخلايا غير مرتبط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديث وسائل الإعلام عن DMEM هيلا وهاء المتعايشة القولونية كل 6 ساعات. </li></ol> 8. مقدمة من البكتيريا المسببة للأمراض في الجزيرة ، والتعرض للخلايا حقيقية النواة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد E. القولونية O157 : H7 (EHEC) لتصيب خلايا هيلا في عدد وافر من العدوى (موي) من 100:1 200:1 (عدد EHEC لكل خلية هيلا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف وغسل البكتيريا المتعايشة فضفاضة المرفقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعرض تعليق تمييع EHEC (OD 600 ~ 0.1) في الجزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الجهاز عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5 ٪ CO 2 لمدة 6 ساعات دون تدفق للسماح EHEC أن تتعرض لإشارات موجودة في بيوفيلم المتعايشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الجدار PDMS لفضح EHEC المتعايشة في الجزر إلى خلايا هيلا لمدة 6 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع قناة PBS وصمة عار للخلايا الحية والميتة استخدام عدة لايف / الميت (L3224 ، Invitrogen ، CA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواقع متعددة على صورة مجهر زايس 200M Axiovert مضان وتقدير عدد الخلايا الحية والميتة. </li></ol> 9. نتائج ممثل 9 وحاكت تسلسل الأحداث في التهابات الجهاز الهضمي من خلال تطوير أحادي الطبقة من الخلايا هيلا والمتعايشة E. بيوفيلم القولونية وفضح EHEC إلى بيوفيلم المتعايشة قبل إصابة خلايا هيلا. تظهر الخطوات المتبعة في تصنيع نموذج التعاون ثقافة ميكروفلويديك في الشكل 1. 2A الشكل يظهر تقديم 3 الابعاد للجهاز المشترك الثقافة. وترد المنطقتين في الجهاز المشترك ثقافة ثقافة خلية حقيقية النواة غرفة وجزيرة الجرثومي في الشكل 2B بأصباغ مختلفة الألوان (اللون الأرجواني للمناطق خضراء وحقيقية النواة للجزيرة الجرثومي). يظهر جدوى عزل مناطق ثقافة البكتيرية من المنطقة المحيطة حقيقية النواة في الشكل 2C باستخدام الأصباغ الملونة. ويبين الشكل 3 ممثل من نتائج ثقافة مشتركة من الخلايا الظهارية والبكتيريا. 3A يبين الشكل استعمار بيوفيلم المتعايشة (الخضراء) الجزيرة EHEC (الحمراء). الشكل 3B يبين تجاور الخلايا الظهارية وهاء المتعايشة القولونية مع EHEC في الجزيرة البكتيرية. وطلب تقديم العروض المترجمة معربا عن EHEC والبكتيريا المتعايشة معربا عن GFP في الجزيرة عندما ينخفض ​​الجدار PDMS ، مما يدل على جدوى عزل الجزيرة بكتيرية من الخلايا الظهارية. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : مخطط الخلية البذر في نموذج التعاون الثقافة. (1) ينخفض ​​الجدار PDMS على شكل جزيرة ، وقدم البكتيريا المتعايشة في الجزيرة ، وتدفقت فبرونيكتين في جميع أنحاء الجزيرة. (2) والمصنفة خلايا هيلا في المناطق المحيطة بالجزيرة. (3) وبعد الوصول إلى نقطة التقاء خلايا هيلا وبيوفيلم المتعايشة قد وضعت ، هو عرض EHEC في الجزيرة. (4) رفع الجدار PDMSحتى كشف خلايا هيلا المحيطة بالجزيرة لEHEC. أقحم يوضح تفاصيل عملية صمام. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2a.jpg" alt="الشكل 2A" /> <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2bc.jpg" alt="الرقم 2bc" /> الشكل 2 : نموذج ميكروفلويديك للثقافة مشتركة من الخلايا الظهارية والبكتيريا. (A) ثلاثة الابعاد تسليم الجهاز المشترك الثقافة تبين هوائيا ، دفعتها إلى مناطق محاصرة لتشكيل الجزر البكتيرية بين الخلايا الظهارية. كل جزيرة الجرثومية (1200 و 1000 قطرها ميكرون وبصرف النظر ميكرومتر) يحتوي على مدخل ومخرج منفصل لتوفير وسائط النمو وإزالة المخلفات من الجزيرة. (ب) صورة مجهرية من الجهاز المشترك مع ثقافة الأصباغ الملونة التي تبين مناطق مختلفة (طلائي منطقة الخلية ، والجزر الجرثومي). (C) ويظهر الإخلاص للنظام هوائي محاصرة من خلال خفض الجدار PDMS (اللوحة اليسرى) باستخدام قناة تنشيط هوائيا (الأزرق) ، وإدخال الصباغ الأرجواني في الجزر جزيرة مغلقة ، وتتدفق الصبغة الصفراء حولها لمدة 48 ساعة. عندما يتم رفع الجدار PDMS (اللوحة اليمنى) ، يتعرض للمنطقة الجزيرة لصبغ أصفر المحيطة بها. شريط النطاق يمثل 500 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3 : الرئيسان ثقافة خلايا هيلا والبكتيريا. (أ) صورة من الإسفار RFP - معربا عن EHEC وGFP - معربا عن E. القولونية BW25113 في الجزيرة. (ب) التي تنتقل من تراكب ، أخضر ، أحمر والصور مضان في الجهاز. شريط النطاق تمثل 200 ميكرون.

<ol>
	<li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly(dimethylsiloxane)+using+solid-object+printing.">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li><li>Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+integrated+passive+valves+and+pumps+for+flexible+polymer+3-dimensional+microfluidic+systems.">Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems.</a> Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).</li><li>Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumatically+controllable+flexible+and+polymeric+microfluidic+valve+fabricated+via+in+situ+development.">A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development.</a> J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).</li><li>Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+multiplexed+control+of+latching+pneumatic+valves+using+microfluidic+logical+structures.">Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures.</a> Lab Chip. 6, 623-631 (2006).</li><li>Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indole+is+an+inter-species+biofilm+signal+mediated+by+SdiA.">Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA.</a> BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).</li><li>Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+with+tunable+topographies.">Microfluidic devices with tunable topographies.</a> Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).</li><li>Hui, E. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+control+of+cell-cell+interactions.">Micromechanical control of cell-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5722-5726 (2007).</li><li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+sensing+hydrogel+microstructures+into+micropatterned+hepatocellular+cocultures.">Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures.</a> Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).</li><li>Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+epithelial+cells+and+bacteria+for+investigating+host-pathogen+interactions.">Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions.</a> Lab-on-Chip. , (2009).</li></ol>

المقايسات التقليدية للمرفق الممرض والاستعمار الاستفادة من أحادي الطبقة من الخلايا حقيقية النواة في لوحات زراعة الأنسجة التي تضاف إلى مسببات الأمراض. هذه النماذج ليست ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لأنها لا تشتمل على البكتيريا المتعايشة بيوفيلم المتقدمة على خلايا ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SU-8 2050</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microchem Corp, MA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fineline-Imaging Inc, CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>77279</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning, WI</td>
<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>SH30002.02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Programmable spin coater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Laurell Tech Corp</td>
<td>WS0650S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mask aligner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Neutronix-Quintel, PA</td>
<td>Q4000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oxygen plasma etcher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>March Plasma System, CA</td>
<td>CS-1701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus, MA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L-3224</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microfluidic co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating soluble signal-mediated interactions

الإنسان الجهاز الهضمي (غي) المسالك هي بيئة فريدة من نوعها في الخلايا الظهارية التي المعوية وغير الممرضة - (المتعايشة) البكتيريا تتعايش. وقد اقترح أن المكروية أن واجه الممرض في طبقة المتعايشة مهم في تحديد مدى الاستعمار. الثقافة ليست الأساليب الحالية لتحقيق الاستعمار الممرض مناسب تماما عن التحقيق في هذه الفرضية لأنها لا تشارك في تمكين الثقافة من البكتيريا والخلايا الظهارية في بأسلوب يحاكي المكروية الجهاز الهضمي. نحن هنا وصف ميكروفلويديك شارك في ثقافة نموذج تمكن ثقافة مستقلة من الخلايا حقيقية النواة والبكتيريا ، واختبار تأثير الاستعمار المكروية المتعايشة على الممرض. ويتجلى النموذج المشترك من خلال تطوير ثقافة المتعايشة<em&gt; القولونية</em&gt; بيوفيلم بين خلايا هيلا ، تليها مقدمة من enterohemorrhagic<em&gt; E. القولونية</em&gt; (EHEC) في جزيرة المتعايشة ، في تسلسل الذي يحاكي تسلسل الأحداث في عدوى الجهاز الهضمي.

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions at JoVE.com

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

يصف هذا البروتوكول ميكروفلويديك شارك في ثقافة نموذج للثقافة في وقت واحد ومترجم من الخلايا الظهارية والبكتيريا. ويمكن استخدام هذا النموذج للتحقيق في دور الاشارات الجزيئية للذوبان في مختلف المرضية فضلا عن الشاشة فعالية من السلالات البكتيرية بروبيوتيك المفترضة.

ميكروفلويديك المشارك ثقافة الخلايا الظهارية والبكتيريا للتحقيق في ذوبان الإشارات بوساطة التفاعلات

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

microfluidic-co-culture-epithelial-cells-bacteria-for-investigating

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  Texas A&M University. يصف هذا البروتوكول ميكروفلويديك شارك في ثقافة نموذج للثقافة في وقت واحد ومترجم من الخلايا الظهارية والبكتيريا. ويمكن استخدام هذا النموذج للتحقيق في دور الاشارات الجزيئية للذوبان في مختلف المرضية فضلا عن الشاشة فعالية من السلالات البكتيرية بروبيوتيك المفترضة....

Video: Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

حجرة متعددة الخلية العصبية الجهاز العصبي المركزي ، الدبقية منهاج ميكروفلويديك المشارك الثقافة

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

عزل الخلايا الظهارية الثديية من ثلاثي الأبعاد الخلايا المختلطة الجسم الشبه الكروي ثقافة المشارك

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

الطريقة Cryosectioning لتسليخ مجهري الفئران القولون الغشاء المخاطي

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

استخدام أجهزة ميكروفلويديك لقياس عمر والخلوية الظواهر في خلايا الخميرة في مهدها واحدة

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

الرصد في الموقع للجمعيات النكّيّازة الجزيئية المشكلة بشكل عابر في البكتيريا والخميرة والخلايا البشرية

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II cells and two types of immune cells (i.e., human monocyte-derived macrophages [MDMs] and dendritic cells [MDDCs]). A protocol for assembling the multicellular model is provided. Alveolar epithelial cells (A549 cell line) are grown and differentiated under submerged conditions on permeable inserts in two-chamber wells, then combined with differentiated MDMs and MDDCs. Finally, the cells are exposed to an air-liquid interface for several days. As human primary immune cells need to be isolated from human buffy coats, immune cells differentiated from either fresh or thawed monocytes are compared in order to tailor the method based on experimental needs. The three-dimensional models, composed of alveolar cells with either freshly isolated or thawed monocyte-derived immune cells, show a statistically significant increase in cytokine (interleukins 6 and 8) release upon exposure to proinflammatory stimuli (lipopolysaccharide and tumor necrosis factor &#945;) compared to untreated cells. On the other hand, there is no statistically significant difference between the cytokine release observed in the cocultures. This shows that the presented model is responsive to proinflammatory stimuli in the presence of MDMs and MDDCs differentiated from fresh or thawed peripheral blood monocytes (PBMs). Thus, it is a powerful tool for investigations of acute biological response to different substances, including aerosolized drugs or nanomaterials.

Presented here is a protocol for primary human blood monocyte isolation as well as their differentiation into macrophages and dendritic cells and assembly with epithelial cells into a multicellular human lung model. Biological responses of cocultures composed of immune cells differentiated from either freshly isolated or thawed monocytes, upon exposure to proinflammatory stimuli, are compared.

نموذج القُزلة السنخية البشرية متعددة الخلايا يتكون من الخلايا الظهارية والخلايا المناعية الأولية لتقييم المخاطر

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...