ونحن نشكر برنارد كوليماكا وأعضاء المختبر سميث لتعليقات مفيدة وتوجيهات الكاشف، سام كونيل وريدفورد برنت من 3i لإيفاد التصوير الأسئلة والدوي ديبورا وتعير كارين ستيوارت كاي للرعاية الزرد. أيده هذا العمل في جامعة نوتردام، أن إليزابيث ومايكل غالاغر الأسرة، ومؤسسة الفريد سلون ص، مركز للبحوث الزرد في جامعة نوتردام ومركز للخلايا الجذعية والطب التجديدي في جامعة نوتردام سيدة. وأجريت جميع الدراسات الحيوانية امتثالا لجامعة نوتردام IACUC للدكتور سميث كودي.

ووافقت جامعة Notre Dame الرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة جميع الدراسات الحيوانية.
1-إعداد العينات الزرد
<ol><li>ضع ذكر بالغ واحد وواحد تيراغرام الإناث الكبار (بروتين القابلة للتحويل) إلى غرفة التزاوج كل الإجراءات القياسية13. في هذه المخطوطة، استخدم Tg(sox10:eos) الأسماك9 بسبب الوصول ولكن الخطوط الأخرى المعدلة وراثيا مع البروتين فوتوكونفيرتيبلي يمكن استخدامها على قدم المساواة. قم بإعداد غرفة واحدة أو أكثر في حال لم تضع الأسماك. السماح للأسماك بالبقاء في الدائرة بين عشية وضحاها.</li>
	<li>في صباح اليوم التالي، جمع البيض في أطباق بتري 100 مم. تسمح البيض الناضجة للاخصاب بعد 24 ساعة (hpf) قبل الفحص.</li>
	<li>إذا كانت الحيوانات أعلاه heterozygotes للتحوير، الشاشة 24 هبف الأطباق للأجنة Tg(sox10:eos) + مع 488 نانومتر مصدر الضوء وبروتينات فلورية خضراء تصفية مجموعات في مجهر تشريح. عزل Tg(sox10:eos) + الأجنة والسماح لتنضج إلى 48 هبف.</li>
	<li>ديتشوريوناتي الأجنة يدوياً باستخدام إبرة أو الملقط.</li>
	<li>إعداد والموجات الدقيقة 5 مل من 0.8% الحل [اغروس] نقطة انصهار منخفضة.<ol>
<li>مرة واحدة [اغروس] باردة إلى اللمس، ضع تيراغرام 3-4 أنيسثيتيزيد (sox10:eos) + 48 السمك هبف في وسط زجاج 10 مم-ساترة أسفل طبق بيتري.</li>
		<li>إضافة [اغروس] ما يكفي لتغطية سطح ساترة، حوالي 1 مل. استخدام إبرة مسبار لترتيب السمك على الجانبين. يسمح [اغروس] ترسيخ لضمان متصاعدة حيوانات. قد يكون من الضروري باستمرار إعادة ترتيب الزرد حتى أجار يتصلب14. ويأخذ التجميد حوالي 2 دقيقة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>بعد وقد توطد [اغروس] لمدة 2 دقيقة، ببطء إضافة المتوسطة الجنين الذي يحتوي على إستر حامض امينوبنزويك 0.02 في المائة (تريكيني) لطبق حتى هي مغمورة السطح السفلي لاجار وطبق. وهذا ينبغي أن يكون حوالي 3 مل.</li>
</ol>2-المجهر التركيب والتحويل قبل التصوير
<ol><li>افتح برنامج [كنفوكل] وحدد windows التقاط والتركيز [الشكل 1]. إطار التقاط نافذة، حدد إعداد التحويل الخاصة بمختبر التصوير تحت الاستيلاء على إعداد القائمة المنسدلة علامة التبويب [الشكل 1]. هنا، والإعداد الخاصة بمختبر يسمى "التصوير الأسماك".</li>
	<li>ضع العينة على نطاق [كنفوكل] ويجلب إلى التركيز باستخدام مسار والمقابض التكيف غرامة.</li>
	<li>فتح إطار التركيز وتحديد المنطقة المطلوب للفائدة (أي العقد الجذرية الظهرية).</li>
	<li>حدد الليزر c488 ضمن القائمة "تعيين عامل التصفية". ضبط التعرض لمرض التصلب العصبي المتعدد 300 والليزر الطاقة إلى 5، وتكثيف إلى 75 [الشكل 2].</li>
	<li>تحقق من مربع 3D تحت المقطع التقاط نوع . في المقطع التقاط 3D ، حدد استخدام الموقف الحالي والتحقق من النطاق حول الحالية. في نفس القسم، تعيين النطاق إلى 35، عدد الطائرات إلى 36، وحجم الخطوة 1. يمكن زيادة النطاق أو إنقاصه لاستيعاب لعمق منطقة التصوير. للحبل الشوكي هو قيمة تتراوح بين 35-40 مكدسات عادة كافية [الشكل 5].</li>
	<li>تحديد الموقع الحالي [الشكل 5].</li>
	<li>انقر فوق ابدأ في الجزء السفلي من إطار التقاط للحصول على الصورة.</li>
</ol>3-خلية واحدة فوتوكونفيرسيون
<ol><li>افتح برنامج [كنفوكل] وحدد windows التقاط والتركيز [الشكل 1]. إطار التقاط نافذة، حدد إعداد التحويل الخاصة بمختبر التصوير تحت الاستيلاء على إعداد القائمة المنسدلة علامة التبويب [الشكل 1]. هنا، والإعداد الخاصة بمختبر يسمى "الأسماك يجتذ رقاقة كاملة".</li>
	<li>حدد الليزر c488 و c541 تحت قائمة "تعيين عامل التصفية". إذا لم تكن تستخدم نفس البرمجيات المجهر، العثور على القائمة لتحديد أشعة الليزر المختلفة وحدد 488 نانومتر و 541 نانومتر الليزر. ضبط التعرض لمرض التصلب العصبي المتعدد 300 والليزر الطاقة إلى 5، وتكثيف إلى 75 [الشكل 2]. يتم تحديد هذه الإعدادات الليزر استناداً إلى إنتاج ما يكفي من الإشارات الفلورسنت دون التسبب في فوتوبليتشينج أو سمية. إذا كان هو تصور سمية أو فوتوبليتشينج، تقليل قوة الليزر أو التعرض.</li>
	<li>فتح إطار التركيز، وانقر فوق علامة التبويب photomanipulation في إطار التركيز. ضبط معلمات الليزر تبعاً لذلك. تغيير السلطة المكدس الليزر إلى 2 ومن ثم انقر فوق انتقال. تغيير حجم الكتلة النقطية إلى 1، ثم انقر فوق تعيين. قم بتغيير حجم انقر نقراً مزدوجاً فوق إلى 4. قم بتغيير السطر الليزر إلى v405 [الشكل 3].</li>
	<li>فتح إعدادات التقاط متقدمة في إطار الالتقاط. حدد علامة التبويب photomanipulation وتغيير التكرار انقر نقراً مزدوجاً فوق 2. انقر فوق "موافق" [الشكل 4].</li>
	<li>حدد علامة التبويب تخطيط س وص في إطار التركيز. الاختيار مزدوج المعلمات الليزر من الخطوة 2 في علامة التبويب photomanipulation [الشكل 3، الشكل 4]. تعيين إعدادات الليزر فوتوكونفيرت خلية الفائدة دون فوتوكونفيرسيون للخلايا المحيطة.<ol>
<li>في حالة وجود فوتوكونفيرسيون خلايا المجاورة، تقليل قوة الليزر. إذا لم يحدث فوتوكونفيرسيون خلايا، يمكن زيادة صلاحيات الليزر. على النحو الأمثل، تعيين السلطة الليزر فوتوكونفيرت المنطقة الفائدة والمناطق المحيطة بها وليس فقط.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحقق من مربع timelapse إطار التقاط نوع. ثم، انقر فوق بدء تشغيل [الشكل 6A].</li>
	<li>بمجرد فتح إطار timelapse حية، حدد أداة الدائرة على شريط الأدوات أعلى [الرقم 7]</li>
	<li>رسم دائرة في منطقة سينتيرموست في الخلية. الحق فوق دائرة مرسومة وحدد المنطقة فراب، وانتظر لمدة 3 ثوان. المساحة المحددة ينبغي أن تصبح باهتة [الشكل 8]. انقر فوق التوقف عن الالتقاط.</li>
	<li>إذا كان التصوير أكثر من الحيوان، والعودة إلى علامة التبويب تخطيط س وص في قائمة التركيز وتحديد موقف 2. ثم، كرر الخطوات 4، 1-4.6.</li>
	<li>لتحويل عدد خلايا، اتبع معايير البروتوكول والليزر للخطوات 4، 4، 1-4 باستثناء بدلاً من رسم دائرة اربط منطقة الفائدة، استخدم أداة سطر. رسم خط في منطقة اهتمام واربط المنطقة باستخدام نفس المعلمات المذكورة أعلاه.</li>
</ol>4-وظيفة-فوتوكونفيرسيون التصوير
<ol><li>بمجرد كافة النقاط فوتوكونفيرتيد. حدد المكدس الصورة القياسية الخاصة بمختبر الإعداد الموصوفة في بريكوفيرسيون التصوير في الخطوة 3. هذا ويوجد تحت الاستيلاء على إعداد القائمة المنسدلة في علامة التبويب في نافذة التقاط [الشكل 5].</li>
	<li>حدد الليزر c488 وضبط التعرض إلى 300ms والليزر الطاقة إلى 5، وتكثيف إلى 75 [الشكل 2].</li>
	<li>حدد الليزر c541 وجدت تحت نفس القائمة كالليزر c488. ضبط التعرض إلى 500 مللي والليزر الطاقة إلى 10، وتكثيف إلى 75 [الرقم 9].</li>
	<li>تحقق من مربع 3D تحت المقطع التقاط نوع . في المقطع التقاط 3D ، حدد استخدام الموقف الحالي والتحقق من النطاق حول الحالية. في نفس القسم، تعيين النطاق إلى 35، عدد الطائرات إلى 36، وحجم الخطوة 1. عدد النطاق قد زيادة أو إنقاص لاستيعاب عمق التصوير المطلوب [الشكل 5].</li>
	<li>إذا كانت هناك نقاط متعددة في علامة التبويب التركيز XY، حدد خيار قائمة متعددة في إطار الالتقاط. إذا لم يكن الأمر كذلك، قم بتحديد الموقع الحالي.</li>
	<li>انقر فوق ابدأ في الجزء السفلي من إطار التقاط للحصول على الصورة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system.">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li><li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-mediated+delivery+of+the+green+fluorescent+protein+to+the+endoplasmic+reticulum+of+plant+cells.">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li><li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling.">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li><li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&amp;#34;Fluorescent+timer&amp;#34;:+protein+that+changes+color+with+time.">&amp;#34;Fluorescent timer&amp;#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li><li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling.">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li><li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone.">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).</li><li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment.">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li><li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones.">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development.">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

في الأنسجة المعقدة، تنظيم أنواع الخلايا متميزة في مجالات محددة. واستخدمت تقنيات مؤخرا إلى تسمية الخلايا الفردية داخل هذه الأنسجة الكبيرة هياكل1،،من23. هنا نظهر اثنين من التقنيات التي يمكن استخدامها كذلك لتصور التفاعلات وحيد الخلية والخل...

تتفاعل عدة خلايا متميزة لبناء وصيانة الأنسجة الحيوانية والنباتية المعقدة. غالباً ما تكون هذه الخلايا المقحم وصعوبة التمييز بين الدول المجاورة على مستوى خلية واحدة دون الفحص المجهري عالية الدقة التي تتطلب تثبيت أنسجة. بيد نفهم كيف أن هذه النماذج الأنسجة، والحفاظ على، وتصبح المريضة، لقد كان ضرورية للتحقيق في كيفية وحيدة الخلايا داخل الأنسجة تتفاعل مع مرور الوقت. ومن الناحية المثالية، تتطلب هذه التجارب تسمية الخلايا المفردة داخل أنسجة بطريقة غير الغازية دون الشرط للتثبيت. وقد طور العلماء الآن العديد من التقنيات لإنجاز هذه المهمة1،2،،من34.
اكتشاف والتنفيذ للبروتين قنديل أخضر نيون (بروتينات فلورية خضراء) هو أحد النهج مثيرة يسمح بوصفها خلايا متميزة في بيئة أنسجة1. استخدام المروجين خلية على حدة، من الممكن تحديد مجموعة فرعية خلايا المسماة1وراثيا. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تستخدم التعبير المستحث الفيروسية للتجارة والنقل للتعبير المستخدم المحدد من بروتينات فلورية خضراء3،4. على الرغم من أن مفيدة للغاية، التعبير وساطة الوراثية للتجارة والنقل لا يسمح بالتعبير المستخدم المحدد ضمن مجموعة فرعية من الخلايا في الأنسجة؛ والفيروسية للتجارة والنقل، على الرغم من أن ميزة، يمكن أن يكون التعبير الغازية. مع ظهور مشتقات التجارة والنقل وتقنيات ذكية مثل برينبوو للتعبير عن البروتينات الفلورية متميزة أكثر قليلة داخل الأنسجة، فقد أصبح من الممكن تصور الخلايا المفردة والتفاعلات فيما بينها في نسيج معقد2، 5-ومع ذلك، هذه النهج تسمية الخلايا بطريقة عشوائية. إذا التجربة المرجوة يتطلب تصور خلية مفردة أو السكان من الخلايا التي يتم تعريفها بالمجرب، لذلك محدودة. مع مثل هذه التجارب، وأنه سيكون من المفيد أن يكون بروتين فلوري أعرب وراثيا التي يمكن التلاعب بها للتمييز، بطريقة وحيدة خلية، فمن الخلايا الفلورسنت وغير الفلورية الأخرى.
لتحقيق هذا الهدف، ووضع تصور لبيولوجيا الخلية من الخلايا المفردة داخل أنسجة حية معقدة، يستخدم المجتمع العلمي فوتوكونفيرسيون خلية مفردة متميزة من البروتينات الفلورية6،،من78. استخدام جينياً الخاضعة للتعبير عن البروتين فوتوكونفيرتيبلي (أي eos، كايد، إلخ) بالانتقال من أخضر إلى الأحمر الدولة الفلورسنت عند تعريضه للأشعة فوق البنفسجية (488 نانومتر) الخفيفة، يمكننا أن نميز خلية واحدة من به المسمى فلوريسسينتلي الجيران6،،من78. وهذا النهج يستخدم جهاز يلحق بنا مجهر [كنفوكل] الذي يمكن توجيه الضوء من كدسة ليزر لمنطقة حيود محدودة الفائدة. مع هذا الأسلوب، ونحن أما تسمية الخلايا المفردة أو عدد أكبر من السكان في طريقة المعرفة من قبل المستخدم10،،من911. هذا الأسلوب مينيملي مقارنة بحقن خلية مفردة من الفيروسية بروتينات فلورية خضراء. كدليل على المفهوم، نظهر أننا يمكن فوتوكونفيرت الخلايا المفردة داخل العقدة في الجهاز العصبي المحيطي وعدد أكبر من السكان فوتوكونفيرت مثل الخلايا الموجودة في الجانب البطني الحبل الشوكي9،10، 11،12. أننا ثم تصور هذه فوتوكونفيرتيد خلية السكان 24 ساعة في وقت لاحق إلى التبصر في حركتهم والتمايز أثناء التطوير.

<table><tbody><tr><td>&lt;font class=&quot;font5&quot;&gt;Tg(&lt;em&gt;sox10:eos&lt;/em&gt;)&lt;/font&gt;&lt;font class=&quot;font0&quot;&gt; zebrafish animals&lt;/font&gt;</td><td></td><td></td><td>Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame</td></tr><tr><td>100 X 15 mm petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium</td><td></td><td></td><td>Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.</td></tr><tr><td>0.8% Low Melting Point Agarose</td><td>dot scientific inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr><td>Needle dissecting probe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)</td><td>Fluka analytical</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters</td><td>Zeiss Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets</td><td>3i spinning disk confocal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV light source (laser) for photoconversion</td><td>405 nm laser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook software</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell photoconversion in living intact zebrafish

الأنسجة الحيوانية والنباتية تتكون من السكان متميزة من الخلايا. هذه الخلايا تتفاعل مع مرور الوقت لبناء وصيانة الأنسجة، ويمكن أن يسبب المرض عندما تعطلت. وقد طور العلماء تقنيات ذكية للتحقيق في الخصائص والديناميات الطبيعية من هذه الخلايا داخل أنسجة سليمة بالإعراب عن البروتينات الفلورية في مجموعات فرعية خلايا. ومع ذلك، في بعض الأحيان، تتطلب تجارب أكثر التصور المحدد من الخلايا داخل الأنسجة، أحياناً في طريقة وحيدة الخلية أو السكان من الخلايا. لتحقيق هذا الهدف، ووضع تصور لخلايا مفردة ضمن عدد خلايا، وقد استخدمت العلماء فوتوكونفيرسيون خلية واحدة من البروتينات الفلورية. وللتدليل على هذا الأسلوب، نعرض هنا كيفية توجيه الأشعة فوق البنفسجية إلى خلية ايوس-الإعراب عن اهتمامها حالها، تعيش الزرد. ثم أننا صورة تلك الخلايا ايوس+ فوتوكونفيرتيد 24 ساعة في وقت لاحق لتحديد كيف غيروا في الأنسجة. يمكننا وصف تقنيات اثنين: واحد فوتوكونفيرسيون الخلايا وفوتوكونفيرسيونس من سكان خلية. يمكن استخدام هذه التقنيات لتصور التفاعلات خلية خلية، والخلية-مصير والتمايز، والهجرات الخلية، مما يجعل من أسلوب الذي يطبق في العديد من الأسئلة البيولوجية.

يمكن استخدام فوتوكونفيرسيون للبروتينات الفلورية لتسمية خلايا مميزة داخل أنسجة6. وللتدليل على ذلك، استخدمت Tg(sox10:eos) الأسماك9 للتعبير عن البروتين فوتوكونفيرتيبلي Eos تحت تسلسل sox10التنظيمية. كانت الحيوانات Tg(sox10:eos) في 48 هبف شنت أول ومن...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish at JoVE.com

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

نقدم هنا، بروتوكولا لإظهار كيف يتحقق فوتوكونفيرسيون الخلية من خلال التعرض للأشعة فوق البنفسجية إلى مناطق محددة معربا عن البروتين الفلورسنت، ايوس، في الحيوانات الحية.

فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

single-cell-photoconversion-in-living-intact-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.9K Views.  University of Notre Dame. نقدم هنا، بروتوكولا لإظهار كيف يتحقق فوتوكونفيرسيون الخلية من خلال التعرض للأشعة فوق البنفسجية إلى مناطق محددة معربا عن البروتين الفلورسنت، ايوس، في الحيوانات الحية.

Video: Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

قياس الاستقرار البروتين المتواجد في الحي اسماك الزرد الأجنة عن طريق الإسفار تسوس بعد Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

تتبع الخلايا في الزرد-GFP المعدلة وراثيا باستخدام نظام Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

ثقافة الكبار المعدلة وراثيا الزرد الشبكية إإكسبلنتس التصوير خلية حية من قبل Multiphoton المجهر

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

حركات للوفلر الأنسجة التالية عن طريق فوتوكونفيرسيون خلية في الجنين الزرد

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

الثقافة وتعداء الخلايا الابتدائية الزرد

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Biology

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

متعدد الألوان الوقت الفاصل بين التصوير من اسماك الزرد المعدلة وراثيا : تصور الخلايا الجذعية الشبكية تفعيلها من خلال الخلية المستهدفة تذرية متعلق بالخلايا العصبية

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

واحدة رسم الخرائط ذات الصلة مصير الخليوي في الزرد

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

تتبع الخلية عن طريق البروتينات Photoconvertible خلال التنمية اسماك الزرد

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...