Wir sind hoch verschuldet, um Jonathon Howard, dessen Gruppe entwickelte das grundlegende Protokoll für eine gleitende Beweglichkeit Assay, der anschließend von uns angepasst wurde. Finanzielle Unterstützung von NSF gewähren DMR0645023 gedankt.

1). Puffer und Reagenzien Diese Lösungen sollten im Voraus vorbereitet werden und in handliche Portionen. Ein Aliquot sollte genügend Lösung für ein typisches Experiment und ein frisches Aliquot sollte für jede Motilität Assay verwendet werden. Die Lagerbedingungen und die typischen aliquoten Größen sind auch in den folgenden Protokollen erwähnt. 1. BRB80 Puffer (80 mM PIPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA in deionisiertem destilliert (dd) Wasser, pH-Wert eingestellt auf 6,9 von KOH) <ul><li> Überlegen Sie sich einen 100-ml-Stammlösung von 0,5 M EGTA in dd Wasser. Der pH-Wert auf 7,0 mit 2 M NaOH-Lösung. </li><li> Überlegen Sie sich einen 100-ml-Stammlösung von 1 M MgCl 2 in dd Wasser. Autoclave die Lösung. </li><li> Add 24,2 g von Rohren und 3,1 g KOH-Pellets in ca. 800 ml dd Wasser und rühren sich aufzulösen. Der pH-Wert auf 6,9 mit 1 M KOH-Lösung. Add 2 mL 0,5 M EGTA Stammlösung und 1 ml 1 M MgCl 2-Stammlösung. Bringen Sie auf ein Volumen von 1000 ml mit dd Wasser. </li><li> Aliquot in 50 mL Falcon-Röhrchen und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. Die BRB80 Rohr derzeit verwendet werden können bei 4 ° C oder bei Raumtemperatur gelagert werden. </li></ul> 2. Magnesiumchlorid, MgCl 2 (100 mM in dd Wasser) <ul><li> Verdünnen Sie in dd Wasser bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zu erreichen. </li><li> Aliquot (10 l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung </li></ul> 3. Guanosin-5&#39;-Triphosphat, Dinatriumsalz, GTP (25 mM in dd Wasser, pH-Wert auf 7 mit NaOH) <ul><li> Abwiegen und lösen sich in dd Wasser und den pH-Wert auf 7 mit 2 M NaOH-Lösung. </li><li> Überprüfen Sie durch Messung der UV-Absorption bei 260 nm. (Verwenden Sie ein Extinktionskoeffizient von 11,7 x 103 M -1 cm -1). </li><li> Aliquot (10 l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 4. Dimethylsulfoxid, DMSO <ul><li> Aliquot (10 l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 5. Taxol (1 mM in DMSO) <ul><li> Abwiegen und lösen sich in DMSO unter Abzug bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zu erreichen. </li><li> Aliquot (20 &amp;mgr; l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 6. D-(+)-Glucose, (2 M in dd Wasser) <ul><li> Abwiegen und lösen sich in dd Wasser bis zu einer Endkonzentration von 2 M erreicht </li><li> Aliquot (20 &amp;mgr; l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 7. Glucose-Oxidase, (2 mg / mL in BRB80) <ul><li> Man löst in BRB80 bis zu einer Endkonzentration von 2 mg / mL zu erreichen. </li><li> Aliquot (20 &amp;mgr; l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 8. Dithiothreitol, DTT (1 M in dd Wasser) <ul><li> Man löst in dd Wasser unter Abzug bis zu einer Endkonzentration von 1 M. zu erreichen </li><li> Aliquot (20 &amp;mgr; l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 9. Catalase, (0,8 mg / mL in BRB80) <ul><li> Man löst in BRB80 in mindestens 2 Stufen bis zu einer Endkonzentration von 0,8 mg / mL zu erreichen. Bestimmen Sie die Konzentration in jeder Phase durch Messung der UV-Absorption bei 276 nm und 406 nm (Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 3,1 x 10 5 M -1 cm -1 bei 276 nm und 2,2 x 10 5 M -1 cm -1 bei 406 nm und der Gleichung A = cL). </li><li> Aliquot (20 &amp;mgr; l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 10. Adenosin-5&#39;-Triphosphat, ATP (100 mM in 100 mM MgCl 2) <ul><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 100 mM MgCl 2 in dd Wasser. Abwiegen Trockenpulver und lösen sich in dieser Stammlösung zu einer Endkonzentration von 100 mM zu erreichen. </li><li> Überprüfen Sie durch Messung der UV-Absorption bei 260 nm. (Verwenden Sie ein Extinktionskoeffizient von 15,4 x 10 3 M -1 cm -1). </li><li> Aliquot (20 &amp;mgr; l Volumen) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 11. Casein-Lösung (20 mg / ml Casein in BRB80) <ul><li> Fügen Sie etwa 3 g Casein zu 30 mL dd Wasser in einem 50 ml Falcon-Röhrchen. Vortex für ca. 1 Stunde, bis die Lösung entwickelt dicke Konsistenz. </li><li> Zentrifugation bei ca. 15000 g für 30 Minuten. Den Überstand bis 0,5 m und 0,2 &amp;mgr; Spritzenfilter. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration der Überstand durch Messung der UV-Absorption bei 280 nm (Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 0,67 ml mg -1 cm -1). Verdünnen auf 20 mg / mL in BRB80. </li><li> Aliquot (20 &amp;mgr; l Volumen) inbis 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -20 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ul> 2.) Standard-Lösungen Diese basieren auf den Tag des Experiments vorbereitet und sollte verworfen, nachdem das Experiment vorbei ist. Bereiten Sie 1 mL jeder. 1. BRB80CS0.5 <ul><li> Verdünnen Casein-Lösung in BRB80 zu einer endgültigen Konzentration von 0,5 mg / mL und speichert mehr als Eis. Diese Lösung wird in die Messzelle vor Kinesin eingeführt und halten die Kinesin-Aktivität nach Oberflächenadsorption. </li></ul> 2. BRB80CA <ul><li> Bereiten 0,2 mg / ml Casein und 1 mM ATP in BRB80 und speichert mehr als Eis. Kinesin ist weiter verdünnt mit dieser Lösung vor dem Einleiten in die Durchflusszelle. </li></ul> 3. BRB80T <ul><li> Verdünnen Taxollösung in BRB80 bis zu einer Endkonzentration von 10 uM und bei Raumtemperatur lagern. Diese Lösung wird verwendet, um Mikrotubuli zu stabilisieren. </li></ul> 4. BRB80CT <ul><li> Bereiten 10 uM Taxol und 0,2 mg / ml Casein in BRB80 und bei Raumtemperatur lagern. Dies dient der weiteren Vorbereitung der Antifade und Mikrotubuli-Lösungen. </li></ul> 5. BRB80AF <ul><li> Bereiten 20 mM D-Glucose, 20 ug / mL Glucose-Oxidase, 8 pg / mL Katalase, 10 mM DTT und 20 uM ATP in BRB80CT und bei Raumtemperatur lagern. Diese Lösung wird verwendet, um Streptavidin und Nanokügelchen verdünnen und &quot;wash out&quot; das überschüssige Streptavidin in der Durchflusszelle. Die Kinesin-Geschwindigkeit kann durch Anpassung der ATP-Konzentration in dieser Lösung gesteuert werden. </li></ul> 3). Kinesin Vorbereitung <ul><li> Express ein Kinesin-Konstrukt, bestehend aus dem Wildtyp und in voller Länge Drosophila melanogaster Kinesin heavy chain und eine C-terminale His-tag in Escherichia coli und Reinigung mit einem Ni-NTA-Säule wie in 6 beschrieben. </li><li> Machen Aliquots (10 l pro Stück) in 0,5 ml Reaktionsgefäße und bei -80 ° C für eine spätere Verwendung. Die Konzentration der aktiven Kinesin in diesen Aliquots beträgt ca. 200 nM. 7 </li><li> Für ein typisches Experiment, verdünnen das Kinesin-Lösung 20-fach in BRB80CA. Beschriften Sie die Lösung KIN20 und speichert mehr als Eis. </li></ul> 4). Mikrotubuli Vorbereitung <ul><li> In einem 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten 25 ul des Wachstums Lösung: 4 mM MgCl 2, 1 mM GTP und 5% DMSO (v / v) in BRB80 Puffer. </li><li> Add 6,25 ul dieser Lösung zu einem 20 ug Aliquot lyophilisierte biotinylierte Tubulin. </li><li> Vortex, dann in einem Wärmebad bei 37 ° C für 30 Minuten zur Polymerisation. Verdünnen Sie 100-fach in BRB80T und vortexen. Beschriften Sie die Lösung MT100 und bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Machen Sie eine 10-fache Verdünnung von MT100 in BRB80AF. Beschriften Sie die Lösung MT1000. </li></ul> 5). Streptavidin und Nanosphere Lösung Bereiten AlexaFluor568-markiertem Streptavidin in einer Konzentration von 100 nM in BRB80AF. Bezeichne STV100 und speichert mehr als Eis. Auch verdünnter Nanokügelchen 5000 fold in BRB80AF Lösung. Bezeichne NS5000 und speichert mehr als Eis. 6). Flow Cell Construction Konstruieren Sie eine Durchflusszelle mit zwei Deckgläser durch doppelseitiges Klebeband getrennt. Diese Messzelle beträgt ca. 2 cm lang, 1 cm breit und 100 pm hoch und hat ein Volumen von etwa 20 ul. Die Lösungen sind in die Messzelle von einer Seite mit einer Pipette und böse von den anderen mit Filterpapier eingeführt. 7). Inverted Assay Assembly Glass Oberfläche wird zuerst mit Kasein die Kinesin, um seine Funktionalität bei der Adsorption behalten können beschichtet. Nach Kinesin adsorbiert wird, sind Mikrotubuli eingeführt, die von Kinesin statt. Mikrotubuli sind dann mit fluoreszierenden Streptavidin beschichtet. Nach dem Auswaschen der überschüssigen Streptavidin, biotinyliert Polystyrol Fluorescein Nanokügelchen (40 nm Durchmesser) eingeführt. Adsorbiert stationären Nanokügelchen mit dem bewegten Mikrotubuli kollidieren und auf sie (Abbildung 1) geladen werden. Die Reihenfolge der Fluss von Lösungen und die Zeit vor der Einführung der nächsten Lösung erlaubt sind unten aufgeführt. <ul><li> BRB80CS0.5, 5 Minuten </li><li> KIN20, 5 Minuten </li><li> MT1000, 5 Minuten </li><li> STV100, 5 Minuten </li><li> BRB80AF, 3x </li><li> NS5000 </li></ul> 8). Microscopy Montieren Sie die Messzelle auf dem Mikroskoptisch unmittelbar nach Nanokugel Einführung. In diesem Experiment ein Eclipse TE2000-U Fluoreszenzmikroskop (Nikon, Melville, NY) mit einem 100X Öl-Objektiv (NA 1,45), ein X-Cite 120 Lampe (EXFO, Ontario, Kanada) und eine iXon EMCCD Kamera (Andor, ausgestattet South Windsor, CT) verwendet wurde. A FITC-Filter cube (# 48001) und einem TRITC-Filter cube (# 48002, Chroma Technologies, Rockingham, VT) wurden image Nanokügelchen und Mikrotubuli respecti verwendetVely auf der unteren Fläche der Messzellen. Die Belichtungszeit betrug 0,2 s, während die Zeit zwischen den Aufnahmen war 2 s. <img src="/files/ftp_upload/2006/2006fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des molekularen Shuttles.

<ol>
	<li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science.">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li><li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules.">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li><li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles.">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li><li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins.">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li><li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins.">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li><li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes.">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li><li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes.">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li><li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination.">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li><li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li></ol>

Mit geringfügigen Änderungen wurde das Protokoll erfolgreich von einer Vielzahl von Gruppen verwendet werden, um Kinesin-Mikrotubuli-basierte Motilität Assays zu montieren. 10 mM DTT in den letzten Motilität Lösung kann mit 0,5% β-Mercaptoethanol ersetzt werden. Standard-Lösungen (BRB80AF, KIN20 und MT1000) mehr als 2 Stunden alt sollte nicht verwendet werden. Jede Lösung enthält Taxol und insbesondere Mikrotubuli sollte niemals auf Eis gelegt werden. Übermäßige Exposition der Messzelle gegen UV-Anregungslic...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Adenosine-5&#x2019;-triphosphate (ATP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin tubulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton Inc.</td>
<td>T333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Casein</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-0376</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-9322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-(+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D-8779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-0610</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#x2032;,N&#x2032;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E-4378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F-8766</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guanosine-5&#x2019;-triphosphate (GTP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostic</td>
<td>106399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>63069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paclitaxel (Taxol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#x2032;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>480878</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S11226</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles

Zellen verfügen über ausgefeilte molekulare Maschinerie entwickelt, wie Kinesin Motorproteine ​​und Mikrotubuli, zu aktiven intrazellulären Transport von Gütern zu unterstützen. Während Kinesine Schwanz Domäne bindet an eine Vielzahl von Ladungen, nutzen Kinesine Kopfdomänen die chemische Energie in ATP-Molekülen gespeichert, um entlang der Mikrotubuli Gitter Schritt. Die langen, steifen Mikrotubuli dienen als Schienen für den Fernverkehr intrazellulären Transport. Diese Motoren und Filamente können auch in mikrofabrizierten synthetischer Umgebungen als Komponenten der molekularen Shuttles 1 eingesetzt werden. In einer häufig verwendeten Design sind Kinesin-Motoren auf die Fahrbahn durch ihre Schwänze verankert, und funktionalisierte Mikrotubuli dienen als Fracht tragenden Elemente, die von diesen Motoren angetrieben werden. Diese Shuttles können mit Ladung durch die Nutzung der starke und selektive Bindung zwischen Biotin und Streptavidin geladen werden. Die wichtigsten Komponenten (biotinylierten Tubulin, Streptavidin und biotinylierten Ladung) sind kommerziell erhältlich. Aufbauend auf den klassischen invertierten Motilität Test 2 ist der Aufbau von molekularen Shuttles detaillierte hier. Kinesin Motorproteine ​​sind an einer Oberfläche mit Kasein vorbeschichtet adsorbiert; Mikrotubuli sind aus biotinylierten Tubulin polymerisiert, haftete an der Kinesin und anschließend mit Rhodamin-markiertem Streptavidin beschichtet. Die ATP-Konzentration ist bei subsaturating Konzentration aufrechterhalten, um ein Mikrotubulus Gleiten Geschwindigkeit optimal für Beladen 3 zu erreichen. Schließlich biotinylierten fluoresceinmarkierten Nanokügelchen als Fracht aufgenommen. Nanospheres an Mikrotubuli legen als Resultat von Kollisionen zwischen Gleiten Mikrotubuli und Nanokügelchen an der Oberfläche haften. Das Protokoll kann leicht modifiziert werden, um eine Vielzahl von Ladungen wie biotinylierten DNA 4, Quantenpunkte 5 oder eine Vielzahl von Antigenen über biotinylierte Antikörper 4-6 laden.

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Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Molekulare Shuttles, bestehend aus funktionalisierten Mikrotubuli Gleiten auf der Oberfläche haften Kinesin Motorproteine ​​können als nanoskalige Nahverkehr dienen. Hier ist die Montage eines typischen Shuttle-System beschrieben.

Frachtladesysteme auf Kinesin Powered Molekulare Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Aufrufe.  University of Florida. Molekulare Shuttles, bestehend aus funktionalisierten Mikrotubuli Gleiten auf der Oberfläche haften Kinesin Motorproteine ​​können als nanoskalige Nahverkehr dienen. Hier ist die Montage eines typischen Shuttle-System beschrieben.

Serie: Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace. Most are associated with repetitive, high force hand activities. The mechanisms of cellular and structural damage due to cyclical loading are not well known. The purpose of this video is to present a new system that can simultaneously load four tendons in tissue culture. The video describes the methods of sterile tissue harvest and how the tendons are loaded onto a clamping system that is subsequently immersed into media and maintained at 37&deg;C. One clamp is fixed while the other one is moved with a linear actuator. Tendon tensile force is monitored with a load cell in series with the mobile clamp. The actuators are controlled with a LabView program. The four tendons can be repetitively loaded with different patterns of loading, repetition rate, rate of loading, and duration. Loading can continue for a few minutes to 48 hours. At the end of loading, the tendons are removed and the mid-substance extracted for biochemical analyses. This system allows for the investigation of the effects of loading patterns on gene expression and structural changes in tendon. Ultimately, mechanisms of injury due to overuse can be studies with the findings applied to treatment and prevention.

A new in vitro system for simultaneously loading four tendons in culture is described.

Ex vivo mechanische Belastung der Sehnen

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Forschung

Biologie

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

Loading Drosophila Nerve Terminals mit Calcium-Indikatoren

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within the LTR sequences of the HIV-1 provirus, resulting in the excision and eradication of the provirus from infected human cells. 
We started with Cre, a 38-kDa recombinase, that recognizes a 34-bp double-stranded DNA sequence known as loxP. Because Cre can effectively eliminate genomic sequences, we set out to tailor a recombinase that could remove the sequence between the 5'-LTR and 3'-LTR of an integrated HIV-1 provirus. As a first step we identified sequences within the LTR sites that were similar to loxP and tested for recombination activity. Initially Cre and mutagenized Cre libraries failed to recombine the chosen loxLTR sites of the HIV-1 provirus. As the start of any directed molecular evolution process requires at least residual activity, the original asymmetric loxLTR sequences were split into subsets and tested again for recombination activity. Acting as intermediates, recombination activity was shown with the subsets. Next, recombinase libraries were enriched through reiterative evolution cycles. Subsequently, enriched libraries were shuffled and recombined. The combination of different mutations proved synergistic and recombinases were created that were able to recombine loxLTR1 and loxLTR2. This was evidence that an evolutionary strategy through intermediates can be successful. After a total of 126 evolution cycles individual recombinases were functionally and structurally analyzed. The most active recombinase -- Tre -- had 19 amino acid changes as compared to Cre. Tre recombinase was able to excise the HIV-1 provirus from the genome HIV-1 infected HeLa cells (see "HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase", Hauber J., Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virology and Immunology, Hamburg, Germany). While still in its infancy, directed molecular evolution will allow the creation of custom enzymes that will serve as tools of "molecular surgery" and molecular medicine.

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within the LTR sequences of the HIV-1 provirus, resulting in the excision and eradication of the provirus from infected human cells. While still in its infancy, directed molecular evolution will allow the creation of custom enzymes that will serve as tools of molecular surgery and molecular medicine.

Molekulare Evolution der Tre-Rekombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF plates to feeder cell-free Matrigel plates.


This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 2 of 3.

Von MEFs auf Matrigel 2: Splitting hESCs aus MEFs auf Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated.

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 3 of 3.

Von MEFs auf Matrigel 3: Die Passage hESCs von Matrigel auf Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Montage-, Lade-und Alignment einer analytischen Ultrazentrifuge Messkammerdirektanschluss

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Direct Imaging von Calcium ER mit Targeted-Esterase Induzierte Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Generating a &quot;Humanized&quot; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

Erzeugen eines &quot;humanisierte&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2-Zelllinie Sensitive pharmakologische Hemmung der Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Identifikation von Kinesin-1 Cargos Mit Fluoreszenzmikroskopie

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...