نشكر اميلي ألف كيلي رئيس لتصميم لوحة. نحن ممتنون للدعم من المعاهد الوطنية للصحة لجوائز HAG : PO1 MH64570 ، RO1 MH56838 ، RO1 MH078989 ، R21 MH03851 والدعم السخي للصندوق Waasdorp جيفري الأعصاب للأطفال والتي بدونها لن هذا العمل لم يكن ممكنا. وتمول من قبل المعاهد الوطنية للصحة بأنقرة (EY019277) ، ومؤسسة وايتهول ، وP. ألفريد سلون ومؤسسة جائزة شهادة في العلوم الطبية الحيوية من صندوق ويلكوم بوروز. وتمول من قبل MET دي فون LA RECHERCHE EN دو كيبيك سانتي (FRSQ) ما بعد الدكتوراه جائزة التدريب. سوق دبي المالي هو متدرب في برنامج التدريب الطبي العلماء ، بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة T32 GM07356 وAI049815 T32.

1. إعداد الحيوانية للتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في تجاربنا ، ونحن نستخدم الكبار 3 CX CR الفئران GFP 1 / + التي يمكن استخدامها في التعبير عن GFP الأنساب الخلايا وحيدة النواة ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة. 4 سلالات مختلفة من الفئران لتلبية احتياجات مشروع معين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من مزيج يتألف من المخدرات three الفنتانيل ملغم / كغم 0.05 ، 5.0 ملغم / كغم الميدازولام ، و 0.5 Medetomidine ملغم / كغم. 5 التحضير الجراحي ليبدأ بعد TSCW الحيوان لم يعد يستجيب للمؤثرات المؤلمة ، مثل كما قرصة الذيل. طوال الجراحة والتصوير ، وعلينا أن نحافظ على الحيوان على وسادة تدفئة لمنع ما بعد التخدير انخفاض حرارة الجسم. إذا لزم الأمر ، يمكن لجرعة منشطة من ثلث إعطاء الجرعة الأصلي للكوكتيل مخدر لاستعادة الطائرة مخدر الأصلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية أعين الحيوان مع مرهم للعين وقائية للحفاظ على العينين رطبة أثناء التخدير ، الذي يكبت المنعكس الحيوان الوميض. إزالة الشعر من فروة الرأس للحيوان باستخدام شفرة حلاقة ، ومقصات ، ومقص ، أو أساليب كيميائية. تطهير فروة الرأس باستخدام 10 ٪ محلول البوفيدون اليودي والايثانول 70 ٪. جميع الأدوات الجراحية يلزم تعقيمها ، معقم للتعقيم الزجاج حبة ، أو تطهيرها مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق خط الوسط من فروة الرأس باستخدام مقص صغير ، بدءا 4-5 ملم الذيلية في الجمجمة والمضي قدما إلى الأمام إلى الأمام من وجهة نظر. المهم أن هذا الشق طويلة بما فيه الكفاية أن الجلد لن تتدخل مع لصق لوحة الرأس التي تستخدم لتحقيق الاستقرار في رأس الفأر خلال جلستين الفوتون التصوير (الشكل 1). تحديد المنطقة لتكون ضعيفة تحت نطاق تشريح. تجنب المناطق ذات الاهتمام تقع مباشرة عبر خيوط الجمجمة ، والجمجمة وأقل استقرارا في هذه المناطق والأسباب الكامنة السفن الكبيرة والسحايا وسوف تتداخل مع التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الإيثانول بنسبة 100 ٪ تليها حل 10 ٪ من كلوريد الحديديك مع مسحة القطن المعقم لتجف الأغشية على قمة الجمجمة وتتخلص منهم بعيدا باستخدام الملقط الغرامة أو شفرة حلاقة. فشل لإزالة النتائج غير المستقرة في الأغشية رئيس مرفق لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبقة رقيقة من الغراء 910 Permabond حول حواف الإطار عرض لوحة تحت الرأس. مكان لوحة مغطاة الرأس الغراء فوق منطقة الفائدة على جمجمة الحيوان مع الضغط الخفيف (الشكل 1). من المهم أن يتم لصقها فقط لوحة التوجه الى عظمة الجمجمة. فإن أي الجلد أو الأغشية التي اشتعلت بين لوحة جمجمة الرأس وانخفاض في استقرار السندات. تنطبق على كمية صغيرة من اكريليت حول نافذة عرض لاستخدام حقنة الفور السندات الغراء. أخيرا ، وتطبيق كمية صغيرة من وكتايت 454 إلى حواف الإطار عرض لمنع التسريبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المسمار لوحة رئيس لصاحب الحيوان (الشكل 1) وتحقق الاستقرار في لوحة الرأس تحت نطاق تشريح التي تحقق باستخفاف مع زوج من الملقط. يجب أن يكون هناك أي تحرك من الجمجمة النسبي إلى لوحة الرأس. وضع قطرة من المياه المالحة على نافذة عرض لضمان عدم وجود تسربات. </li></ol> 2. إعداد إطار الجمجمة ضعيفة القشرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعدادا لترقق الجمجمة وجافة الجمجمة باستخدام مزيج من مسحات القطن المعقم والهواء المضغوط. نحن في البداية رقيقة الجمجمة مع قليلا IRF العقيمة حفر حفر 007 في الثاني Microtorque مجموعة في 4000 دورة في الدقيقة. بلطف جدا ، تبدأ رقيق قطره ملم 2-2،5 منطقة دائرية من الجمجمة. استخدام الاقتراحات التي تجتاح الضوء الوحيد موازية تقريبا لالجمجمة ، واستخدام أي ضغوط مباشرة الهبوطي. وقف عمليات الحفر في كل ثانية 20-30 لإزالة الغبار العظام باستخدام الهواء المضغوط. هذه القطع في حفر تسمح للجمجمة لتبريد حتى لا يكون هناك أي ضرر الناجم عن الحرارة للأنسجة الدماغ الكامنة. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما تقدم الحفر ، لاحظ التحول إلى طبقة العظم الإسفنجي رطوبة (أي &quot;diploe&quot;). حالما يتم التوصل إلى هذه الطبقة ، وممارسة الحذر اضافية مع الحفر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاختيار أحيانا ركاكة من الجمجمة عن طريق وضع المالحة فوق منطقة ضعيفة وعرض ضمن نطاق تشريح. وسوف تتيح زيادة الملوحة تبديد الحرارة. كما ضعفت الجمجمة ، أصغر الأوعية الدموية تصبح مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأسنان microblade العقيمة لتحقيق النهائية رقيق تحت المالحة ، كما يوفر التغذية الراجعة microblade اللمس أكثر نحو الاستقرار في الجمجمة. وهذا يسمح للأرق بكثير من التحضيرات مع الحفر وحدها. من تجربتنا ، وسماكة الجمجمة الأمثل هو 10-30 ميكرومتر. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن المهم للتحقق من ركاكة من الجمجمة تحت عدة مرات خلال epifluorescence المحاولات القليلة الأولى في صنع نافذة الجمجمة رقيقة. من حدة وعمق الخلايا الدبقية الصغيرة وضوحا والأوعية الدموية تعطي مؤشرا جيدا بالنسبة إلى عندما تكون النافذة جاهزة للتصوير. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في إطار جاهز ، الغراء قطعة مستطيلة مصنوعة خصيصا لل# 0 ساترة واي<html> عشر بعدا من أقل من 2 ملم على كل جانب أكثر من النافذة. باستخدام ماصة 1.0 مم الزجاج ، ضع قطرة صغيرة من الغراء cyanoacrylate على منطقة الجمجمة ضعيفة وأقل بعناية أسفل قطعة صغيرة من ساترة ، ثم اضغط بلطف على الجمجمة إلى استنزاف كمية كبيرة من الصمغ. فمن المهم لتجنب تشكيل فقاعة بين الزجاج والغراء منذ الهواء المحبوس يؤدي إلى أن تصبح المنطقة تحت مبهمة بصريا. يتم استخدام الغراء cyanoacrylate لأنه لا يزال شفافا عندما تجف ، ويمنع كذلك إعادة نمو العظام والحفاظ على غشاء الجمجمة تحت النافذة رقيقة وشفافة. إذا كان هناك أي الغراء على أعلى من الزجاج غطاء ، استخدم microblade لإزالة بعناية لمرة واحدة لتغطية الزجاج في مكان والغراء جافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يدار على مسكن (على سبيل المثال ، البوبرينورفين 2 ملغم / كغم من الباطن cutaneously) فورا بعد الجراحة وإعادة تديرها في أي علامات الألم ، بما في ذلك عدم الرغبة في التحرك ، وتناول الطعام أو الشراب ، وفقدان الوزن ، واللعاب ، انتصاب الشعر ، والأصوات التنفسية ، إلخ </li></ol> 3. ثنائي الفوتون التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضيرا لمدة الفوتون التصوير ، مع تغطية TSCW المالحة وتحديد مجالات الاهتمام في إطار epifluorescence (الشكل 2). لتمكين التصوير اللاحقة في المنطقة ، التقاط صورة باستخدام كاميرا التصوير الفوتوغرافي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاثنين من الفوتون التصوير ، ونحن نستخدم عادة من صنع اثنين الفوتون المجهر مع تي 6 : ليزر الياقوت ضبطها ل920 نانومتر. تم الكشف عن مضان باستخدام أنبوب مضخم للضوء في وضع كشف كامل الحقل وتصفية الانبعاثات 580/180. ويتم استخدام مياه الغمر 20X عدسة (0.95 NA) طوال الدورة التصوير. يتم تعيين الحد الأقصى لانتاج الطاقة الليزر على الهدف بين 50 و 65 ميغاواط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد مساحة من الاهتمام في طبقات قشرية الأول أو الثاني (تصل إلى 150 ميكرومتر تحت سطح حنوني). لتسهيل إعادة التصوير ، والتقاط صور لنفس الحقل نظر في 2X ، 1X ، وتقريب رقمي 3X. الأوعية الدموية يمكن أن تكون بمثابة معالم للعثور بسهولة على نفس الحقل للعرض خلال جلسات التصوير لاحقة. يمكن تحت التكبير ، متعددة Z - 3X مع مداخن 80-90 سيتم شراؤها Z - الخطوات في كل خطوة ومكدس 0.69 ميكرون كل 5 دقائق لمدة تصل إلى 30 دقيقة ، والتي تمكن عينة جيدة من التشكل دبقية صغيرة والسلوك على مر الزمن ( الشكل 3). بين الاستحواذ على Z - المداخن ، ينبغي للمرء أن تحقق مستوى الملوحة على TSCW ، فضلا عن عمق الحيوان للتخدير. </li></ol> 4. حقن عصبي HIV - 1 ، تات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، silanize البطانة الداخلية للإبرة قياس 35 و 10 حقنة Microvolume ميكرولتر لمنع ترسب تات. سحب الحل silanizing (Sigmacote) حتى يملأ كل من الإبر والمحاقن. يسمح الحل للجلوس لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الحل فارغة من المحاقن ، وإزالة المكبس ، والسماح للالمحاقن والإبر حتى يجف تماما. أخيرا ، وغسل المحقنة والإبرة جيدا بالماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء حج القحف صغيرة قطرها 0.5 مم 3 مم إما منقاري أو الجانبية للTSCW حيث تم الحصول على صور ثنائية الفوتون ، باستخدام أصغر قليلا الحفر وترقق بعناية الجمجمة حتى زوج من ملقط مع نصائح حادة يمكن إزالة طبقة رقيقة من العظم بعيدا بسهولة. نحن نستخدم 10 المحاقن Microvolume ميكرولتر مزودة إبرة قياس 35 يسيطر عليها ضخ حقنة Ultramicropump الثالث شنت على micromanipulator من 3 محاور ، وبعد اصطفاف طرف الإبرة إلى حج القحف ، فمن المتقدمة بدقة على عمق 700-900 ميكرون أدناه السطح حيث حنوني 3 ميكرولتر تات 1-72 (أو غيرها من العوامل المؤيدة للالتهابات) أو المالحة (أو مراقبة المركبات) يتم تسليمها في 80 NL / دقيقة. </li></ol> 5. الحيوان الإسكان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان هذا الحيوان هو أن تكون التقط عدة مرات في يوم واحد ، تغطي مساحة مفتوحة من الجمجمة مع خليط من مرهم للعين والفازلين لمنع الإزعاج أو الأضرار التي لحقت في الجمجمة بين جلسات التصوير. قطع الجسر من دعم لوحة رأس الصغيرة (انظر الشكل 1B) ، ومكان للحيوان في قفص حرارة يمكن الوصول إليها بسهولة مع الطعام والماء. جميع الحيوانات ويتم توفير مساكن منفردة بعد عملية جراحية في جميع الأوقات. مرة واحدة في دورات التصوير للحيوان كاملة ليوم معين ، وإزالة بعناية كاملة وجها لوحة وخياطة الجلد إلى أكثر من الجمجمة مع # 6 أو أصغر خياطة. مرة أخرى ، البيت الحيوانات منفردة مع الغذاء والماء يمكن الوصول إليها بسهولة بين أيام التجريبية. التحقق من الحيوانات يوميا لأي علامات الاجهاد ، والألم ، أو العدوى. </li></ol> 6. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الحيوانية لتحقيق الاستقرار لعملية جراحية واثنين من الفوتون التصوير (A) ورئيس تصميم لوحة (B). <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. GFP المسمى تصور مع الخلايا الدبقية الصغيرة epifluorescence. jove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. GFP المسمى الخلايا الدبقية الصغيرة تصور مع اثنين من الفوتون التصوير بعد زرع TSCW ، ما يقرب من 50 ميكرومتر تحت سطح حنوني ، واحد ثنائي الفوتون المقاطع التي اتخذت 15-30 دقيقة بعد زرع TSCW (يوم 0) ، وكذلك 7 و 17 يوما في وقت لاحق ، على أن يبقى النوافذ واضح بينما تبقى الخلايا الدبقية الصغيرة المعطلة في غياب الشتائم للالتهابات. ض التوقعات التي اتخذت 6 و 24 ساعة بعد الحقن لفيروس نقص المناعة البشرية عصبي تغييرات مثيرة للإعجاب متبادلة المعرض المورفولوجي لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة شريط الحجم : 10 ميكرون.

<ol>
	<li>Mostany, R., &amp;amp, P. o. r. t. e. r. a. -. C. a. i. l. l. i. a. u., C, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. 12, (2008).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, (2009).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).</li><li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).</li><li>Mrsic-Flogel, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity.">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-96 (2007).</li><li>Majewska, A., Yiu, G., &amp;amp, Y. u. s. t. e., R, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system.">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pflugers Arch. 441, 2-3 (2000).</li><li>Sharer, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+HIV-1+infection+of+the+central+nervous+system.">Pathology of HIV-1 infection of the central nervous system.</a> A review. J Neuropathol Exp Neurol. 51, (1992).</li><li>Everall, I. P., Aliberti, J., &amp;amp, B. a. l. c. e. r. z. y. k., M, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+density+in+the+superior+frontal+and+temporal+gyri+does+not+correlate+with+the+degree+of+human+immunodeficiency+virus-associated+dementia.">Neuronal density in the superior frontal and temporal gyri does not correlate with the degree of human immunodeficiency virus-associated dementia.</a> Acta Neuropathol (Berl. 88, 538-53 (1994).</li><li>Masliah, E., Banati, R. B., &amp;amp, Q. u. i. n. l. a. n., M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+injury+is+a+pathological+substrate+for+human+immunodeficiency+virus-related+cognitive+disorders.">Dendritic injury is a pathological substrate for human immunodeficiency virus-related cognitive disorders.</a> Ann Neurol. 42, 963-96 (1997).</li><li>Everall, I. P., Banati, R. B., &amp;amp, U. p. e. n. d. e. r., B, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+synaptic+density+is+reduced+in+mild+to+moderate+human+immunodeficiency+virus+neurocognitive+disorder.">Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder.</a> Brain Pathol. 9, (1999).</li><li>Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &amp;amp, M. c. A. r. t. h. u. r., C, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+in+the+brain:+correlations+with+dementia.">Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia.</a> Ann Neurol. 38, (1995).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, (2000).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هناك اجماعا متزايدا على ان الركيزة الفعلية لHIV - 1 عجز عصبي المرتبطة بها (اليد) هو تدمير البنية متشابك ، المفترض أنها ناتجة عن التهابات وسطاء الموالية للصدر من HIV - 1 البالعات وحيدات النوى المصابة. تعتبر التنشيط دبقية صغيرة ، والخلايا العملاقة multinucleated ، ونظرا لتضخم دباق نجمي بصمات غير محدد من HIV - 1 العدوى والالتهابات في الجهاز العصبي المركزي 7. في المقابل ، ارتبط شدة المرض العصبي سابق للموت مع فقدان متشابك من التعقيد ، فضلا عن عبء البلاعم في الجهاز العصبي المركزي 8،9،10،11. ومع ذلك ، التفاعلات الدينامية بين الخلايا الدبقية الصغيرة ، الطرفية التسلل الضامة ، والخلايا العصبية لدى المرضى الذين يعانون HAND ببساطة لا يمكن أن تكون على غرار باستخدام المعالجة التقليدية الثابتة التي تم الحصول عليها من دراسات immunocytochemical التقليدية. وقد اقترحت الدراسات الحديثة من مختبراتنا التي يمكن أن تكون على غرار ما لا يقل عن بعض من هذه التفاعلات بين الخلايا وحيدة النواة المركزية والطرفية ، والخلايا العصبية في جزء منه عن طريق الحقن المجسم للبروتين HIV - 1 تات 1-72 في حمة الدماغ (لو ، ماركر ، تريمبلي ، تشي ، وGelbard ، بيانات غير منشورة). ولذلك قررنا أن تطبق في مجال التصوير فيفو الفوتون اثنين إلى دراسة التفاعل بين الوحيدات المستمدة الضامة ، الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ والخلايا العصبية المقيمين ، في نموذج حيوان صغير الانقياد لneuroAIDS. في حين أن الأعمال التحضيرية مفتوحة الجمجمة أو ضعفت الجمجمة وتحمل فحص واحد للعمارة القشرية لفترة وجيزة من الزمن (ساعة) ، والمحققين المهتمين دوام الأحداث تحت الحاد لا يمكن استخدام هذه المستحضرات دون تفعيل artifactually الخلايا الدبقية الصغيرة / بلعم بسبب التلاعب الجراحي نافذة قبي. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة بسيطة للتحايل هذه القيد بواسطة لصق قطعة صغيرة من الزجاج ساترة فوق منطقة الجمجمة ضعيفة منع من تجديد القبة في TSCW فضلا عن الحفاظ على شبه الشفافية لأسابيع 3 ≥. نظهر أيضا أن هذه التقنية تسمح لنا بمراقبة سلوك حيدات الطرفية دخول microvasculature الدماغي وكذلك الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ المقيم في الاستجابة لحقن المجسم من فيروس نقص المناعة البشرية 1-72 تات في القشرة من الفئران متخالف لCX CR 3 / 1 GFP ( لتحديد الخلايا وحيدة النواة من النسب). ويمكن بسهولة أن تتكيف هذه التقنية لاستخدامها في الفئران مع خلفيات وراثية مختلفة ، على سبيل المثال ، فإننا نستخدم عادة متخالف CX CR 3 / 1 GFP خاصتك X - 1 12 YFP الفئران لتحقيق التفاعل بين الوحيدات المستمدة الضامة ، الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الدماغ والخلايا العصبية في النماذج الحية من neuroinflammation ذات الصلة في متناول اليد. استعدادنا TSCW يسمح للمحققين لدراسة الخلية خلية التفاعلات بين المحيط والجهاز العصبي المركزي التي قد تحدث على مدى فترات من أسبوعين ، التي يمكن من خلالها تصوير الحيوان مرارا قبل وبعد العلاج التجريبي. وبالتالي ، يمكن لكل حيوان بمثابة ايقاعه. التحذير واحد لهذا النموذج TSCW هو أن الخلايا المستهدفة في إطار التحقيق بحاجة إلى أن يكون إما وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية محسن (eXFP) أو أن يكون المسمى مع صبغة الفلورسنت دون الإخلال الميكانيكية من القبة ، وأنه يجب أن يكون التعبير eXFP قوية بما يكفي ل تسمح العمارة الخليوي الى أن تصور بعد دورات التصوير المتكرر على مدى فترة من أسابيع.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hospira</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Midazolam hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medetomidine hydrocholoride (Domitor)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pfizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating pads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beyond Bodi Heat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Povidone-iodine 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Betadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ferric chloride 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical Company</td>
<td>3120-32</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cyanoacrylate 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Permabond</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 454</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtorque II handpiece kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pearson</td>
<td>R14-0002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IRF 007 drill bits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Norland bendable microblade full radius</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salvin Dental</td>
<td>BLAD-NORLAND-69</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The Original Superglue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#0 glass coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>63750-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Microvolume syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>ILS010LT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>UMP3-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 gauge NanoFil needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>NL35BL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ball Mill, Carbide bits #1/4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501860</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sigmacote</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>SL2-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photomultiplier tube </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>HC125-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ti:Sapphire laser Mai-Tai</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectra-Physics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation

تقليديا في علم الأعصاب في الجسم الحي وقد اشتركت رابطتان التصوير فوتون للنظام العصبي المركزي الفئران إما استخدام مفتوح 1،2 الجمجمة أو ضعفت الجمجمة - 3 التحضيرات. في حين أن الجمجمة المفتوح تقنية متعددة جدا ، فإنه ليس الأمثل لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة لأنها الغازية ويمكن أن يسبب تنشيط دبقية صغيرة. على الرغم من أن نهج ضعفت - الجمجمة مينيملي ، وتكرار إعادة ترقق الجمجمة المطلوبة للتصوير المزمن يزيد من مخاطر الاصابة الأنسجة وتنشيط دبقية صغيرة ويسمح لعدد محدود من جلسات التصوير. هنا نقدم مزمن أسلوب النافذة رقيقة الجمجمة لرصد الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران الحية على مدى فترة طويلة من الوقت باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. نحن لشرح كيفية إعداد وميسرة مستقرة وضعيفة ، الجمجمة النافذة القشرية (TSCW) مع ساترة الزجاج الشفاف الذي لا يزال apposed على مدى ثلاثة اسابيع من المراقبة على فترات متقطعة. هذا التحضير هو أكثر بكثير TSCW خامل مناعيا مع الاحترام لتفعيل دبقية صغيرة من حج القحف أو فتح الجمجمة المتكررة رقيق ويسمح لعدد من جلسات التصوير التعسفي خلال فترة زمنية تصل إلى أسابيع. نحن نستعد TSCW في 3 CX CR + 1 الفئران GFP / 4 لتصور الخلايا الدبقية الصغيرة مع بروتين الفلورية الخضراء لتعزيز 150 ميكرومتر ≤ تحت سطح حنوني. نعرض أيضا أنه يمكن استخدام هذا الإعداد بالاشتراك مع حقن الدماغ المجسم للبروتين HIV - 1 أعصاب تات ، بجوار TSCW ، وهي قادرة على إحداث microgliosis دائم. ولذلك ، فإن هذه الطريقة مفيدة جدا لدراسة التغيرات في التشكل والحركة دبقية صغيرة مع مرور الوقت في الدماغ الذين يعيشون في نماذج من اضطراب عصبي المرتبطين بفيروس نقص المناعة البشرية (اليد) وغيرها من الأمراض العصبية التي تحتوي على عنصر neuroinflammatory.

Watch this Scientific Journal Video about A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation at JoVE.com

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

نحن تصف طريقة لتصور مرارا الفئران الخلايا الدبقية الصغيرة وتعميم حيدات<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; على مدى الأيام ، ساعات أو أسابيع باستخدام العابر لاثنين الفوتون المجهري. نحن لشرح كيفية إعداد إطار ضعفت - الجمجمة التي تتيح مراقبة متقطعة من الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة التي يمكن تفعيلها عن طريق الحقن المجسم المتاخمة للتات HIV - 1 البروتين التنظيمية.

تقنية نافذة رقيقة الجمجمة لالمزمنة ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران نماذج من Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

a-thin-skull-window-technique-for-chronic-two-photon-vivo-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

23.4K Views.  University of Rochester. نحن تصف طريقة لتصور مرارا الفئران الخلايا الدبقية الصغيرة وتعميم حيدات في الجسم الحي على مدى الأيام ، ساعات أو أسابيع باستخدام العابر لاثنين الفوتون المجهري. نحن لشرح كيفية إعداد إطار ضعفت - الجمجمة التي تتيح مراقبة متقطعة من الخلايا الدبقية الصغيرة ها?...

Video: A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

ضعفت-الجمجمة وتقنيات النافذة القشرية لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; البصرية بالاتساق التصوير المقطعي التصوير

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

في فيفو الميكروسكوب ثنائي الفوتون من النهايات العصبية في الجلد واحدة

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

في وقت واحد ثنائي الفوتون<em&gt; في فيفو</em&gt; تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

الكمي من الشلل الأوعية الدموية العمارة باستخدام ثنائي الفوتون المجهري في نموذج الفأر من Neuroinflammation التي يسببها فيروس نقص المناعة البشرية

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

تصوير الفوتون عبر الحدقة في الجسم الحي لشبكية العين الفأرية

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...