Siamo fortemente indebitati a Jonathon Howard, il cui gruppo ha sviluppato il protocollo di base per un test di volo a vela motilità che è stato successivamente adattato da noi. Il sostegno finanziario NSF concedere DMR0645023 Si ringrazia.

1.) Tamponi e reagenti Queste soluzioni dovrebbero essere preparate in anticipo e conservato in aliquote comodamente dimensioni. Una aliquota dovrebbe contenere soluzione sufficiente per un tipico esperimento e una nuova aliquota dovrebbe essere utilizzato per ogni dosaggio motilità. Le condizioni di conservazione e le dimensioni aliquota tipici sono menzionati anche i seguenti protocolli. 1. BRB80 tampone, (80 TUBI mM, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA in deionizzata distillata (gg) l&#39;acqua, pH regolato a 6,9 con KOH) <ul><li> Portare a 100 mL di soluzione madre di 0,5 M EGTA in acqua gg. Regolare il pH a 7,0 con 2 M NaOH. </li><li> Portare a 100 mL di soluzione madre 1 M MgCl 2 in acqua gg. Autoclave la soluzione. </li><li> Aggiungere 24,2 g di TUBI e 3,1 g pellet KOH in circa 800 ml di acqua dd e mescolare per sciogliere. Regolare il pH a 6,9 con 1 M soluzione di KOH. Aggiungere 2 ml di soluzione 0,5 M EGTA magazzino e 1 ml di 1 M MgCl 2 soluzione madre. Portare il volume a 1000 ml con acqua dd. </li><li> Aliquota in 50 mL tubi falco e congelare a -20 ° C per un uso futuro. Il tubo BRB80 attualmente in uso può essere conservato a 4 ° C oa temperatura ambiente. </li></ul> 2. Cloruro di magnesio, MgCl 2 (100 mM in acqua gg) <ul><li> Diluire in acqua dd per ottenere una concentrazione finale di 100 mm. </li><li> Aliquota (10 volumi mL) in provette da 0,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C per un uso futuro </li></ul> 3. Guanosina-5&#39;-trifosfato, sale disodico, GTP (25 mM gg acqua, pH regolato a 7 da NaOH) <ul><li> Pesare e si sciolgono in acqua dd e regolare il pH a 7 per soluzione 2 M di NaOH. </li><li> Verificare la concentrazione di misurare l&#39;assorbanza UV a 260 nm. (Utilizzare un coefficiente di estinzione di 11,7 x 103 M -1 cm -1). </li><li> Aliquota (10 volumi mL) in provette da 0,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C per un uso futuro. </li></ul> 4. Dimetil solfossido, DMSO <ul><li> Aliquota (10 volumi mL) in provette da 0,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C per un uso futuro. </li></ul> 5. Taxol (1 mM in DMSO) <ul><li> Pesare e si dissolvono in DMSO sotto cappa d&#39;aspirazione a raggiungere una concentrazione finale di 1 mm. </li><li> Aliquota (20 volumi mL) in provette da 0,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C per un uso futuro. </li></ul> 6. D-(+)-glucosio, (2 M in acqua gg) <ul><li> Pesare e si sciolgono in acqua dd per ottenere una concentrazione finale di 2 M. </li><li> Aliquota (20 volumi mL) in provette da 0,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C per un uso futuro. </li></ul> 7. Glucosio ossidasi, (2 mg / ml in BRB80) <ul><li> Sciogliere in BRB80 per ottenere una concentrazione finale di 2 mg / ml. </li><li> Aliquota (20 volumi mL) in provette da 0,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C per un uso futuro. </li></ul> 8. Ditiotreitolo, DTT (1 M gg acqua) <ul><li> Sciogliere in acqua gg sotto cappa d&#39;aspirazione a raggiungere una concentrazione finale di 1 M. </li><li> Aliquota (20 volumi mL) in provette da 0,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C per un uso futuro. </li></ul> 9. Catalasi, (0,8 mg / ml in BRB80) <ul><li> Sciogliere in BRB80 in almeno 2 fasi per ottenere una concentrazione finale di 0,8 mg / ml. Determinare la concentrazione in ogni fase di misurare l&#39;assorbanza UV a 276 nm e 406 nm (Utilizzare un coefficiente di estinzione di 3,1 x 10 5 M -1 cm -1 a 276 nm e 2,2 x 10 5 M -1 cm -1 a 406 nm e l&#39;equazione A = cL). </li><li> Aliquota (20 volumi mL) in provette da 0,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C per un uso futuro. </li></ul> 10. Adenosina-5&#39;-trifosfato, ATP (100 mM a 100mM MgCl 2) <ul><li> Preparare una soluzione stock di mM MgCl 100 2 gg in acqua. Pesare polvere secca e si dissolvono in questa soluzione, per ottenere una concentrazione finale di 100 mm. </li><li> Verificare la concentrazione di misurare l&#39;assorbanza UV a 260 nm. (Utilizzare un coefficiente di estinzione di 15,4 x 10 3 M -1 cm -1). </li><li> Aliquota (20 volumi mL) in provette da 0,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C per un uso futuro. </li></ul> 11. Caseina soluzione (20 mg / mL caseina in BRB80) <ul><li> Aggiungere circa 3 g di caseina e 30 ml di acqua gg in un tubo da 50 ml falco. Vortex per circa 1 ora fino a quando la soluzione si sviluppa consistenza densa. </li><li> Centrifugare a 15000 g per circa 30 minuti. Filtrare il surnatante con 0,5 micron e 0,2 micron filtri per siringa. </li><li> Determinare la concentrazione del supernatante di misurare l&#39;assorbanza UV a 280 nm (Utilizzare un coefficiente di estinzione di 0,67 centimetri ml mg -1 -1). Diluirlo a 20 mg / ml in BRB80. </li><li> Aliquota (20 volumi mL) inper tubi da microcentrifuga da 0,5 ml e conservare a -20 ° C per un uso futuro. </li></ul> 2.) Soluzioni standard Questi sono preparati il ​​giorno dell&#39;esperimento e deve essere eliminata dopo l&#39;esperimento è finito. Preparare 1 ml di ciascuna. 1. BRB80CS0.5 <ul><li> Soluzione diluita di caseina in BRB80 ad una concentrazione finale di 0,5 mg / ml e memorizzare sul ghiaccio. Questa soluzione viene introdotto nella cella di flusso prima di chinesina e aiuta a mantenere l&#39;attività dopo chinesina superficie di adsorbimento. </li></ul> 2. BRB80CA <ul><li> Preparare 0,2 mg / ml caseina e 1 mM ATP in BRB80 e memorizzare sul ghiaccio. Chinesina è ulteriormente diluita utilizzando questa soluzione prima introduzione nella cella di flusso. </li></ul> 3. BRB80T <ul><li> Soluzione diluita di taxolo in BRB80 ad una concentrazione finale di 10 mM e conservare a temperatura ambiente. Questa soluzione viene utilizzata per stabilizzare i microtubuli. </li></ul> 4. BRB80CT <ul><li> Preparare 10 taxolo mM e 0,2 mg / ml di caseina in BRB80 e conservare a temperatura ambiente. Questo è utilizzato per preparare ulteriormente il Antifade e soluzioni microtubuli. </li></ul> 5. BRB80AF <ul><li> Preparare 20 mM D-glucosio, 20 mg / ml glucosio ossidasi, 8 mg / mL catalasi, 10 mM DTT, e 20 mM ATP in BRB80CT e conservare a temperatura ambiente. Questa soluzione viene utilizzata per diluire streptavidina e nanosfere e &quot;lavare via&quot; la streptavidina in eccesso nella cella di flusso. La velocità chinesina può essere controllata regolando la concentrazione di ATP in questa soluzione. </li></ul> 3.) Kinesin Preparazione <ul><li> Esprimere una chinesina costruire costituito dalla wild-type, full-length catena Drosophila melanogaster chinesina pesanti e un C-terminale His-tag in Escherichia coli e purificare con un Ni-NTA colonna, come descritto al punto 6. </li><li> Fai aliquote (10 L ciascuno) in tubi da microcentrifuga da 0,5 ml e conservare a -80 ° C per un uso futuro. La concentrazione di chinesina attivi in queste aliquote è di circa 200 nM 7. </li><li> Per un tipico esperimento, diluire la soluzione chinesina 20 volte in BRB80CA. Etichettare il KIN20 soluzione e memorizzare sul ghiaccio. </li></ul> 4.) Microtubuli Preparazione <ul><li> In un tubo da microcentrifuga 0,5 ml, preparare 25 ml di soluzione di crescita: 4 mM MgCl 2, 1 mM GTP e 5% DMSO (v / v) in BRB80 buffer. </li><li> Aggiungere 6,25 ml di questa soluzione per un&#39;aliquota di 20 mg di liofilizzato tubulina biotinilato. </li><li> Vortex, poi posto in un bagno di calore a 37 ° C per 30 minuti per polimerizzare. Diluire 100-volte in BRB80T vortice e delicatamente. Etichettare il MT100 soluzione e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Fai una diluizione di 10 volte MT100 in BRB80AF. Etichettare il MT1000 soluzione. </li></ul> 5.) Streptavidina e Nanosphere Solution Preparare AlexaFluor568 streptavidina marcata ad una concentrazione di 100 nM in BRB80AF. Etichettarla STV100 e memorizzare sul ghiaccio. Allo stesso modo, diluire nanosfere 5000 volte in soluzione BRB80AF. Etichettarla NS5000 e memorizzare sul ghiaccio. 6.) Flusso costruzione cellulare Costruire una cella di flusso utilizzando due coprioggetto di vetro separate da nastro biadesivo. Questa cella di flusso è di circa 2 cm di lunghezza, 1 cm di larghezza e 100 micron alto, e ha un volume di circa 20 l. Le soluzioni sono introdotti nella cella di flusso da un lato con una pipetta e fuori malvagio dall&#39;altro utilizzando carta da filtro. 7.) Assemblea Saggio invertito Superficie del vetro viene prima rivestita con la caseina che consente chinesina di mantenere la sua funzionalità su adsorbimento. Dopo kinesina è assorbito, microtubuli sono introdotti, che sono detenuti da cinesina. I microtubuli sono poi rivestiti con streptavidina fluorescenti. Dopo aver lavato i streptavidina eccesso, biotinilato polistirolo fluoresceina nanosfere (40 nm di diametro) vengono introdotti. Superficie nanosfere adsorbito stazionario si scontrano con i microtubuli in movimento e vengono caricate su di loro (Figura 1). L&#39;ordine del flusso di soluzioni e di tempo concesso prima dell&#39;introduzione della soluzione successiva sono elencati di seguito. <ul><li> BRB80CS0.5, a 5 minuti </li><li> KIN20, a 5 minuti </li><li> MT1000, a 5 minuti </li><li> STV100, a 5 minuti </li><li> BRB80AF, 3x </li><li> NS5000 </li></ul> 8.) Microscopia Montare la cella di flusso sul palco subito dopo l&#39;introduzione del microscopio nanosfere. In questo esperimento, un TE2000-U Eclipse microscopio a fluorescenza (Nikon, Melville, NY) dotata di un obiettivo olio 100X (NA 1,45), una X-Cite 120 lampada (EXFO, Ontario, Canada) e un ixon EMCCD fotocamera (ANDOR, South Windsor, CT) è stato utilizzato. Un filtro FITC cubo (# 48001) e un cubo TRITC filtro (# 48002, Tecnologie Chroma, Rockingham, VT) sono stati utilizzati per nanosfere immagine e microtubuli respectivamente sulla superficie inferiore di celle di flusso. Il tempo di esposizione è stato 0.2s, mentre il tempo tra le esposizioni è stato 2 s. <img src="/files/ftp_upload/2006/2006fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Schema del navette molecolari.

<ol>
	<li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science.">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li><li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules.">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li><li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles.">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li><li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins.">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li><li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins.">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li><li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes.">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li><li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes.">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li><li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination.">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li><li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Con piccole modifiche, questo protocollo è stato usato con successo da una varietà di gruppi di assemblare chinesina-microtubuli saggi motilità base. DTT 10 mM nella soluzione motilità finale può essere sostituito con lo 0,5% β-mercaptoetanolo. Soluzioni standard (BRB80AF, KIN20 e MT1000) più di 2 ore di vita non deve utilizzare. Qualsiasi soluzione contenente microtubuli taxolo e soprattutto non devono mai essere posti su ghiaccio. L&#39;eccessiva esposizione della cella di flusso ai risultati UV luce di eccitaz...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Adenosine-5&#x2019;-triphosphate (ATP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin tubulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton Inc.</td>
<td>T333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Casein</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-0376</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-9322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-(+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D-8779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-0610</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#x2032;,N&#x2032;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E-4378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F-8766</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guanosine-5&#x2019;-triphosphate (GTP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostic</td>
<td>106399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>63069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paclitaxel (Taxol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#x2032;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>480878</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S11226</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles

Le cellule hanno sviluppato sofisticate macchine molecolari, come chinesina proteine ​​motrici e filamenti di microtubuli, al sostegno attivo di trasporto intracellulare di carico. Mentre kinesins coda dominio si lega ad una varietà di carichi, domini testa kinesins utilizzare l&#39;energia chimica immagazzinata nelle molecole di ATP per passo lungo il reticolo microtubuli. Il lungo e rigido microtubuli fungono da piste per lunghe distanze di trasporto intracellulare. Questi motori e filamenti possono anche essere impiegati in microfabbricazione ambienti sintetici come componenti di navette molecolari 1. In un progetto di uso frequente, i motori chinesina sono ancorati alla superficie della pista con la coda, e microtubuli funzionalizzate servire come elementi costitutivi di trasporto merci, che sono spinti da questi motori. Queste navette possono essere caricati con il carico utilizzando il legame forte e selettiva tra biotina e streptavidina. I componenti chiave (tubulina biotinilato, streptavidina, e carico biotinilato) sono disponibili in commercio. Sulla base del classico saggio motilità invertita 2, la costruzione di navette molecolari è dettagliata qui. Chinesina proteine ​​motrici sono assorbiti da una superficie coperte con caseina; microtubuli sono polimerizzati da tubulina biotinilato, ha aderito al chinesina e successivamente rivestito con streptavidina marcata con rodamina. La concentrazione di ATP è mantenuto a concentrazione subsaturating di raggiungere una velocità ottimale microtubulo scorrimento per il carico merci 3. Infine, biotinilato marcato con fluoresceina nanosfere vengono aggiunti come merce. Nanosfere allegare ai microtubuli a causa di collisioni tra microtubuli volo a vela e nanosfere aderire alla superficie. Il protocollo può essere facilmente modificato per caricare una varietà di carichi come il DNA biotinilato 4, 5 o quantum dots una vasta gamma di antigeni tramite anticorpi biotinilati 4-6.

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Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Navette molecolari costituiti da microtubuli funzionalizzati scivolando sulla superficie aderito chinesina proteine ​​motore può servire come sistema di trasporto su scala nanometrica. Qui, l&#39;assemblaggio di un sistema di navetta tipico è descritto.

Caricamento di merci su Kinesin Navette Powered molecolare

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Views.  University of Florida. Navette molecolari costituiti da microtubuli funzionalizzati scivolando sulla superficie aderito chinesina proteine ​​motore può servire come sistema di trasporto su scala nanometrica. Qui, l'assemblaggio di un sistema di navetta tipico è descritto.