ברצוננו להודות לד"ר ג'ניפר א. זאלן על אספקת קו Sqh-GFP Drosophila ותמיכה בפיתוח הראשוני של טכניקה זו, ולד"ר פרנסואה שוויסגוט על אספקת קו Notch-GFP Drosophila . עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32270809) ל- H.H.Yu, תמיכה כספית וצוות נדיבה מבית הספר למדעי החיים, SUSTech, ומימון ל- Y. Yan מ- Shenzhen Science and Technology Innovation Commission / JCYJ20200109140201722.

הניסויים נערכו בהתאם להנחיות ולאישור בית הספר למדעי החיים, אוניברסיטת SUSTech. האורגניזם המשמש הוא Drosophila melanogaster, והגנוטיפים הם Notch-Knockin-GFP (כרומוזום X) ו- Sqh-sqh-GFP (כרומוזום II), המסופקים בנדיבות על ידי מעבדותיהם של ד"ר פרנסואה שוויסגוט (מכון פסטר) וד"ר ג'ניפר זאלן (מכון סלואן קטרינג), בהתאמה. בעוד פרוטוקול זה מתמקד בעיקר בהיבטים של תיוג נוגדנים והדמיה חיה, אנא עיין בדוחות שפורסמו לתיאורים מפורטים יותר של איסוף עוברים דרוזופילה והזרקה 15,16.
1. תיוג פלואורסצנטי של נוגדנים
<ol><li>רצוי, להשתמש נוגדנים חד שבטיים או ננו גופים עבור חלבון של עניין. הכינו את ריכוז הנוגדנים ב-1 מ"ג/מ"ל ומעלה. הערה: במחקר זה, GFP nanone (ראה טבלה של חומרים) משמש כדוגמה. ננוני GFP הזמינים מסחרית ארוזים בריכוז של 1.0 מ"ג/מ"ל ובנפח של 250 מיקרוליטר. בנוסף, נעשה שימוש בערכה מסחרית לסימון נוגדנים (ראו טבלת חומרים), אשר מצמידה את Alexa Fluor 594 לאמינים ראשוניים של חלבונים באמצעות תגובת אסטר סוקסינימידיל11. חשוב לציין, תהליך תיוג זה אינו משנה באופן משמעותי את ריכוז הנוגדנים.</li>
	<li>הכן תמיסת סודיום ביקרבונט 1 M על ידי השעיה מחדש של רכיב B (המסופק בערכת תיוג הנוגדנים) ב -1 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה.</li>
	<li>התאם את ריכוז הנוגדנים ל- 1.0 מ"ג / מ"ל, ולאחר מכןהוסף נפח של 1/10 (10 מיקרוליטר עבור ננו GFP של 100 מיקרוליטר) של תמיסת 1 M נתרן ביקרבונט.</li>
	<li>הוסף 110 μL של תערובת הנוגדנים (משלב 1.3) ישירות לצינור המכיל צבע Alexa Fluor 594. יש להפוך כדי לערבב (לא לערבב) ולדגור על מסובב במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הרכיבו את עמודת הטיהור מערכת הצמידות (ראו טבלת חומרים). הכינו מיטת שרף בנפח 1.5 מ"ל (מסופקת בערכת סימון הנוגדנים) וצנטריפוגו את העמוד במהירות של 1100 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי להסיר עודפי נוזלים מהשרף.</li>
	<li>הוסף את תערובת התגובה (משלב 1.4) טיפה לראש עמוד השרף והצנטריפוגה ב 1100 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את הנוגדן המסומן. הנוגדן שנאסף צריך להופיע בצבע ורוד, והנפח צריך להיות מעט פחות מ -100 μL. יש לאחסן בצינורות עטופים בנייר כסף או בצבע כהה ב -4 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. הכנת עוברי דרוזופילה
<ol><li>הניחו 200 דרוזופילה בוגרים שזה עתה בקעו בכלוב בצורת גליל פלסטיק (קוטר = 5 ס"מ, גובה = 8 ס"מ) עם יחס זכר-נקבה של 1:10. אטמו צד אחד ברשת מתכת נקבובית לאוורור ואת הצד השני בצלחת אגר ממרח פירות/שמרים.</li>
	<li>החליפו את הצלחת כל 12 שעות במשך שלושה ימים לפני איסוף העוברים. זה מאפשר סנכרון של הטלת ביצים Drosophila ומשפר את יעילות האיסוף.</li>
	<li>ביום ההזרקה, יש להחליף את הכלוב לצלחת מיץ פירות עם מינימום משחת שמרים ולאסוף עוברים בטמפרטורה של 25°C למשך שעה. אם סבב האיסוף הראשון אינו מניב מספיק עוברים (<50 עוברים), השליכו את הצלחת הראשונה וחזרו על שלב זה לסבב איסוף שני עד שיוטלו יותר מ-100 עוברים תוך שעה.</li>
	<li>מוציאים את הצלחת מהכלוב כדי לעצור את הטלת הביצים ודוגרים ב-25 מעלות צלזיוס למשך שעתיים נוספות כדי לקבל עוברים בני 2-3 שעות. השלב הנכון של העוברים הוא קריטי להצלחת הזרקת הנוגדנים.</li>
	<li>כדי להסיר את קליפת הביצה של עוברים, הוסיפו 2 מ"ל של אקונומיקה 50% לצלחת מיץ הפירות והוציאו בעדינות עוברים מהצלחת באמצעות מברשת צבע (איור 2A-4). לעתים קרובות, עוברים יונחו ישירות על גבי משחת השמרים. במקרה זה, מקובל להבריש את משחת השמרים לתמיסת אקונומיקה כדי לאסוף את כל העוברים.</li>
	<li>דוגרים על העוברים הצפים באקונומיקה של 50% למשך 2 דקות ומערבלים את צלחת מיץ הפירות כל 30 שניות כדי לשפר את יעילות הסרת קליפות הביצה.</li>
	<li>העבירו את תערובת העובר/אקונומיקה על-ידי מזיגה לתוך מסננת תאי ניילון בגודל 70 מיקרומטר (איור 2A-7). שטפו את העוברים ביסודיות באמצעות בקבוק מים כדי להסיר שאריות אקונומיקה ומשחת שמרים. יבשו את מסננת התאים לחלוטין עם מגבות נייר, וודאו שכל עודפי המים סביב העוברים מוסרים.</li>
</ol>3. יישור עוברים וייבוש
<ol><li>הכינו ג'ל אגרוז בגודל 5 ס"מ x 5 ס"מ x 0.5 ס"מ (רוחב, אורך, גובה) 4% (איור 2A-9) ואפשרו לג'ל להתקרר לטמפרטורת החדר. חתכו גוש אגרוז בגודל 1 ס"מ x 3 ס"מ x 0.5 ס"מ (רוחב, אורך, גובה) באמצעות סכין גילוח נקי והניחו את הבלוק על מגלשת זכוכית (איור 2A-2). בדקו את גוש הג'ל מתחת לטווח החיתוך כדי לוודא שהקצוות חתוכים ישר והמשטח שטוח ויבש.</li>
	<li>העבירו עוברים מהמסננת אל גוש הג'ל באמצעות מברשת צבע. פזרו את העוברים באופן שווה לאורך קו האמצע של הבלוק על ידי הברשה עדינה. באופן אידיאלי, אשכולות של עוברים מופרדים ליחידים או כפולים מבלי לגעת זה בזה.</li>
	<li>הכינו פינצטה עם שתי רגליים המודבקות זו לזו בחוזקה כדי ליצור קצה דק אחד (איור 2A-5). תחת טווח ניתוח, הרימו עוברים בודדים באמצעות הפינצטה והניחו אותם לאורך הקצה הארוך של גוש הג'ל. יישרו 20-30 עוברים, וודאו שהציר הקדמי-אחורי שלהם מקביל לקצה (איור 2C).</li>
	<li>דבק פיפטה 10 μL הפטן (ראו טבלת חומרים) במרכז מכסה בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ (איור 2A-1) ומורחים את הדבק לאזור מלבני בגודל 0.5 ס"מ x 3 ס"מ באמצעות קצה פיפטה. יש להמתין לייבוש מוחלט של הדבק לפני השימוש.</li>
	<li>הניחו את מגלשת הזכוכית עם גוש הג'ל בקצה השולחן, כשהעוברים פונים כלפי חוץ. הרימו את הכיסוי עם דבק באמצעות פינצטה שטוחה (איור 2A-6) והחזיקו אותו עדיין על גבי העוברים, כשצד הדבק פונה לכיוון העוברים בזווית הטיה של כ-45 מעלות. הערה: לחץ בעדינות על הכיסוי כנגד גוש הג'ל כך שהעוברים יהיו במגע עם הדבק, ולאחר מכן שחרר במהירות את הלחץ והרם את הכיסוי. כמות המתח המופעלת היא קריטית כדי שניתן יהיה לחבר את העוברים ביציבות לדבק מבלי להילחץ חזק מדי ולהתפוצץ.</li>
	<li>פיפטה 10 μL מים במרכז מגלשת זכוכית חדשה והניחו את הכיסוי עם העוברים מעליו, כשצד העובר פונה כלפי מעלה (איור 2B). יש להקפיד להשתמש במים במקום בלק או דבק דבק אחר להדבקת הכיסוי למגלשת הזכוכית, שכן צד זה של הכיסוי יונח ישירות על גבי העדשה הקונפוקלית לצורך הדמיה חיה.</li>
	<li>יבשו את העוברים בתא התייבשות (איור 2A-3) (ראו טבלת חומרים) במשך 10-15 דקות עד שהקרום הוויטליני יתקמט (איור 2E). הזמן הנדרש עשוי להשתנות עם לחות החדר ויש לבדוק אותו באופן ניסיוני עבור כל תנאי מעבדה.</li>
	<li>פיפטה 40 מיקרוליטר שמן הלוקרבון (תערובת מסוג 27 וסוג 700 ביחס של 1:1 בנפח, ראה טבלת חומרים) בקצה אחד של רצועת העובר. הטו את המגלשה עד ששמן ההלוקרבון יכסה את כל פני השטח של העוברים.</li>
</ol>4. הזרקת נוגדנים והדמיה
<ol><li>הכינו כמה מחטי זכוכית להזרקה באמצעות מושך מיקרופיפטה (ראו טבלת חומרים להגדרות הפרמטרים) וטענו כל מחט בתמיסת נוגדנים עם תווית AlexaFluor 5 μL (משלב 1.6).</li>
	<li>הניחו כיסוי בגודל 25 מ"מ x 25 מ"מ על גבי מגלשת זכוכית. פיפטה 40 μL של שמן halocarbon ולהפיץ אותו לאורך קצה הכיסוי.</li>
	<li>מתחת לטווח ההזרקה, יישרו את קצה המחט כנגד קצה הכיסוי מתחת לשמן. התאימו את לחץ האוויר בהזרקה של משאבת הפיקו (ראו טבלת חומרים) כך שמשאבה אחת תייצר בועה אחת מלאה בנוגדנים. קוטר הבועות צריך להיות מוגבל ל-20-50 מיקרומטר (איור 2F).</li>
	<li>החליפו את מגלשת הזכוכית הריקה במגלשה המכילה עוברים תחת שמן. יישרו את קצה מחט ההזרקה בניצב לציר הקדמי-אחורי של העוברים (איור 2D,G).</li>
	<li>בדקו את שלב העוברים כדי לוודא שרובם התחילו בצלולריזציה אך עדיין לא התחילו בגסטרולציה (שלב 4 ושלב 5), ונותרו כסינקיטיום (איור 2F,G). הערה: סימן ההיכר של שלב זה הוא היעדר חריצים או קפלים ונוכחות של שק חלמון בצורת אליפסה, בצבע כהה הנראה במרכז העובר. אפיון מורפולוגי של שלב העובר תחת שמן מבוסס על פרק הספר "שלבים של אמבריוגנזה דרוזופילה" מאת פולקר הרטנשטיין17.</li>
	<li>השתמש במניפולטור שלב X-Y כדי להזיז עוברים לכיוון המחט עד שהקצה מגיע למרכז החלמון. יש לשאוב פעמיים עד שלוש כדי להזריק נוגדנים לחלמון. הזרקה מוצלחת מסומנת על-ידי היעלמות מהירה של קמט קרום ויטלין כאשר עוברים צוברים נפח מתמיסת הנוגדנים (איור 2G).</li>
	<li>השתמש במניפולטור שלב X-Y כדי להזיז עוברים מהמחט לאחר ההזרקה ולעבור כלפי מטה לעובר הבא. חזור על שלב 6 עד להזרקת כל העוברים בשקופית.</li>
	<li>העבירו את שקופית הזכוכית עם עוברים מוזרקים לתא לחות (איור 2A-8). יש לדגור בטמפרטורה של 25°C עד להשגת השלב הרצוי של התפתחות העובר.</li>
	<li>הרימו את הכיסוי בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ, החליקו מעל מגלשת הזכוכית והניחו אותו ישירות במחזיק המגלשה של המיקרוסקופ. הצד ללא עוברים יעמוד מול המטרות. אתר את העוברים באמצעות עדשה בהגדלה נמוכה תחת תאורת שדה בהיר ועבור לעדשת 40x או 63x להדמיה חיה פלורסנטית ברזולוציה גבוהה.</li>
</ol>

שיפור הדמיית חלבונים באמצעות הדמיה חיה בתיווך נוגדנים

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginnings+of+immunofluorescence.">The beginnings of immunofluorescence.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).</li><li>Arthur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+the+antibody.">Harnessing the power of the antibody.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biobanking,+methods+and+protocols.">Biobanking, methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).</li><li>Ragkousi, K., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+integrity+and+cell+division:+Concerted+cell+cycle+control.">Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control.</a> Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).</li><li>Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+dividing+cell+and+its+neighbors+regulates+adherens+junction+formation+during+cytokinesis+in+epithelial+tissue.">Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue.</a> Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+aequorea.">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea.</a> Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Boshart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+very+strong+enhancer+is+located+upstream+of+an+immediate+early+gene+of+human+cytomegalovirus.">A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus.</a> Cell. 41 (2), 521-530 (1985).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Rodriguez, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+and+glowing+toolbox+of+fluorescent+and+photoactive+proteins.">The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).</li><li>Berg, E. A., Fishman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+antibodies+using+N+-Hydroxysuccinimide+(NHS)-fluorescein.">Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).</li><li>Saerens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+universal+VHH+framework+to+graft+non-canonical+antigen-binding+loops+of+camel+single-domain+antibodies.">Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).</li><li>Loncar, D., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localisations+of+the+CPTI+collection+of+YFP-tagged+proteins+in+Drosophila+embryos.">Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos.</a> Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).</li><li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos.">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).</li><li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos.">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster.">The embryonic development of Drosophila melanogaster.</a> , 9-102 (1997).</li><li>Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Notch-mediated+proliferation+circuitry.">The Notch-mediated proliferation circuitry.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).</li><li>Kopan, R., Ilagan, X. G., Ma, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Notch+signaling+pathway:+unfolding+the+activation+mechanism.">The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism.</a> Cell. 137 (2), 216-233 (2009).</li><li>Fehon, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Struhl, G., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+is+required+for+activity+and+nuclear+access+of+Notch+in+Drosophila.">Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila.</a> Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).</li><li>Henrique, D., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Notch+signaling:+a+simple+logic+deployed+in+time+and+space.">Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space.</a> Development. 146 (3), dev172148 (2019).</li><li>Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-lineage+fate+decisions+involve+of+notch+receptors+basal+to+the+midbody+in+drosophila+sensory+organ+precursor+cells.">Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells.</a> Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).</li><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases+and+phosphatases:+The+Yin+and+Yang+of+protein+phosphorylation+and+signaling.">Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling.</a> Cell. 80 (2), 225-236 (1995).</li><li>Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+phosphotyrosine.">Monoclonal antibodies to phosphotyrosine.</a> Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).</li><li>Hunter, T., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induces+rapid+tyrosine+phosphorylation+of+proteins+in+A431+human+tumor+cells.">Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells.</a> Cell. 24 (3), 741-752 (1981).</li><li>Yu, H. H., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abl+and+Canoe/Afadin+mediate+mechanotransduction+at+tricellular+junctions.">Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions.</a> Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).</li><li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+contractions+of+an+actin&#8211;myosin+network+drive+apical+constriction.">Pulsed contractions of an actin&#8211;myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

הליך מוצג זה מתאר את השיטה המיוחדת של תיוג פלואורסצנטי עם נוגדנים מותאמים אישית והזרקה לאחר מכן לעוברי דרוזופילה בשלב מוקדם. טכניקה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של חלבונים או שינויים לאחר תרגום הקיימים בכמויות נמוכות ובדרך כלל קשה לצפות בהם באמצעות שיטות תיוג GFP/mCherry קונבנציונליות.
<p cla...

אימונופלואורסנציה היא טכניקת אבן פינה בביולוגיה התאית המודרנית שפותחה במקור על ידי אלברט קונס, המאפשרת זיהוי מולקולות בתאי התא הטבעיים שלהן ואפיון ההרכבים המולקולריים של אברונים תת-תאיים או מכונות1. יחד עם מניפולציות גנטיות, immunofluorescence מסייע לבסס את הרעיון המקובל כיום כי לוקליזציה של חלבונים חיונית לתפקודו2. מלבד נוגדנים ראשוניים ספציפיים וצבעים פלואורסצנטיים בהירים, הצלחתה של טכניקה זו נשענת על תהליך מקדים בשם קיבוע וחדירה, המשמר מורפולוגיות תאיות, משתק אנטיגנים ומגביר את נגישות הנוגדנים למדורים תוך תאיים. באופן בלתי נמנע, תהליך הקיבוע והחדירה יהרוג תאים ויסיים את כל התהליכים הביולוגיים3. לכן, immunofluorescence רק מספק תמונות של מסע החיים של חלבונים. עם זאת, תהליכים ביולוגיים רבים כגון נדידת תאים וחלוקות הם דינמיים באופיים, ודורשים חקירה של התנהגויות חלבונים באופן מרחבי-זמני 4,5.
כדי לבחון דינמיקה של חלבונים באורגניזמים חיים, פותחו שיטות הדמיה חיות המבוססות על חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)6 ומיקרוסקופ קונפוקלי מהיר. בקצרה, ניתן לבצע מניפולציה גנטית של החלבון המעניין כדי להתיך אותו עם GFP7, ולאחר מכן לבטא אותו באופן אקטופי ממקדמי נגיפים או שמרים כגון ציטומגלווירוס (CMV)8 או רצף הפעלה במעלה הזרם (UAS)9. מכיוון ש-GFP הוא אוטופלואורסצנטי בטבעו, אין צורך בנוגדנים מצומדים לפלואורופור כדי לחשוף את הלוקליזציה של חלבוני המטרה, מה שעוקף את הצורך בתהליכים מקדימים של קיבוע או חלחול. במהלך שני העשוריםהאחרונים פותחו תגים פלואורסצנטיים המשתרעים על פני כל ספקטרום אורך הגל, המאפשרים הדמיה חיה מרובת צבעים של מספר חלבוני מטרה בו זמנית. עם זאת, בהשוואה לצבעים פלואורסצנטיים מהונדסים כימית כגון AlexaFluor או ATTO, האוטופלואורסצנטיות של חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית אלה חלשה יחסית ובלתי יציבה כאשר היא באה לידי ביטוי ממקדמים אנדוגניים, במיוחד במהלך הדמיה חיה על פני טווחי זמן ארוכים יותר10. בעוד שניתן למתן את המחסור הזה על ידי ביטוי יתר של חלבוני מטרה המתויגים באופן פלואורסצנטי, רבים מהם עם פעילויות אנזימטיות כגון קינאזות ופוספטזות משבשים באופן חמור תהליכים ביולוגיים נורמליים אם אינם באים לידי ביטוי ברמות פיזיולוגיות.
פרוטוקול זה מציג שיטה המאפשרת הארה של מטרות מבוססות נוגדנים במערך תמונה חיה, ולמעשה מאפשרת אימונופלואורסצנטיות ללא תהליך של קיבוע או חדירה (איור 1). באמצעות תגובת אמין ראשוניתפשוטה מבוססת NHS 11, ניתן להצמיד צבעים פלואורסצנטיים כגון AlexaFluor 488 או 594 עם כל נוגדן ראשוני או GFP/HA/Myc nanobody12. תוך ניצול תכונה התפתחותית שכל התאים העובריים של דרוזופילה חולקים ציטופלסמה משותפת בשלבהסינקיטיום 13, ניתן להשיג קשירה והארה של אנטיגן על פני עוברים שלמים לאחר הזרקת נוגדנים מצומדים. עם הרחבת ספריות של חלבונים מתויגים אנדוגניים הזמינים בדרוזופילה ובמערכות מודל אחרות14, שיטה זו יכולה להרחיב את היישומים של ספריות אלה על ידי חשיפת דינמיקה של חלבונים מתויגים פלואורסצנטית בשפע נמוך וחלבונים אחרים שאינם מתויגים פלואורסצנטית (HA/Myc-tagged) ברקמות חיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>&#160;A620014&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A20185</td>
			<td>Purification column from step 1.6 is included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Microscope</td>
			<td>SOPTOP</td>
			<td>EX20</td>
			<td>Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox&#174;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccation chamber&#160;</td>
			<td>LOCK&#38;LOCK</td>
			<td>HSM8200</td>
			<td>320ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Mshot</td>
			<td>MZ62</td>
			<td>Eyepiece lens: WF10X/22mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Super Tweezer</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>ST-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Superfrost&#8482; Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>33A-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2198-1L</td>
			<td>Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration reagent&#160;</td>
			<td>TOKAI</td>
			<td>1-7315-01</td>
			<td>Fill to 90% volume of the dessication chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. 
			Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV 830</td>
			<td>Eject: 20 psi;&#160; Range: 100ms; Duration: timed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PY20</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dishes</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing low-abundance proteins and post-translational modifications in living drosophila embryos via fluorescent antibody injection

הדמיה של חלבונים בתאים חיים באמצעות GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) ותגים פלואורסצנטיים אחרים שיפרה מאוד את ההבנה של לוקליזציה של חלבונים, דינמיקה ותפקוד. בהשוואה לאימונופלואורסנציה, הדמיה חיה משקפת בצורה מדויקת יותר לוקליזציה של חלבונים ללא ממצאים פוטנציאליים הנובעים מקיבוע רקמות. חשוב לציין כי הדמיה חיה מאפשרת אפיון כמותי וזמני של רמות החלבונים ולוקליזציה, החיוניים להבנת תהליכים ביולוגיים דינמיים כגון תנועת תאים או חלוקתם. עם זאת, מגבלה עיקרית של גישות תיוג פלואורסצנטי היא הצורך ברמות ביטוי חלבון גבוהות מספיק כדי להשיג הדמיה מוצלחת. כתוצאה מכך, חלבונים פלואורסצנטיים רבים המתויגים אנדוגנית עם רמות ביטוי נמוכות יחסית אינם ניתנים לזיהוי. מצד שני, ביטוי חוץ רחמי באמצעות מקדמי נגיפים יכול לפעמים להוביל לחוסר לוקליזציה של חלבונים או שינויים תפקודיים בהקשרים פיזיולוגיים. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, מוצגת גישה המשתמשת בזיהוי חלבון בתיווך נוגדנים רגישים ביותר בעוברים חיים, ולמעשה מבצעת אימונופלואורסצנטיות ללא צורך בקיבוע רקמות. כהוכחה עקרונית, ניתן לדמיין בהצלחה קולטן Notch עם תג GFP אנדוגני שבקושי ניתן לגילוי בעוברים חיים לאחר הזרקת נוגדנים. יתר על כן, גישה זו הותאמה כדי להמחיש שינויים פוסט-תרגומיים (PTM) בעוברים חיים, המאפשרים לזהות שינויים זמניים בדפוסי זרחן טירוזין במהלך אמבריוגנזה מוקדמת ולחשוף תת-אוכלוסייה חדשה של פוספוטירוזין (p-Tyr) מתחת לקרומים אפיים. ניתן לשנות גישה זו כך שתתאים לנוגדנים ספציפיים אחרים לחלבון, ספציפיים לתגים או ספציפיים ל-PTM, ועליה להתאים לאורגניזמים אחרים הניתנים להזרקה או לקווי תאים. פרוטוקול זה פותח אפשרויות חדשות להדמיה חיה של חלבונים בעלי שפע נמוך או PTM שבעבר היה מאתגר לזהות באמצעות שיטות תיוג פלואורסצנטיות מסורתיות.

Immunofluorescence is a cornerstone technique of modern cell biology originally developed by Albert Coons, which enables the detection of molecules at their native cellular compartments and characterization of the molecular compositions of subcellular organelles or machineries1. Coupled with genetic manipulations, immunofluorescence helps establish the now well-accepted concept that protein localization is essential for its function2. Aside from specific primary antibodies and bright fluorescent dyes, the success of this technique relies on a preliminary process named fixation and permeabilization, which preserves cellular morphologies, immobilizes antigens, and increases the accessibility of antibodies into intracellular compartments. Inevitably, the fixation and permeabilization process would kill cells and terminate all biological processes3. Therefore, immunofluorescence only provides snapshots of the life journey of proteins. However, many biological processes such as cell migration and divisions are dynamic in nature, requiring investigation of protein behaviors in a spatial-temporally resolved manner4,5.
To examine protein dynamics in living organisms, live imaging methods based on genetically encoded fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP)6 and high-speed confocal microscopes have been developed. Briefly, the protein of interest can be genetically manipulated to be fused with GFP7, and then ectopically expressed from viral or yeast promoters such as cytomegalovirus (CMV)8 or upstream activation sequence (UAS)9. Because GFP is autofluorescent in nature, no fluorophore-coupled antibodies are required to reveal the localization of target proteins, which bypasses the necessity of preliminary processes of fixation or permeabilization. Over the last two decades, fluorescent tags spanning the whole spectrum of wavelength have been developed10, enabling multi-color live imaging of several target proteins at the same time. However, compared to chemically engineered fluorescent dyes such as AlexaFluor or ATTO, the autofluorescence of these genetically encoded fluorescent proteins is relatively weak and unstable when expressed from endogenous promoters, especially during live imaging over longer time scales10. While this shortfall can be mitigated by over-expressing fluorescently tagged target proteins, many with enzymatic activities such as kinases and phosphatases severely disrupt normal biological processes if not expressed at physiological levels.
This protocol presents a method that enables photostable antibody-based target illumination in a live image setup, essentially allowing immunofluorescence without the process of fixation or permeabilization (Figure 1). Through a simple NHS-based primary amine reaction11, one can conjugate fluorescent dyes such as AlexaFluor 488 or 594 with essentially any primary antibody or GFP/HA/Myc nanobody12. Taking advantage of a developmental feature that all Drosophila embryonic cells share a common cytoplasm during the syncytium stage13, one can achieve antigen binding and illumination across entire embryos after the injection of dye-conjugated antibodies. With expanding libraries of endogenously tagged proteins available in Drosophila and other model systems14, this method can potentially broaden applications of these libraries by revealing dynamics of low-abundance fluorescently tagged proteins and other non-fluorescently tagged (HA/Myc-tagged) proteins in living tissues.

מחבר זרקור: חשיפת הדינמיקה של אותות מכניים וביוכימיים במחקר מורפוגנזה של בעלי חיים 

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

We aim to understand how mechanical and biochemical signals correlate animal morphogenesis, including the detection and the response to forces by cells and molecules. More molecules have been discovered to be mechanosensitive, functioning differently under varying levels of tension. However, the physiological context and the function of these force-sensitive events remain largely unknown.Due to the dynamic nature of force-sensitive events, our field largely relies on high-speed fluorescence imaging and time-lapse recording to capture molecular and cellular behaviors. Many fluorescently-tagged proteins are not bright enough to be imaged, and it requires spatial-temporal resolution without significant bleach. On the other hand, traditional immunofluorescence methods can only capture a snapshot of molecular and cellular fixture after fixation.This method paves the way to dynamically track the localization of many low-abundance protein receptors of major signaling pathways, such as Notch, Wnt, and the BMP pathways. Eventually, in addition to the traditional linear signaling cascades, we can pinpoint and where the signaling events occur at the subcellular scales.

כדי להדגים את היתרונות של שיטת הזרקת הנוגדנים על פני הדמיה חיה מבוססת תג פלואורסצנטי או אימונופלואורסנציה, ניתנים שני מקרי מבחן המאפיינים את הלוקליזציה הדינמית של קולטן טרנסממברנה בשפע נמוך, Notch, וסוג של שינוי לאחר תרגום הנקרא זרחן טירוזין בעוברים חיים.
פעילות איתות חריץ מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

אנו שואפים להבין כיצד אותות מכניים וביוכימיים מתואמים בין מורפוגנזה של בעלי חיים, כולל זיהוי ותגובה לכוחות של תאים ומולקולות. מולקולות נוספות התגלו כרגישות למכנו, המתפקדות באופן שונה תחת רמות שונות של מתח. עם זאת, ההקשר הפיזיולוגי ותפקודם של אירועים רגישים אלה לכוח עדיין אינם ידועים במידה רבה.בשל האופי הדינמי של אירועים רגישים לכוח, התחום שלנו מסתמך במידה רבה על דימות פלואורסצנטי במהירות גבוהה והקלטה בהילוך מהיר כדי ללכוד התנהגויות מולקולריות ותאיות. חלבונים רבים המתויגים באופן פלואורסצנטי אינם בהירים מספיק כדי שניתן יהיה לצלם אותם, והם דורשים רזולוציה מרחבית-טמפורלית ללא אקונומיקה משמעותית. מצד שני, שיטות אימונופלואורסצנטיות מסורתיות יכולות ללכוד תמונה של מתקן מולקולרי ותאי רק לאחר קיבוע.שיטה זו סוללת את הדרך למעקב דינמי אחר לוקליזציה של קולטני חלבון רבים בעלי שפע נמוך של מסלולי איתות עיקריים, כגון Notch, Wnt ומסלולי BMP. בסופו של דבר, בנוסף למפל האיתות הליניארי המסורתי, אנו יכולים לאתר והיכן מתרחשים אירועי האיתות בסקאלות התת-תאיות.

visualizing-low-abundance-proteins-post-translational-modifications

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

671 Views.  SUSTech University. אנו שואפים להבין כיצד אותות מכניים וביוכימיים מתואמים בין מורפוגנזה של בעלי חיים, כולל זיהוי ותגובה לכוחות של תאים ומולקולות. מולקולות נוספות התגלו כרגישות למכנו, המתפקדות באופן שונה תחת רמות שונות של מתח. עם זאת, ההקשר הפיזיולוגי ותפקודם של אירועים רגישים אלה לכוח עדיין א...

Video: מחבר זרקור: חשיפת הדינמיקה של אותות מכניים וביוכימיים במחקר מורפוגנזה של בעלי חיים 

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.