עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הקרן הלאומית למדע (CBET 0846453) לבין המכון הלאומי לבריאות (1R01GM089999).

1. המצאה של אדונים סיליקון באמצעות photolithography סטנדרטי SU-8 1 (לא רואים בסרט הזה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תקן SU-8 שיטות photolithography ליצור SU-8 &quot;אדונים&quot; (SU-8 2050, MicroChem, ניוטון, MA) בודה המרכיבים השונים (ממברנות PDMS של עובי שונות, שיתוף תרבות קאמרית) ב cleanroom. תבניות הורים כאלה יכולים להיות מפוברק בכל מתקן microfabrication (למשל, סטנפורד מיקרופלואידיקה יציקה; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שכפול PDMS, לחשוף את SU-8 אדונים לאדים fluorosilane בתוך תא ייבוש המחובר למקור ואקום כדי להקל על שחרור קל של PDMS מן האדון. הוסף ירידה של fluorosilane על מגבת נייר וליישם ואקום דקות אחד. הסר את האבק ולאפשר 30 דקות עבור בתצהיר של fluorosilane. שמור את המאסטר SU-8 בכלי סגור לשימוש עתידי. </li></ol> 2. Replica דפוס של PDMS מ SU-8 מאסטר 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השכבה fluidic ואת השכבה מלאה מיוצרים על ידי דפוס העתק של PDMS ממורה SU-8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את PDMS מראש פולימר צולבות מקשר ב wt 10:01. יחס דגה בתוך תא ייבוש עבור 1hour (או עד בועות אוויר יוסרו מן התערובת PDMS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המאסטר SU-8 בצלחת פטרי ובזהירות לשפוך את התערובת PDMS על גבי יחידת SU-8. דגה PDMS שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין את התבנית על 1200 סל&quot;ד במשך דקה אחת כדי לקבל עובי אחיד PDMS של כ 100μm על התבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את צלחת פטרי שמכילה את PDMS ואת SU-8 עובש אמן 80 ° C למשך שעה אחת כדי לרפא את PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את נרפא PDMS מכוסה SU-8 המאסטר של הכיריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל עובש PDMS ממורה SU-8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקדחה ארבעה חורים עובש PDMS באמצעות 20 הבוטה סוף מחט מד לשני פתחי הכניסה חיידקים, אחד לשקע אחד יציאת פנאומטי. </li></ol> 3. Bonding של Multilayer PDMS מכשירים: מכשיר זה מורכב עם שלוש שכבות, השכבה העליונה אשר מכיל את הערוץ העיקרי, שכבה פנאומטי הביניים, שכבת חיידקים התחתונה המכילה את הערוצים עבור חיידקים. שלוש שכבות מורכבים כמתואר להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את ממברנות PDMS עם מתנול בזהירות לקלף אותם SU 8-עובש שלהם לשלוט באמצעות מלקחיים נקיות. המקום קרום על גיליון טפלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרום פנאומטי ואת השכבה fluidic על תא פלזמה חמצן. הפעל פלזמה במשך 40 שניות (לחץ חמצן 10 SCCM, RF כוח 100W). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החשיפה פלזמה, ליישר (תוך 10 דקות) הממברנה על התחתונה PDMS הערוץ באמצעות מלקחיים. הוספת מתנול על הממברנה ואת שכבות PDMS עוזר תנועה חופשית של השכבות, ואינה יישור קל. במקרה זה, המכשיר ממוקם על פיסת גזה כדי לאפשר לאדים מתנול לברוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cure PDMS שכבות מיושר על פלטה חמה על 80 מעלות צלזיוס למשך 8 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מליטה את הממברנה פנאומטי על השכבה התחתונה, חזור על שלבים 3.2-3.4 לקשר את הערוץ על גבי המכשיר התאספו PDMS מרוכבים. </li></ol> 4. הרכבת המכשיר PDMS 3,4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חורים הנמלים מפרצון ו לשקע המשמש זריעת התאים האיקריוטים וחיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור צינורות Tygon (0.01 אינץ&#39; OD) ליציאות ולהפעיל את השכבה פנאומטי ידי משיכת עם מזרק 20mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מודל PDMS ו שקופיות הזכוכית טרום ניקה לתוך תא פלזמה חמצן. הפעל פלזמה עבור מבלי להחיל את הוואקום 20 שניות (לחץ חמצן 20 SCCM, RF כוח 300W). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת למנוע מגע בין הקיר מליטה (PDMS) באי לשקופית זכוכית, מיד לחבר מזרק למכשיר וליישם ואקום ידי משיכת מזרק מחזיק אותו במקומו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ בעדינות את המודל PDMS על גבי הזכוכית (תוך 2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא את המכשיר PDMS ב 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li></ol> 5. טיפול משטח זכוכית עם פיברונקטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר המכשיר תחת UV למשך 15 דקות לאחר חיבור צינור ליציאת כל Tygon. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי זרימת PBS מעוקרים לתוך התעלה כדי להסיר כל פסולת בערוץ. החל לזרום במשך 10 דקות כדי להסיר בועות אוויר. בועות האוויר יכול בקלות לחמוק PDMS בגלל חדירות הגז שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מלא צבע צבע לתוך התעלה פנאומטי כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקל על זריעת תאים אוקריוטים על הזכוכית, להכניס 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פתרון של פיברונקטין לתוך המכשיר דגירה של 40 דקות בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את פיברונקטין עודף עם 1 מ&quot;ל של התקשורת הצמיחה. </li></ol> 6. גיבוש ומדידה של commensal E. coli biofilm בהאיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את החיידקים commensal (למשל, החיידק BW25113/pCM18) בכלי התקשורת M9 מינימלית OD 600 ~ 1 לגיבוש biofilm commensal בתאי / איים סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את חומת האי על ידי יישום חיובי נוזל בלחץ. ממיר ביתי האוויר אל נוזל בלחץ משמש כדי למנוע היווצרות בועת אוויר בערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את ה commensal coli אל האיים עם שסתום סגור, מאפשרים לחיידקים לצרף במשך שעה 1 ב 32 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החיידקים פנויות ו perfuse השעיה חיידקי לדלל (OD 600 ~ 0.05) בשעה 0.25mL/hr למשך 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את biofilm עם טרי התקשורת DMEM צמיחה להסיר חיידקים רופף המצורפת ולהתכונן מצורף תא האיקריוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה biofilm באמצעות TCS Leica SP5 Confocal מיקרוסקופ לייזר סורק (Bannockburn, אילינוי), ולדמיין את הארכיטקטורה biofilm באמצעות תוכנת IMARIS 5. </li></ol> 7. מתזמן התאים האיקריוטים סביב האיים חיידקי 6-8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים הלה מן הבקבוק רקמה תרבות resuspend ב DMEM מדיה צפיפות זריעה של 5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו את התאים הלה לתוך המכשיר בקצב הזרימה של 2 מ&quot;ל / דקה באמצעות משאבת מזרק Picoplus (הרווארד Apparattus, MA). ודא קיר האי הוא הוריד כך biofilm חיידקי נפרד מאזור תא הלה. צעד זה צריך להתבצע על הבמה של מיקרוסקופ אור כך אחידות זריעת ניתן לקבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד ששקע התא כדי לצמצם את תנועת ההשעיה תא הערוץ דגירה של 6 שעות ב 37 מעלות של 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse את המכשיר עם מדיום גידול של 0.5 מ&quot;ל / שעה כדי להסיר תאים פנויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן התקשורת DMEM עבור הלה commensal E. coli כל 6 שעות. </li></ol> 8. מבוא של חיידקים פתוגניים לתוך האי וחשיפה התאים האיקריוטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן E. coli O157: H7 (EHEC) להדביק תאים הלה על ריבוי של זיהום (moi) של 100:1 200:1 (מספר EHEC לכל תא הלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף לשטוף את החיידקים commensal רופף המצורפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו את ההשעיה EHEC לדלל (OD 600 ~ 0.1) לתוך האיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המכשיר 37 מעלות של 5% CO 2 באינקובטור במשך 6 שעות ללא זרימה לאפשר EHEC להיחשף אותות נוכח biofilm commensal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את הקיר PDMS לחשוף EHEC באיים commensal לתאי הלה במשך 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הערוץ עם PBS ואת כתם על תאים חיים ומתים באמצעות ערכת Live / Dead (L3224, Invitrogen, CA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקומות מרובים על תמונה מיקרוסקופ פלואורסצנטי Axiovert 200 מיליון Zeiss ולהעריך את מספר התאים מת לחיות. </li></ol> 9. נציג תוצאות 9 רצף של אירועים זיהומים בדרכי העיכול היה חיקה ידי פיתוח monolayer של תאים הלה ו E. commensal coli biofilm וחשיפת EHEC כדי biofilm commensal לפני ההדבקה של תאים הלה. הצעדים מעורב בזיוף של מודל שיתוף תרבות microfluidic מוצגים באיור 1. 2A איור מראה טיוח 3 מימדי של המכשיר שיתוף התרבות. שני אזורים במכשיר שיתוף התרבות הקאמרית תרבית תאים אוקריוטים והאי חיידקי מוצגים 2B איור עם צבעים צבע שונה (סגול האזורים אוקריוטים וירוק עבור האי חיידקי). היתכנות של לבודד את האזורים התרבות חיידקים מאזור אוקריוטים שמסביב מוצג באיור 2C באמצעות צבעים צבע. איור 3 מציג תוצאות נציג מן התרבות המשותפת של תאים וחיידקים אפיתל. 3A איור מראה קולוניזציה של biofilm commensal (ירוק) על ידי אי EHEC (אדום). איור 3 ב מציג את הסמיכות של תאים אפיתל commensal E. coli עם EHEC באי חיידקי. RFP להביע EHEC וחיידקים GFP commensal להביע מרוכזים באי כאשר קיר PDMS מונמך, הממחישות את הכדאיות של בידוד חיידקי אי מתאי אפיתל. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: זריעת Cell תכנית במודל שיתוף התרבות. (1) הקיר PDMS הוא הוריד כדי ליצור אי, חיידקים commensal מוכנסים האי, פיברונקטין הוא זורם ברחבי האי. (2) תאים הלה הם זורעים באזורים המקיפים את האי. (3) אחרי תאים הלה להגיע למפגש ואת biofilm commensal פיתחה, EHEC מוחדר האי. (4) הקיר PDMS היא הרימהעד לחשיפת תאים הלה סביב האי EHEC. הבלעה מראה פרטי פעולת השסתום. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2a.jpg" alt="איור 2a" /> <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2bc.jpg" alt="איור 2bc" /> איור 2: מודל Microfluidic לתרבות משותפת של תאים וחיידקים אפיתל. (א) תלת ממדי הביצוע של המכשיר שיתוף התרבות מראה פניאומטית, ומונעת אזורים השמנה לגיבוש בין האיים חיידקי לתאי האפיתל. כל האי חיידקי (1200 בקוטר מיקרומטר ו 1000 מיקרומטר בנפרד) יש שקע כניסת נפרדת למתן התקשורת צמיחה הסרת פסולת מן האי. (ב) מיקרוסקופ של המכשיר שיתוף התרבות עם צבעים צבע מראה את האזורים השונים (אזור תא אפיתל, איים חיידקי). (ג) אמינות של מערכת השמנה פנאומטי מוצג על ידי הורדת קיר PDMS (פאנל משמאל) באמצעות ערוץ פניאומטית המופעל (כחול), מציגה צבע סגול לתוך האיים האי סגור, וזורם צבען צהוב סביב זה 48 ח כאשר קיר PDMS עולה (פאנל מימין), באזור האי חשוף צבען הצהוב שמסביב. בר סולם מייצג 500 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3: עמית התרבות של תאים הלה וחיידקים. (א) תמונה פלואורסצנטי של RFP-לבטא EHEC ו-GFP להביע E. coli BW25113 באי. (ב) כיסוי של המועבר, ירוק, אדום ותמונות הקרינה במכשיר. בר סולם מייצג 200 מיקרומטר.

<ol>
	<li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly(dimethylsiloxane)+using+solid-object+printing.">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li><li>Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+integrated+passive+valves+and+pumps+for+flexible+polymer+3-dimensional+microfluidic+systems.">Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems.</a> Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).</li><li>Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumatically+controllable+flexible+and+polymeric+microfluidic+valve+fabricated+via+in+situ+development.">A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development.</a> J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).</li><li>Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+multiplexed+control+of+latching+pneumatic+valves+using+microfluidic+logical+structures.">Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures.</a> Lab Chip. 6, 623-631 (2006).</li><li>Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indole+is+an+inter-species+biofilm+signal+mediated+by+SdiA.">Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA.</a> BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).</li><li>Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+with+tunable+topographies.">Microfluidic devices with tunable topographies.</a> Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).</li><li>Hui, E. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+control+of+cell-cell+interactions.">Micromechanical control of cell-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5722-5726 (2007).</li><li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+sensing+hydrogel+microstructures+into+micropatterned+hepatocellular+cocultures.">Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures.</a> Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).</li><li>Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+epithelial+cells+and+bacteria+for+investigating+host-pathogen+interactions.">Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions.</a> Lab-on-Chip. , (2009).</li></ol>

מבחני קונבנציונלי עבור התקשרות קולוניזציה הפתוגן ולנצל monolayer של התאים האיקריוטים בצלחות בתרבית רקמה שאליו מתווספים פתוגנים. מודלים אלה אינם רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הם לא לשלב biofilm חיידקי commensal שפותחה על התאים האיקריוטים. בנוסף פשוטים של תרבות טרום גדל חיידקים ה...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SU-8 2050</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microchem Corp, MA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fineline-Imaging Inc, CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>77279</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning, WI</td>
<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>SH30002.02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Programmable spin coater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Laurell Tech Corp</td>
<td>WS0650S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mask aligner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Neutronix-Quintel, PA</td>
<td>Q4000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oxygen plasma etcher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>March Plasma System, CA</td>
<td>CS-1701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus, MA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L-3224</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microfluidic co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating soluble signal-mediated interactions

האדם במערכת העיכול (GI) בדרכי היא סביבה ייחודית שבה תאים אפיתל מעיים פתוגניים שאינם (commensal) החיידקים להתקיים. הוצע כי microenvironment כי הפתוגן נתקל בשכבה commensal חשוב בקביעת מידת קולוניזציה. שיטות התרבות נוכחי לחקירת קולוניזציה הפתוגן לא מתאימים היטב לחקירת השערה זו כאשר הם אינם מאפשרים שיתוף התרבות של חיידקים ותאי אפיתל באופן המחקה את microenvironment מערכת העיכול. כאן אנו מתארים את מודל שיתוף microfluidic תרבות שמאפשרת תרבות עצמאית של תאים וחיידקים אוקריוטים, ובדיקת ההשפעה של microenvironment commensal על קולוניזציה הפתוגן. מודל שיתוף התרבות באה לידי ביטוי בפיתוח commensal<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Biofilm בין תאים הלה, ואחריו הכנסת enterohemorrhagic<em&gt; א coli</em&gt; (EHEC) לתוך האי commensal, ברצף המחקה את רצף האירועים על דלקת בדרכי העיכול.

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions at JoVE.com

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

פרוטוקול זה מתאר מודל microfluidic שיתוף תרבות לתרבות סימולטני מקומי של תאים וחיידקים אפיתל. מודל זה יכול לשמש חוקר את תפקידם של אותות מולקולריים שונים מסיסים על הפתוגנזה, כמו גם מסך האפקטיביות של זני חיידקים פרוביוטיים המשוערת.

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

microfluidic-co-culture-epithelial-cells-bacteria-for-investigating

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  Texas A&M University. פרוטוקול זה מתאר מודל microfluidic שיתוף תרבות לתרבות סימולטני מקומי של תאים וחיידקים אפיתל. מודל זה יכול לשמש חוקר את תפקידם של אותות מולקולריים שונים מסיסים על הפתוגנזה, כמו גם מסך האפקטיביות של זני חיידקים פרוביוטיים המשוערת.

Video: Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Cryosectioning שיטה לMicrodissection של Murine גס רירית

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II cells and two types of immune cells (i.e., human monocyte-derived macrophages [MDMs] and dendritic cells [MDDCs]). A protocol for assembling the multicellular model is provided. Alveolar epithelial cells (A549 cell line) are grown and differentiated under submerged conditions on permeable inserts in two-chamber wells, then combined with differentiated MDMs and MDDCs. Finally, the cells are exposed to an air-liquid interface for several days. As human primary immune cells need to be isolated from human buffy coats, immune cells differentiated from either fresh or thawed monocytes are compared in order to tailor the method based on experimental needs. The three-dimensional models, composed of alveolar cells with either freshly isolated or thawed monocyte-derived immune cells, show a statistically significant increase in cytokine (interleukins 6 and 8) release upon exposure to proinflammatory stimuli (lipopolysaccharide and tumor necrosis factor &#945;) compared to untreated cells. On the other hand, there is no statistically significant difference between the cytokine release observed in the cocultures. This shows that the presented model is responsive to proinflammatory stimuli in the presence of MDMs and MDDCs differentiated from fresh or thawed peripheral blood monocytes (PBMs). Thus, it is a powerful tool for investigations of acute biological response to different substances, including aerosolized drugs or nanomaterials.

Presented here is a protocol for primary human blood monocyte isolation as well as their differentiation into macrophages and dendritic cells and assembly with epithelial cells into a multicellular human lung model. Biological responses of cocultures composed of immune cells differentiated from either freshly isolated or thawed monocytes, upon exposure to proinflammatory stimuli, are compared.

מודל אדם רב-תאי המורכב מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון העיקריים להערכת סיכונים

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...