אנחנו אסירי תודה בכבדות אל יונתן הווארד, אשר פיתח את הקבוצה פרוטוקול בסיסי assay תנועתיות גלישה אשר הותאמה לאחר מכן על ידי בנו. תמיכה כספית מן NSF מענק DMR0645023 היא הודתה בהכרת תודה.

1.) Buffers ו ריאגנטים פתרונות אלה צריכים להיות מוכנים מראש ומאוחסנים aliquots בגודל ובנוחות. Aliquot צריכה להכיל פתרון מספיק עבור ניסוי טיפוסי aliquot טרי אמור לשמש עבור כל assay תנועתיות. תנאי אחסון בגדלים aliquot טיפוסי מוזכרים גם הפרוטוקולים הבאים. 1. BRB80 חיץ, (80 צינורות מ&quot;מ, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA ב deionized מזוקקים (dd) במים, pH 6.9 המותאמת ידי KOH) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמציא פתרון 100 מ&quot;ל מניות של 0.5 M EGTA במים dd. התאם ל-pH 7.0 באמצעות פתרון 2 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמציא פתרון 100 מ&quot;ל מניות של 1 M MgCl 2 במים dd. החיטוי את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 24.2 גרם של צינורות 3.1 גרם כדורי KOH ב כ 800 מ&quot;ל מים ומערבבים dd לפזר. התאם את ה-pH 6.9 ל 1 באמצעות פתרון M KOH. הוסף 2 מ&quot;ל של תמיסת 0.5 EGTA המניות M ו 1 מ&quot;ל של 1 פתרון M 2 מניות MgCl. להעלות את נפח 1000 מ&quot;ל עם מים dd. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot לתוך צינורות 50 מ&quot;ל בז ולהקפיא ב -20 ° C לשימוש עתידי. צינור BRB80 כרגע בשימוש ניתן לאחסן 4 ° C או בטמפרטורת החדר. </li></ul> 2. מגנזיום כלוריד, MgCl 2 (100 מ&quot;מ במים dd) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל במים dd להשיג הריכוז הסופי של mM 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (10 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי </li></ul> 3. Guanosine-5&#39;-טריפוספט, disodium מלח, GTP (25 מ&quot;מ dd המים, pH מותאם 7 על ידי NaOH) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול החוצה מתמוססים במים dd ולהתאים את pH עד 7 על ידי פתרון 2 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמת על ידי מדידת ריכוז ספיגת UV ב 260 ננומטר. (השתמש מקדם הכחדה של 11.7 x 103 ס&quot;מ -1 מ -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (10 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 4. Sulfoxide דימתיל, DMSO <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (10 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 5. טקסול (1 מ&quot;מ DMSO) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול החוצה מתמוססים DMSO מתחת למכסה המנוע קטר כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 6. D-(+), גלוקוז, (2 מ &#39;במים dd) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול החוצה מתמוססים במים dd כדי להשיג ריכוז סופי של 2 מ &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 7. גלוקוז אוקסידאז, (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב BRB80) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיס BRB80 להשיג ריכוז סופי של 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 8. Dithiothreitol, DTT (1 M ב dd מים) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתמוססים במים dd מתחת למכסה המנוע קטר כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 9. Catalase, (0.8 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב BRB80) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיס BRB80 לפחות 2 שלבים כדי להשיג ריכוז סופי של 0.8 מ&quot;ג / מ&quot;ל. קבע את הריכוז בכל שלב על ידי מדידת ספיגת UV ב 276 nm ו 406 nm (השתמש מקדם הכחדה של 3.1 x 10 -5 מ -1 ס&quot;מ -1 ב 276 ננומטר 2.2 x 10 -5 מ -1 ס&quot;מ -1 ב 406 ננומטר המשוואה CL =). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 10. אדנוזין 5&#39;-טריפוספט-, ה-ATP (100 מ&quot;מ ב 100mm MgCl 2) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מלאי של 100 מ&quot;מ MgCl 2 במים dd. לשקול את אבקה יבשה לפזר בפתרון זה המניה להשיג הריכוז הסופי של 100mm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמת על ידי מדידת ריכוז ספיגת UV ב 260 ננומטר. (השתמש מקדם הכחדה של 15.4 x 10 ס&quot;מ 3 -1 מ -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (20 נפח μL) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 11. פתרון קזאין (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קזאין ב BRB80) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כ 3 גרם קזאין למים 30 מ&quot;ל ב dd צינור 50 בז מ&quot;ל. וורטקס במשך שעה בערך 1 עד מפתחת פתרון עקביות עבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g כ 15,000 עבור 30 דקות. סינון supernatant דרך 0.5 מיקרומטר ו 0.2 מזרק מסננים מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של supernatant על ​​ידי מדידת ספיגת UV ב 280 ננומטר (השתמש מקדם הכחדה של 0.67 ס&quot;מ מ&quot;ל -1 מ&quot;ג -1). לדלל אותו 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב BRB80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot (20 נפח μL) בעד 0.5 microcentrifuge צינורות מ&quot;ל ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li></ul> 2.) תקן פתרונות אלה מוכנים ביום של הניסוי אמור להיות מושלך לאחר הניסוי נגמר. הכן 1 מ&quot;ל של כל אחד. 1. BRB80CS0.5 <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל פתרון קזאין ב BRB80 לריכוז סופי של 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ולאחסן על קרח. פתרון זה הוא הציג לתוך התא זרימה לפני kinesin ומסייע לשמור על פעילות kinesin לאחר משטח ספיחה. </li></ul> 2. BRB80CA <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו - קזאין 1 mM ATP ב BRB80 ולאחסן על קרח. Kinesin הוא מדולל יותר באמצעות פתרון זה לפני מבוא לתוך התא זרימה. </li></ul> 3. BRB80T <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל פתרון טקסול ב BRB80 לריכוז סופי של 10 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורת החדר. פתרון זה משמש כדי לייצב microtubules. </li></ul> 4. BRB80CT <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 טקסול מיקרומטר ו 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קזאין ב BRB80 ולאחסן בטמפרטורת החדר. זה משמש יותר להכין את antifade ופתרונות microtubule. </li></ul> 5. BRB80AF <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20 מ&quot;מ D-גלוקוז, 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​גלוקוז אוקסידאז, 8 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​Catalase, DTT 10 מ&quot;מ, ו -20 מיקרומטר ATP ב BRB80CT ולאחסן בטמפרטורת החדר. פתרון זה משמש כדי לדלל streptavidin ו nanospheres ו &quot;לשטוף&quot; את streptavidin עודף בתא זרימה. מהירות kinesin יכול להיות נשלט על ידי התאמת ריכוז ה-ATP בפתרון זה. </li></ul> 3). Kinesin הכנה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקספרס kinesin מבנה המורכב של wild-type, באורך מלא, שרשרת תסיסנית kinesin melanogaster כבד C-מסוף תג שלו Escherichia coli ולטהר באמצעות טור Ni-נ.ת. ע כמתואר 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את aliquots (10 μL כל אחת) ב 0.5 microcentrifuge צינורות מ&quot;ל ולאחסן ב -80 ° C לשימוש עתידי. ריכוז kinesin פעיל aliquots אלה הוא כ 200 ננומטר. 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי טיפוסי, לדלל את הפתרון kinesin 20 פי BRB80CA. תווית KIN20 פתרון ולאחסן על קרח. </li></ul> 4.) Microtubule הכנה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 0.5 microcentrifuge מ&quot;ל, להכין 25 μL של פתרון צמיחה: 4 מ&quot;מ MgCl 2, 1 mM GTP ו DMSO 5% (v / v) במאגר BRB80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6.25 μL של פתרון זה aliquot 20 מיקרוגרם של טובולין biotinylated lyophilized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , וורטקס אז מקום באמבט חום 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לפלמר. מדולל 100 של פי BRB80T ו מערבולת בעדינות. תווית MT100 פתרון לאחסון בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע דילול של פי 10 MT100 ב BRB80AF. תווית MT1000 פתרון. </li></ul> 5.) Streptavidin ו Nanosphere פתרון הכן AlexaFluor568 שכותרתו streptavidin בריכוז של 100 ננומטר BRB80AF. לייבל זה STV100 ולאחסן על קרח. באופן דומה, לדלל nanospheres 5000 פי פתרון BRB80AF. לייבל זה NS5000 ולאחסן על קרח. 6). Cell תזרים בנייה לבנות flowcell באמצעות שני coverslips זכוכית מופרדות קלטת דו צדדית. זה התא זרימה הוא כ 2 ס&quot;מ אורך, 1 ס&quot;מ רוחב ו - 100 מיקרומטר גבוהה, יש נפח של כ 20 μL. פתרונות מוצגים לתוך התא זרימה מצד אחד באמצעות פיפטה והחוצה רשעים מן השני באמצעות נייר פילטר. 7). Assay הפוך האסיפה משטח זכוכית מצופה תחילה קזאין המאפשר kinesin לשמר את הפונקציונליות שלו על ספיחה. לאחר kinesin הוא adsorbed, microtubules מוצגים, אשר מוחזקות בידי kinesin. Microtubules הם מצופים אז עם streptavidin ניאון. אחרי כביסה את streptavidin עודף, biotinylated פוליסטירן והעמסת nanospheres (40 בקוטר ננומטר) הם הציגו. Adsorbed Surface nanospheres נייח להתנגש עם microtubules מרגש לקבל הועמסו על אותם (איור 1). סדר הזרימה של פתרונות זמן מותר לפני כניסתה של הפתרון הבא להלן. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BRB80CS0.5, 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> KIN20, 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MT1000, 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> STV100, 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BRB80AF, 3x </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NS5000 </li></ul> 8). מיקרוסקופית הר התא זרימה על הבמה מיקרוסקופ מיד לאחר הקדמה nanosphere. בניסוי זה, TE2000 U-Eclipse מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ניקון, מלוויל, ניו יורק) מצויד מטרה שמן 100x (NA 1.45), X-120 לצטט מנורה (EXFO, אונטריו, קנדה) ו EMCCD iXon המצלמה (אנדור, דרום וינדזור, CT) היה בשימוש. מסנן FITC קוביה (# 48001) ו קובייה TRITC מסנן (# 48002, Chroma טכנולוגיות, Rockingham, VT) שימשו nanospheres התמונה microtubules respectively על פני השטח התחתון של תאים הזרימה. זמן החשיפה היה 0.2s, ואילו הזמן בין החשיפה היה 2 s. <img src="/files/ftp_upload/2006/2006fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ציור סכמטי של המעבורות מולקולרית.

<ol>
	<li>Agarwal, A., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+motors+at+the+intersection+of+nanotechnology+and+polymer+science.">Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science.</a> Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).</li><li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules.">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).</li><li>Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond+curing+time+of+a+molecular+adhesive+causes+velocity-dependent+cargo-loading+of+molecular+shuttles.">Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles.</a> Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).</li><li>Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+and+Transporting+DNA+Molecules+Using+Motor+Proteins.">Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.</a> Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).</li><li>Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+transport+of+nanocrystal+CdSe+quantum+dot+nanocomposites+using+microtubules+and+kinesin+motor+proteins.">Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins.</a> Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).</li><li>Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+takes+one+8-nm+step+for+each+ATP+that+it+hydrolyzes.">Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes.</a> J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).</li><li>Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+performance+of+protein-resisting+surfaces+at+ultra-low+protein+coverages+using+kinesin+motor+proteins+as+probes.">Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes.</a> Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).</li><li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination.">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).</li><li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

עם שינויים קלים, פרוטוקול זה שימש בהצלחה על ידי מגוון של קבוצות להרכיב kinesin-microtubule מבחני תנועתיות מבוסס. DTT 10 מ&quot;מ הפתרון הסופי תנועתיות יכול להיות מוחלף עם 0.5% β-mercaptoethanol. תקן פתרונות (BRB80AF, KIN20 ו MT1000) יותר מ 2 שעות הישן לא צריך להשתמש. כל פתרון המכיל microtubules טקסול ובמיוחד ל...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Adenosine-5&#x2019;-triphosphate (ATP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin tubulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton Inc.</td>
<td>T333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Casein</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-0376</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C-9322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-(+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D-8779</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-0610</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#x2032;,N&#x2032;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E-4378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F-8766</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G-7016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guanosine-5&#x2019;-triphosphate (GTP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostic</td>
<td>106399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>63069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paclitaxel (Taxol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T1912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#x2032;-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P-6310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>480878</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S11226</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

cargo loading onto kinesin powered molecular shuttles

תאים התפתחו מכונות מולקולריות מתוחכמות, כגון חלבונים kinesin המנוע חוטים microtubule, לתמוך תחבורה תאיים פעיל של המטען. בעוד kinesins זנב תחום נקשר מגוון רחב של מטענים, kinesins תחומים הראש לנצל את האנרגיה הכימית מאוחסנים מולקולות ATP לשלב יחד הסריג microtubule. ארוך, microtubules נוקשה לשמש להובלת מסלולים למרחקים ארוכים תאיים. מנועים אלה סיבים יכולים גם להיות מועסק בסביבות סינתטי microfabricated כרכיבים של המעבורות מולקולרית 1. בעיצוב נעשה שימוש תכוף, kinesin מנועים מעוגנים אל פני השטח את המסלול דרך הזנבות שלהם, microtubules פונקציונליות לשמש מרכיבים המטען שנשאו, אשר מונע על ידי מנועים אלה. בהסעות אלה ניתן לטעון עם מטען על ידי ניצול מחייב חזק סלקטיבית בין ביוטין ו streptavidin. מרכיבי מפתח (טובולין biotinylated, streptavidin, ומטענים biotinylated) זמינים מסחרית. בונים על assay תנועתיות הקלאסי הפוכה 2, בנייה של המעבורות מולקולרי מפורט כאן. Kinesin חלבוני מנוע הם adsorbed על משטח precoated עם קזאין; microtubules הם polymerized של טובולין biotinylated, דבק kinesin ומצופה לאחר מכן עם streptavidin-rhodamine שכותרתו. ריכוז ה-ATP נשמר ריכוז subsaturating להשיג מהירות microtubule גלישה אופטימלית עבור טעינת מטען 3. לבסוף, biotinylated והעמסת שכותרתו nanospheres מתווספים כמו מטען. Nanospheres לצרף microtubules כתוצאה מהתנגשויות בין microtubules גלישה ו nanospheres שמירה על פני השטח. הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות לטעון מגוון רחב של מטענים כגון DNA biotinylated 4, 5 נקודות קוונטיות או מגוון רחב של אנטיגנים באמצעות נוגדנים biotinylated 4-6.

Watch this Scientific Journal Video about Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles at JoVE.com

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

ההסעות מולקולרית המורכבת microtubules פונקציונליות מחליק על פני השטח, דבק kinesin חלבונים המנוע יכול לשמש כמערכת הובלה הננומטרי. הנה, הרכבה של מערכת הסעה טיפוסית מתואר.

המטען טוען על הסעות Kinesin מולקולרית מופעל

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

cargo-loading-onto-kinesin-powered-molecular-shuttles

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Views.  University of Florida. ההסעות מולקולרית המורכבת microtubules פונקציונליות מחליק על פני השטח, דבק kinesin חלבונים המנוע יכול לשמש כמערכת הובלה הננומטרי. הנה, הרכבה של מערכת הסעה טיפוסית מתואר.

Video: Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace. Most are associated with repetitive, high force hand activities. The mechanisms of cellular and structural damage due to cyclical loading are not well known. The purpose of this video is to present a new system that can simultaneously load four tendons in tissue culture. The video describes the methods of sterile tissue harvest and how the tendons are loaded onto a clamping system that is subsequently immersed into media and maintained at 37&deg;C. One clamp is fixed while the other one is moved with a linear actuator. Tendon tensile force is monitored with a load cell in series with the mobile clamp. The actuators are controlled with a LabView program. The four tendons can be repetitively loaded with different patterns of loading, repetition rate, rate of loading, and duration. Loading can continue for a few minutes to 48 hours. At the end of loading, the tendons are removed and the mid-substance extracted for biochemical analyses. This system allows for the investigation of the effects of loading patterns on gene expression and structural changes in tendon. Ultimately, mechanisms of injury due to overuse can be studies with the findings applied to treatment and prevention.

A new in vitro system for simultaneously loading four tendons in culture is described.

Ex vivo טוען מכני של גיד

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

טוען תסיסנית מסופי עצב עם אינדיקטורים סידן

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within the LTR sequences of the HIV-1 provirus, resulting in the excision and eradication of the provirus from infected human cells. 
We started with Cre, a 38-kDa recombinase, that recognizes a 34-bp double-stranded DNA sequence known as loxP. Because Cre can effectively eliminate genomic sequences, we set out to tailor a recombinase that could remove the sequence between the 5'-LTR and 3'-LTR of an integrated HIV-1 provirus. As a first step we identified sequences within the LTR sites that were similar to loxP and tested for recombination activity. Initially Cre and mutagenized Cre libraries failed to recombine the chosen loxLTR sites of the HIV-1 provirus. As the start of any directed molecular evolution process requires at least residual activity, the original asymmetric loxLTR sequences were split into subsets and tested again for recombination activity. Acting as intermediates, recombination activity was shown with the subsets. Next, recombinase libraries were enriched through reiterative evolution cycles. Subsequently, enriched libraries were shuffled and recombined. The combination of different mutations proved synergistic and recombinases were created that were able to recombine loxLTR1 and loxLTR2. This was evidence that an evolutionary strategy through intermediates can be successful. After a total of 126 evolution cycles individual recombinases were functionally and structurally analyzed. The most active recombinase -- Tre -- had 19 amino acid changes as compared to Cre. Tre recombinase was able to excise the HIV-1 provirus from the genome HIV-1 infected HeLa cells (see "HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase", Hauber J., Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virology and Immunology, Hamburg, Germany). While still in its infancy, directed molecular evolution will allow the creation of custom enzymes that will serve as tools of "molecular surgery" and molecular medicine.

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within the LTR sequences of the HIV-1 provirus, resulting in the excision and eradication of the provirus from infected human cells. While still in its infancy, directed molecular evolution will allow the creation of custom enzymes that will serve as tools of molecular surgery and molecular medicine.

אבולוציה מולקולרית של recombinase Tre

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF plates to feeder cell-free Matrigel plates.


This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 2 of 3.

מ MEFs כדי Matrigel 2: hESCs פיצול מן MEFs על Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated.

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 3 of 3.

מ MEFs כדי Matrigel 3: hESCs Passaging מ Matrigel על Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

העצרת, טוען, ואת המערך של תא ultracentrifuge אנליטית לדוגמא

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

הדמיה ישירה של סידן ER עם ממוקד esterase מושרה טעינת צבע (טד)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Generating a &quot;Humanized&quot; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

יצירה &quot;אנושי&quot;<em&gt; דרוזופילה</em&gt; S2 שורת תאים רגיש לתרופתי עיכוב של Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

זיהוי של Kinesin-1 מטענים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...