نحن مدينون بشدة لجوناثان هوارد ، الذي وضعت مجموعة بروتوكول الأساسية للمقايسة حركية مزلق التي تم تكييفها لاحقا من قبلنا. مع التقدير والإمتنان الدعم المالي من جبهة الخلاص الوطني منحة DMR0645023.

1). المخازن والكواشف وينبغي إعداد هذه الحلول في وقت مبكر وتخزينها في aliquots الحجم مريح. يجب على قسامة تحتوي حلا كافيا لإجراء تجربة نموذجية وقسامة جديدة يجب أن تستخدم لفحص كل حركية. وأشار أيضا إلى ظروف التخزين والأحجام قسامة نموذجية في البروتوكولات التالية. 1. BRB80 العازلة ، (مواسير 80 ملم ، 1 ملم MgCl 2 ، 1 ملم المقطر منزوع الأيونات في EGTA (د) من الماء ، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 6.9 كوه) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل الأسهم 100 مل حل EGTA M 0.5 في الماء د. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم 2 م. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل الأسهم 100 مل حل MgCl M 1 2 في الماء د. الأوتوكلاف الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 24.2 غرام من أنابيب و 3.1 غ من الكريات KOH في حوالي 800 مليلتر من الماء ويحرك د حل. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.9 باستخدام 1 حل KOH M. إضافة 2 مل من محلول المخزون 0.5 متر وEGTA 1 مل من محلول 1 MgCl M الأسهم 2. إظهار حجم إلى 1000 مليلتر من الماء د. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة إلى 50 مل أنابيب الصقر وتجميد -20 درجة مئوية في لاستخدامها في المستقبل. ويمكن تخزين أنبوب BRB80 المستخدمة حاليا في 4 درجات مئوية أو في درجة حرارة الغرفة. </li></ul> 2. كلوريد المغنيسيوم ، MgCl 2 (100 مم في الماء د) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المخفف في الماء د لتحقيق تركيز النهائي من 100 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (10 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل </li></ul> 3. غوانوزين - 5&#39; - ثلاثي الفوسفات ، ملح الصوديوم ، GTP (25 ملم في المياه د ، ودرجة الحموضة تعديلها ل7 من هيدروكسيد الصوديوم) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن بها وتذوب في الماء د وضبط درجة الحموضة إلى 7 محلول هيدروكسيد الصوديوم بنسبة 2 م. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من تركيز الأشعة فوق البنفسجية من خلال قياس الامتصاصية في 260 نانومتر. (استخدام معامل الانقراض 11.7 × 103 سم -1 م -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (10 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 4. ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، DMSO <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (10 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 5. التاكسول (1 ملم في DMSO) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن بها وتذوب في DMSO تحت غطاء الدخان لتحقيق تركيز النهائي من 1 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 6. D - (+) ، الجلوكوز ، (2 م في الماء د) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن بها وتذوب في الماء د لتحقيق تركيز النهائي من 2 م. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 7. أوكسيديز الجلوكوز ، (2 ملغ / مل في BRB80) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب في BRB80 لتحقيق تركيز النهائي من 2 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 8. Dithiothreitol ، DTT (1 م في الماء د) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب في الماء د الدخان تحت غطاء محرك السيارة لتحقيق تركيز النهائي من 1 م. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 9. الكاتلاز ، (0.8 ملغ / مل في BRB80) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب في BRB80 لا يقل عن 2 في مراحل لتحقيق تركيز النهائي من 0.8 ملغ / مل. تحديد تركيز في كل مرحلة من خلال قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 276 نانومتر و 406 نانومتر (استخدام معامل الانقراض من 3.1 × 10 5 سم -1 م -1 عند 276 نانومتر و 2.2 × 10 5 م -1 -1 سم إلى 406 نانومتر ، و المعادلة A CL =). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 10. الأدينوزين ثلاثي الفوسفات ، 5&#39; - ، ATP (100 ملم في MgCl 100mM 2) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل سهم MgCl 100 مم 2 في الماء د. تزن من مسحوق جاف ، وتذوب في حل هذه الأسهم لتحقيق التركيز النهائي لل100mM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من تركيز الأشعة فوق البنفسجية من خلال قياس الامتصاصية في 260 نانومتر. (استخدام معامل انقراض 15،4 × 10 سم 3 -1 م -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (20 حجم ميكرولتر) إلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 11. الكازين الحل (20 ملغ / مل في BRB80 الكازين) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ما يقرب من 3 إلى 30 الكازين ز د مل ماء في أنبوب 50 مل الصقر. الدوامة لحوالي 1 ساعة حتى حل تطور الاتساق سميكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في حوالي 15000 ز لمدة 30 دقيقة. تصفية طاف خلال 0.5 و 0.2 ميكرومتر مرشحات حقنة ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز طاف من خلال قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر (استخدام معامل انقراض 0.67 مل الطول -1 ملغ -1). تمييع ل20 ملغ / مل في BRB80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة (20 حجم ميكرولتر) فيإلى 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. </li></ul> 2) حلول قياسي وتعد هذه في يوم من التجربة ، وينبغي التخلص منها بعد هذه التجربة قد انتهت. إعداد 1 مل من كل منهما. 1. BRB80CS0.5 <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكازين تمييع الحل في BRB80 إلى تركيز النهائي من 0.5 ملغ / مل وتخزينها على الجليد. يتم تقديم هذا الحل في الخلية قبل تدفق kinesin ويساعد على الاحتفاظ النشاط kinesin بعد الامتزاز السطح. </li></ul> 2. BRB80CA <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد 0،2 ملغ / مل الكازين و 1 ملم في بطولة BRB80 وتخزينها على الجليد. غير المخفف مزيد Kinesin باستخدام هذا الحل قبل إدخالها في الخلية التدفق. </li></ul> 3. BRB80T <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحل التاكسول في BRB80 إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. ويستخدم هذا الحل لتحقيق الاستقرار في ميكروتثبول. </li></ul> 4. BRB80CT <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 ميكرومتر التاكسول و 0.2 ملغ / مل الكازين في BRB80 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. ويستخدم هذا لإعداد المزيد من antifade أنيبيب والحلول. </li></ul> 5. BRB80AF <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 20 ملي D - غلوكوز ، 20 أوكسيديز الجلوكوز ميكروغرام / مل ، و 8 ميكروغرام / مل الكاتلاز ، 10 DTT ملم ، و 20 ميكرومتر في بطولة BRB80CT وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. ويستخدم هذا الحل لتخفيف streptavidin وnanospheres و &quot;غسل الى&quot; streptavidin الزائدة في الخلية التدفق. يمكن التحكم في سرعة kinesin عن طريق ضبط تركيز ATP في هذا الحل. </li></ul> 3) إعداد Kinesin <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعبير عن kinesin بناء يتألف من النمط البري ، وسلسلة ذبابة الفاكهة كامل طول kinesin melanogaster الثقيلة وصاحب محطة C - - العلامة في القولونية وتنقية باستخدام عمود ني NTA كما هو موضح في 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل aliquots (10 ميكرولتر لكل منهما) في 0.5 مل من الأنابيب وتخزين microcentrifuge في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. تركيز kinesin النشطة في هذه aliquots ما يقرب من 200 نانومتر. 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن تجربة نموذجية ، تمييع الحل kinesin 20 أضعاف في BRB80CA. تسمية KIN20 حل وتخزين أكثر من الثلج. </li></ul> 4) إعداد أنيبيب <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب مل microcentrifuge 0.5 ، إعداد 25 ميكرولتر من محلول النمو : 4 مم MgCl 2 ، 1 ملم وGTP DMSO 5 ٪ (V / V) في BRB80 العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 6.25 ميكرولتر من حل لهذه قسامة ميكروغرام 20 من تويولين biotinylated مجفف بالتجميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدوامة ، ثم ضع في حمام الحرارة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتبلمر. تمييع 100 أضعاف في دوامة BRB80T وبلطف. تسمية MT100 الحل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل التخفيف من 10 أضعاف في MT100 BRB80AF. تسمية MT1000 الحل. </li></ul> 5) وStreptavidin Nanosphere الحل إعداد AlexaFluor568 المسمى streptavidin بتركيز 100 نانومتر في BRB80AF. تسميته STV100 وتخزينها على الجليد. وبالمثل ، تمييع nanospheres 5000 أضعاف في حل BRB80AF. تسميته NS5000 وتخزينها على الجليد. 6) البناء تدفق الخلية بناء flowcell coverslips باستخدام الزجاج اثنين مفصولة الوجهين الشريط. هذه الخلية تدفق ما يقرب من 2 سم ، 1 سم وارتفاعها 100 ميكرون ، ويبلغ حجمه حوالي 20 ميكرولتر. يتم تقديم الحلول في الخلية التدفق من جانب واحد باستخدام ماصة الاشرار والخروج من جهة أخرى على استعمال ورق الترشيح. 7) الجمعية الفحص مقلوب وهي مغلفة first سطح الزجاج مع الكازين الذي يسمح kinesin للاحتفاظ به وظائف على الامتزاز. بعد كثف kinesin ، يتم عرض ميكروتثبول ، التي تعقد من قبل kinesin. والمغلفة ثم ميكروتثبول مع streptavidin الفلورسنت. بعد الغسيل خارج streptavidin الزائدة ، ويتم تقديمها biotinylated البوليسترين فلوريسئين nanospheres (40 قطرها نانومتر). nanospheres سطح ثابت كثف تتصادم مع ميكروتثبول الانتقال والحصول على تحميلها لهم (الشكل 1). يتم سرد ترتيب تدفق الحلول والوقت المسموح به قبل تطبيق الحل التالي أدناه. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BRB80CS0.5 ، 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> KIN20 ، 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MT1000 ، 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> STV100 ، 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BRB80AF ، 3X </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NS5000 </li></ul> 8) الميكروسكوب تركيب الخلية تدفق على المسرح المجهر على الفور بعد إدخال nanosphere. في هذه التجربة ، وهو الكسوف مضان المجهر TE2000 - U (نيكون ، ميلفيل ، نيويورك) مجهزة هدفا النفط 100X (NA 1.45) ، وهو يستشهد X - 120 مصباح (EXFO ، اونتاريو ، كندا) وEMCCD iXon الكاميرا (ANDOR ، واستخدمت جنوب وندسور ، ط م). واستخدمت عامل تصفية FITC مكعب (# 48001) ، وتصفية TRITC مكعب (# 48002 ، كروما تكنولوجيز ، روكينجهام ، VT) لnanospheres الصورة وrespecti ميكروتثبولvely على السطح السفلي من خلايا التدفق. كانت المرة التعرض 0.2s ، في حين أن الوقت كان 2 بين التعرض ثانية. <img src="/files/ftp_upload/2006/2006fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الرسم التخطيطي للالمكوكات الجزيئية.

<ol>
	<li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science.">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li><li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules.">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li><li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles.">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li><li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins.">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li><li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins.">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li><li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes.">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li><li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes.">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li><li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination.">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li><li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

مع تعديلات طفيفة ، وقد تم هذا البروتوكول يستخدم بنجاح من قبل مجموعة متنوعة من الجماعات لتجميع kinesin - أنيبيب المقايسات الحركية القائمة. ويمكن استبدال 10 ملم في DTT الحل النهائي مع حركية 0.5 ٪ β - المركابتويثانول. وينبغي أن الحلول القياسية (BRB80AF ، وKIN20 MT1000) أكثر من 2 ساعة قديمة ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Adenosine-5&#x2019;-triphosphate (ATP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin tubulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton Inc.</td>
<td>T333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Casein</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-0376</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-9322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-(+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D-8779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-0610</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#x2032;,N&#x2032;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E-4378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F-8766</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guanosine-5&#x2019;-triphosphate (GTP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostic</td>
<td>106399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>63069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paclitaxel (Taxol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#x2032;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>480878</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S11226</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles

وقد تطورت الخلايا الجزيئية ، آلات متطورة ، مثل البروتينات والخيوط السيارات kinesin أنيبيب ، لدعم النقل بين الخلايا النشطة من البضائع. في حين يربط kinesins ذيل المجال لمجموعة متنوعة من البضائع ، رئيس kinesins المجالات الاستفادة من الطاقة الكيميائية المخزونة في جزيئات ATP لخطوة على أنيبيب شعرية. منذ فترة طويلة ، شديدة ميكروتثبول بمثابة مسارات للنقل لمسافات طويلة داخل الخلايا. ويمكن أيضا هذه المحركات وشعيرات أن تستخدم في البيئات الاصطناعية microfabricated كعناصر في المكوكات الجزيئية 1. في تصميم تستخدم بشكل متكرر ، وترسو kinesin المحركات على السطح من خلال المسار ذيولها ، وميكروتثبول functionalized بمثابة شحن تحمل العناصر التي تدفعها هذه المحركات. ويمكن تحميل هذه المكوكات مع البضائع من خلال الاستفادة من الربط بين القوي وانتقائية والبيوتين streptavidin. المكونات الرئيسية (تويولين biotinylated ، streptavidin ، والبضائع biotinylated) متاحة تجاريا. بناء على تجربة حركية مقلوب الكلاسيكية 2 ، هو مفصل في بناء المكوكات الجزيئية هنا. وكثف Kinesin البروتينات السيارات على سطح precoated مع الكازين ، ويتم بلمرة ميكروتثبول من تويولين biotinylated ، انضمت إلى kinesin والمغلفة في وقت لاحق مع streptavidin - رودامين المسمى. المحافظة على التركيز في بطولة تركيز subsaturating لتحقيق سرعة مزلق أنيبيب الأمثل لتحميل البضائع 3. أخيرا ، تضاف biotinylated فلوريسئين المسمى nanospheres والبضائع. Nanospheres نعلق على ميكروتثبول نتيجة اصطدام بين ميكروتثبول مزلق وnanospheres الانضمام إلى السطح. ويمكن بسهولة تعديل البروتوكول لتحميل مجموعة متنوعة من البضائع مثل الحمض النووي biotinylated 4 ، 5 نقاط الكم أو طائفة واسعة من مضادات الأجسام المضادة عبر biotinylated 4-6.

Watch this Scientific Journal Video about Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles at JoVE.com

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

المكوكات الجزيئية التي تتكون من ميكروتثبول functionalized التزلق على سطح التزمت خدمة يمكن kinesin البروتينات السيارات كنظام النقل النانو. هنا ، هو وصف لنظام تجميع المكوك نموذجي.

تحميل البضائع على مكوكات Kinesin بدعم الجزيئية

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

cargo-loading-onto-kinesin-powered-molecular-shuttles

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Views.  University of Florida. المكوكات الجزيئية التي تتكون من ميكروتثبول functionalized التزلق على سطح التزمت خدمة يمكن kinesin البروتينات السيارات كنظام النقل النانو. هنا ، هو وصف لنظام تجميع المكوك نموذجي.

Video: Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace. Most are associated with repetitive, high force hand activities. The mechanisms of cellular and structural damage due to cyclical loading are not well known. The purpose of this video is to present a new system that can simultaneously load four tendons in tissue culture. The video describes the methods of sterile tissue harvest and how the tendons are loaded onto a clamping system that is subsequently immersed into media and maintained at 37&deg;C. One clamp is fixed while the other one is moved with a linear actuator. Tendon tensile force is monitored with a load cell in series with the mobile clamp. The actuators are controlled with a LabView program. The four tendons can be repetitively loaded with different patterns of loading, repetition rate, rate of loading, and duration. Loading can continue for a few minutes to 48 hours. At the end of loading, the tendons are removed and the mid-substance extracted for biochemical analyses. This system allows for the investigation of the effects of loading patterns on gene expression and structural changes in tendon. Ultimately, mechanisms of injury due to overuse can be studies with the findings applied to treatment and prevention.

A new in vitro system for simultaneously loading four tendons in culture is described.

خارج الحي تحميل الميكانيكية للوتر

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

محطات التحميل العصب ذبابة الفاكهة مع مؤشرات الكالسيوم

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within the LTR sequences of the HIV-1 provirus, resulting in the excision and eradication of the provirus from infected human cells. 
We started with Cre, a 38-kDa recombinase, that recognizes a 34-bp double-stranded DNA sequence known as loxP. Because Cre can effectively eliminate genomic sequences, we set out to tailor a recombinase that could remove the sequence between the 5'-LTR and 3'-LTR of an integrated HIV-1 provirus. As a first step we identified sequences within the LTR sites that were similar to loxP and tested for recombination activity. Initially Cre and mutagenized Cre libraries failed to recombine the chosen loxLTR sites of the HIV-1 provirus. As the start of any directed molecular evolution process requires at least residual activity, the original asymmetric loxLTR sequences were split into subsets and tested again for recombination activity. Acting as intermediates, recombination activity was shown with the subsets. Next, recombinase libraries were enriched through reiterative evolution cycles. Subsequently, enriched libraries were shuffled and recombined. The combination of different mutations proved synergistic and recombinases were created that were able to recombine loxLTR1 and loxLTR2. This was evidence that an evolutionary strategy through intermediates can be successful. After a total of 126 evolution cycles individual recombinases were functionally and structurally analyzed. The most active recombinase -- Tre -- had 19 amino acid changes as compared to Cre. Tre recombinase was able to excise the HIV-1 provirus from the genome HIV-1 infected HeLa cells (see "HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase", Hauber J., Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virology and Immunology, Hamburg, Germany). While still in its infancy, directed molecular evolution will allow the creation of custom enzymes that will serve as tools of "molecular surgery" and molecular medicine.

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within the LTR sequences of the HIV-1 provirus, resulting in the excision and eradication of the provirus from infected human cells. While still in its infancy, directed molecular evolution will allow the creation of custom enzymes that will serve as tools of molecular surgery and molecular medicine.

الجزيئية تطور Recombinase تري

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF plates to feeder cell-free Matrigel plates.


This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 2 of 3.

من MEFs إلى 2 Matrigel : hESCs من تقسيم MEFs على Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated.

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 3 of 3.

من MEFs لMatrigel 3 : hESCs من الركض على Matrigel Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

التجمع ، والتحميل ، والمحاذاة لخلية نموذج تحليلي نابذة فائقة السرعة

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

التصوير المباشر من الكالسيوم مع ER-المستهدفة استريز المستحثة صبغ تحميل (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Generating a &quot;Humanized&quot; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

توليد &quot;أنسنة&quot;<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; S2 خط خلية حساسة للالدوائية تثبيط كينيسين-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

تحديد كينيسين-1 الشحنات عن طريق الميكروسكوب الإسفار

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...