أدوار الخلايا الدبقية الصغيرة في الحصين ليست مفهومة تماما بعد. يمكن لهذا البروتوكول أن يصور مباشرة كيفية اتصال الخلايا الدبقية الصغيرة وتنظيم الخلايا العصبية. كان التصوير في الجسم الحي للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في الحصين صعبا للغاية.
هذه الطريقة يمكن أن تحل هذه المشكلة. لزرع نافذة المراقبة ، قم بعمل أخدود دائري ثلاثة ملليمترات على الجمجمة باستخدام لكمة جلدية ، مما يضمن محاذاة الأخدود مع المنطقة المحددة مسبقا. عندما تصل اللكمة الجلدية إلى الطبقة الأعمق من الجمجمة قبل لمس الجافية الأساسية ، ارفع الجزيرة العظمية المركزية برفق باستخدام إبرة قياس 30.
بعد ذلك ، قم بإزالة الجافية بعناية باستخدام منتقي الجافية. نضح الحنون والأوعية الشعرية والأنسجة القشرية من السطح. حافظ على عمق سطح الأنسجة المكشوف متجانسا على نافذة الجمجمة بأكملها وقم بتعميق الشفط تدريجيا حتى تتعرض ألياف الكبسولة الخارجية.
بعد وضع طرف الشفط على الكبسولة الخارجية بالقرب من البطين الجانبي في الطرف الوردي الجانبي للنافذة القحفية ، قم بإزالة الطبقة السطحية للكبسولة الخارجية التي تعمل في الذيلية إلى الاتجاه الوردي الجانبي. ثم قم بإزالة الطبقة الداخلية التي تعمل في الاتجاه المتوسط. تأكد من إزالة الكبسولة الخارجية بأكملها عن طريق التحقق من التعرض الكامل لسطح الحويصلات الهوائية والحصين الظهري.
بعد التأكد من توقف النزيف تماما ، املأ الحفرة بمحلول ملحي معقم إلى مستوى سطح الجمجمة. بعد ذلك ، أدخل الأنبوب المعدني ذو القاع الزجاجي عموديا في الفتحة أثناء شفط الماء الزائد الذي يفيض من جوانب الأنبوب حتى يضغط القاع الزجاجي برفق على الحويصلات الهوائية ويسوي جزئيا CA1 الأساسي. باستخدام أسمنت راتنج الأسنان ، ثبت جدار الأنبوب المدرج على الجمجمة المحيطة.
اضبط الماوس في جهاز تثبيت الرأس تحت العدسة الموضوعية للمجهر ثنائي الفوتون وعلى مرحلة المسح الضوئي XY الآلية. ثم املأ الفراغ بين القاع الزجاجي والعدسة الشيئية بالماء دون إنشاء فقاعات هواء. اضبط التركيز على CA1 بتوجيه من التألق المنبعث من حمة الدماغ والضوء المنعكس من حافة الأنبوب المعدني تحت الإضاءة المستمرة بواسطة الليزر النبضي.
اضبط زاوية رأس الماوس عن طريق إمالة جهاز إمساك الرأس بحيث يكون الجزء السفلي الزجاجي موازيا لمستوى التصوير. ثم اضبط طوق التصحيح للهدف لتحقيق أعلى دقة على عمق الهيكل المستهدف في CA1. بعد ذلك ، تأكد من أن الخلايا الفلورية في الطبقة الجزيئية للتلفيف المسنن أو DG على عمق 500 ميكرومتر من قاع الزجاج يتم تصويرها في مجال الرؤية بأكمله.
فقط في حالة إجراء عملية جراحية ناجحة ، يمكن اكتشاف إشارات DG على الفور. رفع الماوس بعد العملية الجراحية في السكن الفردي لعدة أسابيع. اضبط الماوس المخدر تحت المجهر ثنائي الفوتون.
إجراء تصوير الحصين. تأكد مما إذا كانت جودة وشدة الصور التي تم التقاطها بعد الحد من الوذمة بعد العملية الجراحية أفضل أو يمكن مقارنتها بتلك التي تم التقاطها في يوم الجراحة. تأكد من أن الخلايا الدبقية الصغيرة قد استعادت مورفولوجيتها المتشعبة.
ثم قم بإجراء التصوير في الجسم الحي على طبقة الاهتمام في CA1. لم تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران CX3CR1-GFP التي تم التقاطها مباشرة بعد الجراحة أي تنشيط بارز. بعد الجراحة الناجحة دون تحريض الوذمة ، تجاوزت أعماق التصوير ثنائي الفوتون طبقات CA1 بأكملها ووصلت إلى 500 ميكرومتر من سطح الجراحة.
أظهرت الخلايا الدبقية الصغيرة في المرحلة المزمنة لأكثر من ثلاثة أسابيع بعد الجراحة كثافة ودقة فلورية أعلى وتوزيعا أكثر تجانسا بسبب انخفاض الوذمة والالتهاب. استعادت الخلايا الدبقية الصغيرة في جميع الطبقات بالفعل مورفولوجيتها المتشعبة وأظهرت أجساما خلوية غير متحركة وعمليات مشروطة للغاية. تم توفير الصور عالية الدقة على CA1 بأكمله لعدة أشهر.
تساعد الإشارات الصادرة من الخلايا الدبقية الصغيرة الفلورية في تحديد طبقات الحصين. كان للخلايا الدبقية الصغيرة في الحويصلات الهوائية أجسام خلوية ممدودة وعمليات تمتد على طول المسالك المحورية. يمكن تمييز الخلايا الدبقية الصغيرة في الطبقة الهرمية بكثافة أقل لعملياتها.
يمكن التعرف على الحدود بين CA1 و DG من خلال الأوعية الدموية السميكة التي تمتد على طول الحدود والتي تم التعرف عليها بشكل أفضل من خلال وضع علامات على الأوعية التي تحتوي على sulforhodamine 101. كمثال تطبيقي ، تم تصوير الخلايا الدبقية الصغيرة الإيجابية GFP والخلايا العصبية الهرمية المسماة tdTomato في وقت واحد. ساعد وضع العلامات العصبية على فهم هياكل الطبقة الدقيقة ل CA1.
النقطة الأكثر أهمية هي الحد من أضرار الجراحة. تجنب تلف الأنسجة عن طريق الشفط. اضغط برفق عند إدخال القاع الزجاجي وتجنب ملامسة الأسمنت السني لسطح الدماغ.
سيساعد هذا النهج في تحديد دور الخلايا الدبقية الصغيرة في الحصين. على سبيل المثال ، كيف تتفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة مع الخلايا العصبية ، وكيف تشارك في التعلم ، وكيف تتحكم في أمراض الدماغ.
