Injecting Fluorescently Labeled Antibodies in Live Drosophila Embryos and Imaging of Low Abundance Proteins

للبدء ، املأ كل إبرة بخمسة ميكرولترات من محلول الجسم النانوي GFP المسمى Alexa Fluor. ضع غطاء 25 × 25 ملم على سطح منزلق زجاجي. ماصة 40 ميكرولتر من زيت الهالوكربون على الشريحة ونشرها على طول محيط غطاء الغطاء.

تحت مجهر الحقن ، ضع طرف الإبرة على حافة الغطاء المغمورة في الزيت. اضبط ضغط هواء حقن PicoPump وفقا لذلك. استبدل الشريحة الزجاجية الفارغة بشريحة جنين ذبابة الفاكهة المعدة.

اضبط طرف إبرة الحقن بشكل عمودي على المحور الأمامي الخلفي للجنين. استخدم مناور المرحلة XY لتوجيه الأجنة نحو الإبرة حتى يصل الطرف إلى مركز صفار البيض ، وضخ مرتين إلى ثلاث مرات لضخ الأجسام المضادة في صفار البيض. باستخدام مناور المرحلة XY ، قم بتوجيه الأجنة بعيدا عن الإبرة بعد الحقن والانتقال إلى الجنين التالي.

السماح للأجنة بالاحتضان عند 25 درجة مئوية حتى الوصول إلى مرحلة النمو المطلوبة. بعد الحضانة ، حدد الأجنة تحت عدسة منخفضة الطاقة مع إضاءة المجال الساطع وانتقل إلى عدسة 40X أو 63X للتصوير الحي الفلوري عالي الدقة. بعد الحقن ، تتحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء لمستقبلات الشق بشكل كبير مقارنة بجودة إشارة التألق المناعي.

علاوة على ذلك ، سمح حقن الأجسام المضادة بالتوصيف الزمني لتوطين الشق على فترات 45 ثانية دون فقدان واضح لشدة الإشارة خلال نافذة تصوير مدتها خمس دقائق. أظهر التصوير الحي للفوسفوتيروزين الجنيني أن فسفرة التيروزين غنية للغاية عند الوصلات ثلاثية الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت مجموعة ثانية جديدة من إشارة الفوسفوتيروزين تحت مركز الغشاء القمي.

كشف التصوير ثنائي اللون أن هذه المجموعة من إشارة الفوسفوتيروزين قريبة من الميوسين الإنسي. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر السكان الإنسي للفوسفوتيروزين أنماطا مماثلة من الالتحام والتبديد النابض ، كما هو موضح في الميوسين الإنسي.