عكس رد الفعل الناسخ بدوره كتلة التدفئة إلى 70-80 درجة مئوية و 42 درجة مئوية. ويمكن أيضا أن تستخدم حمامات المياه في هذه الخطوة. إذا باستخدام كتل التدفئة ، ووضع بعض الماء بحيث الحرارة موحدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رد فعل فتيلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 3 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط مستوى الصوت إلى 13 ميكرولتر مع المياه مجانا ريبونوكلياز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.5 ميكرولتر من الاشعال مسدوس العشوائي (2mg/mL) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج جيد واحتضان في 70-80 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. ثم ، ضع على الجليد لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الكوكتيل RT (14.5 ميكرولتر / rxn) : <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكون </td><td> حجم </td></tr><tr><td> 5X العازلة ستراند الأولى </td><td> 6 ميكرولتر </td></tr><tr><td> 0.1 M DTT </td><td> 3 ميكروليتر </td></tr><tr><td> 25X aminoallyl - dNTP مزيج </td><td> 1.2 ميكرولتر </td></tr><tr><td> RT مرتفع الثاني (200U/μl) </td><td> 2.3 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ماء </td><td> 2.0 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> * للحصول على ردود الفعل ن ، وإعداد ميكس الرئيسية للaliquots +0.5 ن من الكوكتيل لضمان أنك لن ينفد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى ردود فعل 14.5 ميكرولتر تبريده. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج (لا الدوامة) ، ويحضن في درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية إذا لزم الأمر. </li></ol> يتحلل RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة ، إضافة 3 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم N 1 و 0.6 ميكرولتر من EDTA M 0.5. (النهائي conc.s = هيدروكسيد الصوديوم 100mM ، 10MM EDTA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط واحتضان عند 65 لمدة 10 دقائق درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحييد بإضافة 33.6 HEPES 1M ميكرولتر ، ودرجة الحموضة = 7.0 (اضرب النهائي.= HEPES 500mM) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية ، إذا لزم الأمر. </li></ol> تنقية رد فعل : إزالة الفردية AA - dUTP والأمينات مجانا ملاحظة : يتم تعديل هذا البروتوكول من بروتوكول تنقية QIAquick Qiagen PCRpurification عدة. يتم استبدال غسل الفوسفات ومخازن مخازن للشطف Qiagen الموردة لأن مخازن تحتوي على الأمينات Qiagen الحرة التي تتنافس مع اقتران رد فعل قبرصي صباغة. ويمكن أيضا الأعمدة من مجموعة مصغرة الإعدادية استخدامها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> [كدنا] مزيج التفاعل مع 300 ميكرولتر (أو حجم رد الفعل 5X = 336 ميكرولتر) العازلة PB (Qiagen الموردة) ونقل إلى العمود QIAquick. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عمود في أنبوب جمع 2 مل (Qiagen الموردة) والطرد المركزي في دورة في الدقيقة ل13000 ~ 1 دقيقة. جمع أنبوب فارغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للاغتسال وغسل الفوسفات إضافة 750 ميكرولتر العازلة (لا Qiagen) إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي في دورة في الدقيقة ل13000 ~ 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفريغ أنبوب جمع وتكرار غسل 750 ميكرولتر وخطوة الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفريغ أنبوب جمع وأجهزة الطرد المركزي لعمود إضافي 1 دقيقة بأقصى سرعة ممكنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عمود إلى أنبوب جديد 1.5 مل microfuge بعناية وإضافة 30 شطف الفوسفات ميكرولتر العازلة. (انظر القسم حل الإعداد) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل بواسطة الطرد المركزي في دورة في الدقيقة ل13000 ~ 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل مرة ثانية (مع آخر ميكرولتر 30 من شطف العازلة الفوسفات) في أنبوب نفس الخطوات تكرار 6-8. ينبغي أن يكون حجم شطف النهائي ~ 60 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن قياس كمية [كدنا] في هذه المرحلة : [كدنا] = نانوغرام (عامل تمييع) (OD260) (37) (إجمالي حجم eluted من عمود) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العينة الجافة في سرعة بطالة في 45 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية إذا لزم الأمر. </li></ol> اقتران AA - [كدنا] [سي] إلى صبغ استر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend aminoallyl المسمى [كدنا] مع 10 ميكرولتر 50 ملي درجة الحموضة ، بيكربونات الصوديوم = 9.0 - إذا لزم الأمر. (وينبغي بذل هذا المخزن جديدة كل أسبوعين) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل في مكان مظلم ، إضافة إلى التحقيق أنبوب الصبغة قبرصي المناسبة. الماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لresuspend الصبغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان رد فعل لمدة 1 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. (الحضانة يمكن أن تصل إلى ساعتين) </li></ol> رد الفعل الثاني التنقية : إزالة الصبغة uncoupled <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى رد فعل 35 ميكرولتر 100 درجة الحموضة 5.2 ملي NaOAc. مزيج دقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر (أو حجم رد الفعل 5X = 225 ميكرولتر) العازلة PB (Qiagen الموردة) لكل عينة وتخلط بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان عمود الدوران QIAquick في أنبوب جمع 2 مل (Qiagen مرفق) ، تطبيق نموذج إلى عمود ، والطرد المركزي في ~ 13000 : 1 دقيقة. جمع أنبوب فارغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل ، إضافة 0.75 مل العازلة بي (Qiagen مرفق) إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي في ~ 13000 : 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب فارغ جمع وأجهزة الطرد المركزي لعمود 1 دقيقة إضافية في أقصى سرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عمود في مكان نظيف 1.5 مل أنبوب microfuge بعناية وإضافة 30 ميكرولتر EB العازلة (Qiagen مرفق) الى مركز للغشاء العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل بواسطة الطرد المركزي في دورة في الدقيقة ل13000 ~ 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل للمرة الثانية في الأنبوب نفسه بتكرارالخطوات 7-9. ينبغي أن يكون الحجم النهائي eluted ~ 60 ميكرولتر. </li></ol> تحليل ردود الفعل وصفها ويمكن قياس كمية [كدنا] والتسمية في هذه المرحلة : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 260 ، 550 و 650 (فارغ هو الماء.) استخدام برنامج nanodrop ميكروأري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب بمول التأسيس الأصباغ والحمض النووي ونسبة بمول مجلس التوحيد الوطنى / صبغ مع المعادلات الواردة أدناه : النيوكليوتيدات بمول = [OD260 * الحجم (ميكرولتر) * 37 نانوغرام / ميكرولتر * 1000 جزء من الغرام / نغ] / 324.5 بيكوغرام / بمول </li></ul> ملاحظة : 1 OD260 = 37 نانوغرام / ميكرولتر ل[كدنا] ؛ 324.5 بيكوغرام / بمول وزن جزيئي متوسط ​​dNTP) بمول Cy3 = حجم OD550 * (ميكرولتر) / 0.15 بمول Cy5 = OD650 * الحجم (ميكرولتر) / 0.25 النيوكليوتيدات / نسبة الصبغة = بمول [كدنا] / بمول قبرصي صبغ إذا كنت تستخدم nanodrop ، فإنه يعطي بالفعل بمول / ميكرولتر لكل صباغة. تحتاج فقط لمضاعفة هذا العدد من حيث الحجم الكلي للحصول على إدماج صبغ بمول. ملاحظة :&gt; 150-200 بمول التأسيس صبغ لكل عينة ونسبة أقل من 20 النيوكليوتيدات / جزيئات الصبغة هو الأمثل لالتهجين. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية في الظلام. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع تحقيقات المهجنة لتكون معا والجافة في أسفل speedvac حوالي 42 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للhyb. </li></ul></li></ul> قبل hyb الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان وجه الانزلاق على الماء RT 100 مل في حامل الشريحة الحمراء نظيفة لمدة 3-5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المفاجئة الجافة الشريحة من خلال وضع مواجهة على 100 درجة مئوية لتسخين كتلة بضع ثوان -- مشاهدة لالتكثيف إلى الزوال </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط الشريحة ب 250 mJoules (2500 أدخل إلى crosslinker الأشعة فوق البنفسجية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدرات الشرائح التي غمس في مرحلة ما قبل حرارة المياه 42 درجة مئوية. تدور 5 دقائق عند 700 دورة في الدقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح في جرة تحتوي على Coplin 50ml قبل تدفئته قبل hyb (5XSSC ، BSA 1 ٪ ، 0.1 ٪ SDS) ما لا يقل عن 45 دقيقة @ 42 درجة مئوية ويمكن ، وحضانة يذهب لفترة أطول إذا لزم الأمر. 50 مل قبل hyb العازلة : 12.5 مل 20X SSC ، 10 مل BSA 5 ٪ ، و 0.5 مل SDS 10 ٪ ، و 27 مل من الماء </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشرائح في مرحلة ما قبل حرارة المياه (42 درجة مئوية) ، وتستنهض الهمم بضع دقائق لإزالة ما قبل hyb العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الأيزوبروبانول وتدور 5 دقائق عند 700 دورة في الدقيقة ، درجة حرارة الغرفة ، وجفاف. </li></ol> إعداد العينات للتهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend التحقيق في الماء (يتم إعطاء كميات أدناه) <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> لمجموع المجلد. = 30μl </td><td> لمجموع المجلد. = 35μl </td><td> لمجموع 40μl المجلد.= </td><td></td></tr><tr><td> 19.8 ميكرولتر المياه </td><td> 23.55 المياه ميكرولتر </td><td> 27.2 ميكرولتر المياه </td><td> </td></tr><tr><td> 1.5 ميكرولتر </td><td> 1.5 ميكرولتر </td><td> 1.5 ميكرولتر </td><td> 10 الحيوانات المنوية السلمون ملغ / مل الحمض النووي (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1.2 ميكرولتر </td><td> 1.2 ميكرولتر </td><td> 1.2 ميكرولتر </td><td> 12.5 ملغ / مل الحمض الريبي النووي النقال </td></tr><tr><td> 4.5 ميكرولتر </td><td> 5.25 ميكرولتر </td><td> 6 ميكرولتر </td><td> 20XSSC (3X النهائي) </td></tr><tr><td> 3 ميكروليتر </td><td> ميكرولتر 3.5 </td><td> 4 ميكرولتر </td><td> 1 ٪ SDS </td></tr></tbody></table> ملاحظة : ترتيب إضافة الكواشف هامة. لا تحضير مزيج الرئيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغلي لمدة 5 دقائق ، وتدور ثم 5 دقائق في 14000 دورة في الدقيقة. تبرد لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> تهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10-12 ميكرولتر من SSC 3X إلى آبار للغرفة التهجين وعلى كل حافة في الوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة زلة رافعة النظيفة إلى منطقة مناسبة لشريحة وتحميل بلطف في محلول التهجين (30 -40 ميكرولتر). يجب أن يكون هناك إما عينة اضافية على حافة الانزلاق الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشريحة في الغرفة. تضييق الخناق ووضع في حمام الماء 65 درجة مئوية خلال الليل. لا مكان للغرفة مباشرة على الجزء السفلي من حمام الماء. وضع على رأس كتلة من الغرفة العلوية لاجراء كل شيء في مكانه. إبقاء الغطاء على حمام مائي لحماية العينات ضوء الحساسة. </li></ol> Hyb الغسلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المخازن التالية : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X SSC ، SDS 0.05 ٪ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.06 X SSC </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التهجين غرفة الحضانة فضها. إزالة الشريحة من الغرفة ، مع الحرص على عدم تعكير صفو ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة coverslips ، والشرائح يغرق في صحن يحتوي على الحارة 1X SSC ، 0.05 ٪ العازلة غسل SDS ساترة تواجه قاع الطبق. سوف تسقط ساترة عن طريق تحريك الجانب الانزلاق الى جنب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة ساترة ، ضع الشريحة في رف حمام جديدة مع الحزب الديمقراطي الصربي 1XSSCm الدافئة 0.05 ٪. تستنهض الهمم لبضع دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح بالإضافة إلى رف الحمام SSC X 0.06. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح إلى آخر باعشر من 0.06 X SSC تحتوي على الرف الطازجة والنشاف الشريحة على منشفة ورقية لإزالة قدر SDS العازلة التي تحتوي على قدر الإمكان قبل وضعه في حوض الاستحمام جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستنهض الهمم الشرائح لبضع دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور على الفور في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الدقيقة 700 @ ، ثم الشرائح على استعداد للفحص. مخزن في الظلام حتى الممسوحة ضوئيا. </li></ol>

<ol>
	<li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for.">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> Microarrays &amp; TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , .</li><li>Gilbert, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+&amp;+Hybridization+of+probed+labels.">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays &amp; Hybridization of probed labels.</a> , .</li><li>Hedge, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II.">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , .</li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>AA-dUTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A0410</td>
<td>5-(3-aminoallyl)-2&#x2019;deoxyuridine-5&#x2019;-triphosphate</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>27-2035-01</td>
<td>100 mM dNTP Set PCR grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Random Hexamer primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>27-2166-01</td>
<td>3mg/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>SuperScript III RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>80800444</td>
<td>200U/&#x03BC;L</td>
</tr>
<tr>
<td>CyDye&#x2122;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>RPN5661</td>
<td>Post-Labelling Reactive Dye Pack</td>
</tr>
<tr>
<td>QIAquick</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28104</td>
<td>PCR Purification kit</td>
</tr>
<tr>
<td>1M K2HPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M KH2PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M KPO4</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:
9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate wash buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.
** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate elution buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Carbonate Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.
Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

bacterial gene expression analysis using microarrays

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays at JoVE.com

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

التحليل الجرثومي التعبير الجيني عن طريق ميكروأرس]

bacterial-gene-expression-analysis-using-microarrays

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Views.  University of California Santa Cruz - UCSC. 

Video: Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

Analogous to metagenomics, environmental transcriptomics (metatranscriptomics) retrieves and sequences environmental mRNAs from a microbial assemblage without prior knowledge of what genes the community might be expressing. Thus it provides the most unbiased perspective on community gene expression in situ. Environmental transcriptomics protocols are technically difficult since prokaryotic mRNAs generally lack the poly(A) tails that make isolation of eukaryotic messages relatively straightforward 1 and because of the relatively short half lives of mRNAs 2. In addition, mRNAs are much less abundant than rRNAs in total RNA extracts, thus an rRNA background often overwhelms mRNA signals. However, techniques for overcoming some of these difficulties have recently been developed. A procedure for analyzing environmental transcriptomes by creating clone libraries using random primers to reverse-transcribe and amplify environmental mRNAs was recently described was successful in two different natural environments, but results were biased by selection of the random primers used to initiate cDNA synthesis 3. Advances in linear amplification of mRNA obviate the need for random primers in the amplification step and make it possible to use less starting material decreasing the collection and processing time of samples and thereby minimizing RNA degradation 4. In vitro transcription methods for amplifying mRNA involve polyadenylating the mRNA and incorporating a T7 promoter onto the 3 end of the transcript. Amplified RNA (aRNA) can then be converted to double stranded cDNA using random hexamers and directly sequenced by pyrosequencing 5. A first use of this method at Station ALOHA demonstrated its utility for characterizing microbial community gene expression 6.

We present a method for generating cDNA from environmental mRNA. In general, total RNA is first collected from the environment, rRNA is selectively removed, mRNA is selectively amplified, and cDNA synthesized from the enriched mRNA pool is sequenced. Recovered sequences can be annotated using standard bioinformatics techniques to identify the expressed genes.

تحليل الجينات من المجتمعات الميكروبية البحرية باستخدام Transcriptomics البيئية

Analogous to metagenomics, environmental transcriptomics (metatranscriptomics) retrieves and sequences environmental mRNAs from a microbial assemblage ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 2 of 3.

الوقس عدوى الفيروس والتحليل الزمني في التعبير الجيني الفيروسات : الجزء 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

عزل الحمض النووي الريبي من الجنينية التجميعي واسماك الزرد [كدنا] لتحليل الجينات

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

تحليل التعبير الجيني العالمي باستخدام ميكروأري قليل النوكليوتيد منهاج اسماك الزرد

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

تحليل التعبير الجيني في الحفار الرماد الزمرد ( Agrilus planipennis) عن طريق ريال الكمية من الزمن - PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

الجينوم على نطاق تحليل المستويات (شحن) من الحمض الريبي النووي النقال باستخدام Aminoacylation ميكروأرس]

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...