Damos las gracias a Emily A. Kelly para el diseño de la placa con la cabeza. Estamos muy agradecidos por el apoyo de premios NIH a HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 y el generoso apoyo del Fondo de Geoffrey Waasdorp Neurología Pediátrica, sin la cual este trabajo no habría sido posible. AKM es financiado por el NIH (EY019277), la Fundación de Whitehall, la Alfred P. Sloan Foundation y un premio de su carrera en las ciencias biomédicas del Fondo Burroughs Wellcome. MET es financiado por una Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) Premio formación postdoctoral. DFM es un aprendiz en el Programa Científico de formación de médicos, financiado por el NIH T32 GM07356 y AI049815 T32.

1. Preparación de los animales de la Imagen <ol><li> En nuestros experimentos, el uso de adultos CX 3 CR1 ratones GFP / + que expresan GFP en linajes de células mononucleares, incluyendo microglia. 4 cepas diferentes de ratones puede ser utilizado para satisfacer las necesidades de un proyecto específico. </li><li> Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de un cóctel de tres fármacos que consta de 0,05 mg / kg de fentanilo, 5,0 mg / kg de midazolam, y 0,5 medetomidina mg / kg. 5 Preparación quirúrgica para TSCW se inicia después de que el animal ya no responde a estímulos dolorosos, como una pizca de cola. A lo largo de la cirugía y la obtención de imágenes, mantener al animal en una almohadilla de calefacción para evitar la hipotermia post-anestesia. Si es necesario, una dosis de refuerzo de un tercio de la dosis original del cóctel anestésico se puede dar a restaurar el original plano anestésico. </li><li> Cubrir los ojos del animal con un ungüento oftálmico de protección para mantener los ojos húmedos durante la anestesia, que suprime reflejos del animal parpadea. Quitar el pelo del cuero cabelludo de los animales utilizando una navaja de afeitar, tijeras, tijeras, o los métodos químicos. Desinfectar el cuero cabelludo con un 10% de solución de povidona yodada y el 70% de etanol. Todos los instrumentos quirúrgicos deben ser esterilizados en autoclave, esterilizado con un esterilizador de bolas de cristal, o desinfectada con etanol al 70%. </li><li> Hacer una incisión en el cuero cabelludo con unas tijeras pequeñas, a partir de 4-5 mm de caudal en el cráneo y el avance hacia el frente de los ojos. Es importante que esta incisión ser lo suficientemente larga que la piel no va a interferir con el pegado de la placa de la cabeza que se utiliza para estabilizar la cabeza del ratón durante dos fotones magnética (Figura 1). Identificar el área a ser diluido con un microscopio de disección. Evite las áreas de interés directamente ubicado sobre las suturas craneales, como el cráneo es menos estable en estas áreas y los grandes vasos subyacentes y las meninges puede interferir con las imágenes. </li><li> Aplicar el 100% de etanol, seguido de 10% de solución de cloruro férrico con un hisopo de algodón estéril para secar las membranas en la parte superior del cráneo y raspar a la basura con unas pinzas finas o una hoja de afeitar. Si no se retiran los resultados de las membranas en la unión inestable la placa de la cabeza. </li><li> Coloque una capa delgada de la Permabond 910 pegamento alrededor de los bordes de la ventana de visualización por debajo de la placa de cabeza. Coloque la placa de la cabeza recubierta con pegamento sobre el área de interés en el cráneo del animal con una ligera presión (Figura 1). Es importante que la placa de la cabeza sólo está pegada a los huesos del cráneo. Cualquier piel o las membranas que se encuentran atrapados entre la placa de la cabeza y el cráneo disminuye la estabilidad del vínculo. Aplique una pequeña cantidad de acrilato de alrededor de la ventana de visualización con una jeringa al instante de bonos de la cola. Por último, aplique una pequeña cantidad de Loctite 454 a los bordes de la ventana de visualización para evitar fugas. </li><li> Atornille la placa de la cabeza a la titular de los animales (Figura 1) y comprobar la estabilidad de la placa de la cabeza con un alcance de la disección por la ligera sondeo con un par de pinzas. No debe haber movimiento de la cabeza en relación con la placa de la cabeza. Coloque una gota de solución salina en la ventana de visualización para garantizar que no haya fugas. </li></ol> 2. Preparación de la ventana del cráneo Diluido cortical <ol><li> En preparación para el adelgazamiento del cráneo, seca el cráneo usando una combinación de hisopos de algodón estériles y aire comprimido. Inicialmente delgada del cráneo con una broca de estériles IRF 007 en un simulacro de Microtorque II fijó en 4.000 rpm. Muy suavemente, comienza una zona de adelgazamiento mm 2-2.5 diámetro circular del cráneo. Use movimientos de barrido sólo la luz casi paralelo al cráneo, el uso sin presión a la baja directa. Detener la perforación cada 20-30 segundos para eliminar el polvo de hueso con el aire comprimido. Estas interrupciones en la perforación permiten que el cráneo que se enfríe para que no haya daños inducidos por el calor en el tejido cerebral subyacente. <ol class="lalpha"><li> A medida que la perforación avanza, el aviso de la transición a la capa de hueso esponjoso húmedo (es decir, el &quot;diploe&quot;). Una vez que esta capa se llega a tener cuidado extra con el taladro. </li></ol></li><li> De vez en cuando ver la delgadez de la cabeza mediante la colocación de solución salina en el área adelgazada y ver bajo el microscopio de disección. Solución salina también permitirá la disipación del calor. A medida que el cráneo se adelgaza, pequeños vasos se hace visible. </li><li> Use un MicroBlade dental estéril para alcanzar la final de adelgazamiento en solución salina, como el MicroBlade proporciona información mucho más táctil sobre la estabilidad del cráneo. Esto permite una preparación mucho más delgado que con el ejercicio solo. Desde nuestra experiencia, el grosor del cráneo óptima es de 10-30 micras. <ol class="lalpha"><li> Es importante comprobar la delgadez de la calavera bajo epifluorescencia varias veces durante los primeros intentos de hacer una ventana de cráneo fino. La nitidez y la profundidad de la microglia y los vasos visibles dará una buena indicación en cuanto a cuando la ventana está listo para la imagen. </li></ol></li><li> Una vez que la ventana esté listo, pegar un pedazo rectangular de medida de # 0 cubreobjetos wi<html> ª dimensión de menos de 2 mm en cada lado de la ventana. El uso de un 1,0 mm de diámetro pipeta de vidrio, coloque una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato en el área del cráneo adelgazado y cuidadosamente más abajo en la pequeña pieza de cubreobjetos, a continuación, presione suavemente contra el cráneo para expulsar el exceso de cantidad de la cola. Es importante evitar la formación de burbujas entre el vidrio y el pegamento ya que el aire atrapado hará que el área por debajo de convertirse ópticamente opaco. El pegamento de cianoacrilato se utiliza debido a que permanece transparente cuando se seca y también evita que los huesos y la regeneración de membrana manteniendo la cabeza debajo de la ventana delgada y traslúcida. Si hay algún tipo de pegamento en la parte superior de la cubierta de vidrio, utilizar el MicroBlade a extráigala con cuidado una vez que el cristal de la cubierta está en su lugar y la cola se seque. </li><li> Un analgésico (por ejemplo, buprenorfina 2 mg / kg por vía subcutánea) se administra inmediatamente después de la cirugía y volver a administrarse a cualquier signo de dolor, incluyendo la renuencia a moverse, comer o beber, pérdida de peso, salivación, piloerección, sonidos respiratorios, etc </li></ol> 3. De dos fotones de imágenes <ol><li> En la preparación de dos fotones de imágenes, cubrir el TSCW con solución salina y localizar el área de interés en epifluorescencia (Figura 2). Para habilitar imagen posterior de la zona, tomar una fotografía con una cámara fotográfica. </li><li> De dos fotones de imágenes, se utiliza una medida de dos fotones con un microscopio 6 Ti: Sapphire láser sintonizado a 920 nm. La fluorescencia es detectada mediante el uso de un tubo fotomultiplicador en el modo de detección de todo el campo y un filtro de emisión de 580/180. 20 veces el lente de inmersión en agua (0,95 NA) se utiliza a lo largo de la sesión de imágenes. La potencia máxima de la potencia del láser en el objetivo se encuentra entre 50 y 65 mW. </li><li> Seleccione un área de interés en las capas corticales I y II (hasta 150 m por debajo de la superficie pial). Para facilitar la re-imagen, tomar fotografías de un mismo campo de visión a 1X, 2X, 3X y zoom digital. Los vasos sanguíneos pueden servir como puntos de referencia para encontrar fácilmente el mismo campo de visión durante las sesiones de formación de imágenes posteriores. En virtud de un zoom de 3X, varios z-series con 80-90 Z-pasos en cada pila y un paso m 0,69 se puede adquirir cada 5 minutos durante 30 minutos, lo que permite una buena muestra de la morfología de la microglia y comportamiento en el tiempo ( Figura 3). Entre las adquisiciones de z-pilas, se debe verificar el nivel de solución salina en los TSCW, así como la profundidad de los animales de la anestesia. </li></ol> 4. La inyección de la neurotoxina del VIH-1, Tat <ol><li> En primer lugar, silanizar el revestimiento interior de una aguja de calibre 35 y 10 l jeringa microvolumen para prevenir la deposición Tat. Retirar la solución silanización (Sigmacote) hasta que se llene la aguja y la jeringa. Permita que la solución reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Vaciar la solución de la jeringa, retire el émbolo y permita que la jeringa y la aguja se seque por completo. Por último, lavar la jeringa y la aguja a fondo con agua destilada. </li><li> Realizar una craneotomía pequeño de 0,5 mm de diámetro o 3 mm rostral y lateral a la TSCW donde dos fotones imágenes se han obtenido, con una broca pequeña y cuidadosamente adelgazamiento del cráneo, hasta un par de pinzas con puntas afiladas pueden eliminar la capa diluida de los huesos con facilidad. Nosotros usamos una jeringa de 10 l microvolumen equipado con aguja de calibre 35 controlado por una bomba de jeringa Ultramicropump III montado en un micromanipulador de 3 ejes y después de alinear la punta de la aguja de la craneotomía, es cuidado a una profundidad de 700 a 900 micras por debajo de la superficie pial en 3 l Tat 1-72 (u otros agentes pro-inflamatorios) o solución salina (o de control del vehículo) se entrega el 80 nL / min. </li></ol> 5. Animal de Vivienda <ol><li> Si el animal va a ser fotografiada varias veces en un solo día, cubrir el área abierta del cráneo con una mezcla de ungüento oftálmico y vaselina para evitar molestias o daños en el cráneo entre las sesiones de formación de imágenes. Desconecte el puente de apoyo de la pequeña cabeza de la placa (ver Figura 1 B) y colocar el animal en una jaula con comida caliente y agua de fácil acceso. Todos los animales deben ser alojados individualmente después de la cirugía en todo momento. Una vez que las sesiones de formación de imágenes de un animal están completos para un día determinado, retire con cuidado toda la cabeza de la placa y la sutura de la piel sobre el cráneo por el n º 6 o menos de sutura. Una vez más, la casa de los animales por separado con los alimentos de fácil acceso y el agua entre los días experimentales. Compruebe los animales diariamente para detectar cualquier signo de estrés, dolor o infección. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Estabilización de animales para la cirugía y de dos fotones magnética (A) y el diseño de la placa de la cabeza (B). <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. GFP-etiquetados microglia visualiza con epifluorescencia. jove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. GFP-etiquetados microglia visualiza con dos fotones de imagen después de la implantación de la TSCW, a unos 50 m por debajo de la superficie pial. El single de dos fotones secciones tomadas de 15-30 minutos después de la implantación de la TSCW (día 0), así como 7 y 17 días después, demuestran que las ventanas se mantiene claro, mientras que la microglía permanecer inactiva en ausencia de insultos inflamatoria. El z-proyecciones tomadas 6 y 24 horas post-inyección de la neurotoxina del VIH tat impresionante exposición cambios morfológicos de la microglía activada. Barra de escala: 10 micras.

<ol>
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Existe un creciente consenso de que el sustrato real para el VIH-1 déficits neurocognitivos asociados (mano) es la destrucción de la arquitectura sináptica, presumiblemente causada por mediadores pro-inflamatorios liberados por el VIH-1 fagocitos mononucleares infectadas. Activación de la microglia, células gigantes multinucleadas, y gliosis debido a la hipertrofia astrocíticos se consideran características no específicas del VIH-1 infección y la inflamación en el sistema nervioso central 7. Por el contrario, la gravedad de la pre-mortem, la enfermedad neurológica se ha relacionado con pérdida de la complejidad sináptica, así como la carga de macrófagos en el sistema nervioso central 8,9,10,11. Sin embargo, la interacción dinámica entre la microglía, periféricos macrófagos infiltrantes, y de las neuronas en pacientes con la mano, simplemente no puede ser modelado utilizando procesos convencionales estáticos obtenidos de estudios convencionales de inmunohistoquímica. Estudios recientes de nuestro laboratorio han sugerido que al menos algunas de estas interacciones entre las células mononucleares periféricas y centrales y de las neuronas puede ser modelada en parte por la inyección estereotáxica de la epidemia del VIH-1 proteína Tat 1-72 en el parénquima cerebral (Lu, Marker, Tremblay, Qi, y Gelbard, datos no publicados). Por lo tanto, decidió aplicar en vivo imágenes de dos fotones para examinar la interacción entre los macrófagos derivados de monocitos, microglia residente del cerebro y las neuronas, en un modelo animal manejable pequeño para neuroSIDA. Mientras que las preparaciones abierta de cráneo o adelgazado cráneo-pagar un único examen de la arquitectura cortical por un breve período de tiempo (horas), los investigadores interesados ​​en el curso temporal de los eventos subaguda no puede utilizar estos preparados sin artefacto activar microglia / macrófagos debido a la manipulación quirúrgica de la ventana de la bóveda craneal. Aquí se demuestra de una manera simple de evitar estas limitaciones, pegando un pequeño trozo de cubreobjetos de cristal sobre el área del cráneo adelgazado la prevención de la bóveda craneal de la regeneración en el TSCW, así como el mantenimiento de la translucidez de ≥ 3 semanas. Además, demuestran que esta técnica nos permite monitorear el comportamiento de los monocitos periféricos de entrar en la microvasculatura cerebral, así como la microglía del cerebro reside en respuesta a la inyección estereotáxica de VIH Tat 1-72 en la corteza de ratones heterocigotos para CX 3 CR 1 / GFP ( para identificar las células mononucleares de linaje). Esta técnica se puede adaptar fácilmente para su uso en ratones con diferentes fondos genéticos, por ejemplo, nosotros usamos heterocigotos CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 ratones para investigar las interacciones entre los derivados de los monocitos macrófagos, microglia residente cerebro y las neuronas en en modelos in vivo de la neuroinflamación relevantes a mano. Nuestra preparación TSCW permite a los investigadores para estudiar interacciones célula-célula entre la periferia y sistema nervioso central que pueden ocurrir en períodos de semanas, en la que puede ser el animal repetidamente la imagen antes y después del tratamiento experimental. Por lo tanto, cada animal puede servir como su propio control. Una advertencia para este modelo TSCW es que las células diana objeto de la investigación deben ser modificados genéticamente para expresar mejor las proteínas fluorescentes (eXFP) o tener una etiqueta con un tinte fluorescente, sin violación mecánica de la bóveda craneal, y que la expresión eXFP debe ser lo suficientemente robusta como para permitir que la arquitectura celular que se visualizan después de las sesiones de imágenes repetidas durante un período de semanas.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hospira</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Midazolam hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medetomidine hydrocholoride (Domitor)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pfizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating pads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beyond Bodi Heat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Povidone-iodine 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Betadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ferric chloride 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical Company</td>
<td>3120-32</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cyanoacrylate 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Permabond</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 454</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtorque II handpiece kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pearson</td>
<td>R14-0002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IRF 007 drill bits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Norland bendable microblade full radius</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salvin Dental</td>
<td>BLAD-NORLAND-69</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The Original Superglue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#0 glass coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>63750-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Microvolume syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>ILS010LT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>UMP3-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 gauge NanoFil needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>NL35BL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ball Mill, Carbide bits #1/4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501860</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sigmacote</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>SL2-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photomultiplier tube </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>HC125-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ti:Sapphire laser Mai-Tai</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectra-Physics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation

Tradicionalmente, en la neurociencia, en vivo imágenes de dos fotones de la murino sistema nervioso central o bien implicó el uso de 1,2 abierto el cráneo o calavera adelgazado tres preparaciones. Mientras que la técnica del cráneo abierto es muy versátil, no es el óptimo para el estudio de la microglía, ya que es invasivo y puede causar la activación de la microglia. Aunque el enfoque adelgazado-cráneo es mínimamente invasiva, los repetidos re-adelgazamiento de cráneo requiere para obtener imágenes de crónica aumenta el riesgo de lesión de los tejidos y la activación de la microglia y permite un número limitado de sesiones de la imagen. Aquí les presentamos una crónica delgada del cráneo método de la ventana de control microglia murina in vivo durante un período prolongado de tiempo, usando la microscopía de dos fotones. Demostramos cómo preparar una estable y accesible, adelgazada-cráneo ventana cortical (TSCW) con un cubreobjetos se ponga de lo que queda transparente a lo largo de tres semanas de observación intermitente. Esta preparación es mucho más TSCW inmunológicamente inerte con respecto a la activación de la microglia que craneotomía abierta o el cráneo repetidas adelgazamiento y permite un número arbitrario de sesiones de imágenes durante un período de semanas. Preparamos TSCW en CX 3 CR1 GFP / + ratones de 4 a visualizar microglia con aumento de proteína verde fluorescente para ≤ 150 m bajo la superficie pial. También mostramos que esta preparación se puede utilizar en combinación con inyecciones cerebrales estereotáctica de la proteína Tat del VIH-1 neurotóxicos, al lado del TSCW, que es capaz de inducir microgliosis duradero. Por lo tanto, este método es muy útil para examinar los cambios en la morfología y motilidad de la microglia en el tiempo en el cerebro que viven en los modelos de trastorno neurocognitivo asociado VIH (mano) y otras enfermedades neurodegenerativas con un componente neuroinflamatorios.

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Se describe un método para visualizar repetidamente microglia murina y los monocitos circulantes<em&gt; In vivo</em&gt; Más de horas, días o semanas con transcraneal microscopia de dos fotones. Demostramos cómo preparar una ventana adelgazado-cráneo que permite la observación de la microglía en reposo intermitente que puede ser activada por inyección estereotáxica adyacentes del Tat del VIH-1 proteína reguladora.

Una delgada del cráneo ventana Técnica para la crónica de dos fotones En vivo Imágenes de la microglía murina en los modelos de la neuroinflamación

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

a-thin-skull-window-technique-for-chronic-two-photon-vivo-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

23.4K vistas.  University of Rochester. Se describe un método para visualizar repetidamente microglia murina y los monocitos circulantes In vivo Más de horas, días o semanas con transcraneal microscopia de dos fotones. Demostramos cómo preparar una ventana adelgazado-cráneo que permite la observación de la microglía en reposo intermitente que puede ser activada por inyección estereotáxica adyacentes del Tat del VIH-1 proteína reguladora.

Video: A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Investigación

Neurociencias

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluido-skull técnica de ventana cortical para<em&gt; En Vivo</em&gt; Tomografía de Coherencia Óptica de imagen

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

En Vivo De dos fotones microscopía de terminaciones nerviosas individuales en la piel

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Cuantificación de Cerebral Vascular Arquitectura utilizando microscopía de dos fotones en un modelo de ratón de la neuroinflamación inducida por el VIH

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...