転写酵素反応を逆に 70から80への加熱ブロックを回し° Cと42℃水浴も、このステップで使用することができます。加熱ブロックを使用する場合、熱が均一になるように水を入れる。 <ol><li>プライミング反応<ol><li> RNAの3μgを取る</li><li> RNaseフリーの水で13μlにボリュームを調整</li><li>ランダムヘキサマープライマー（2mg/mL）2.5μlを加え、 </li></ol></li><li>よく混和して、8分間70〜80℃でインキュベートする。その後、氷上で5分間置きます。 </li><li> RTカクテルを（14.5μL/ RXN）を準備します。 <table border="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td> 5Xファーストストランドバッファー</td><td> 6μlの</td></tr><tr><td> 0.1 M DTT </td><td> 3μlの</td></tr><tr><td> 25Xアミノアリル- dNTPミックス</td><td> 1.2μL </td></tr><tr><td>のSuperScript II RT（200U/μl） </td><td> 2.3μL </td></tr><tr><td>水 </td><td> 2.0μL </td></tr></tbody></table> * nの反応では、あなたが不足しないことを保証するためにカクテルのn個の0.5アリコートのためにマスターミックスを調製する。 </li><li>冷却反応は14.5μlを添加します。 </li><li>ミックス（ボルテックスしない）と℃で3-4時間、42でインキュベート</li><li>必要に応じてサンプルを-20℃で保存することができます。 </li></ol>加水分解RNA <ol><li>各サンプルに、1 N NaOH及び0.5 M EDTAを0.6μlの3μlを加える。 （決勝conc.s = 100mMのNaOHを、10mMのEDTA） </li><li>混合し、インキュベート65℃で10分間。 </li><li> 33.6μlの1M HEPESを添加することにより中和、pH値= 7.0（最終濃度.=約500mmのHEPES） </li><li>サンプルは、必要に応じて-20℃で保存することができます。 </li></ol>反応の精製：非法人AA - dUTPの除去と、遊離アミン 注 ：この精製プロトコールは、キアゲンQIAクイックのPCRpurificationキットのプロトコルから変更されます。キアゲンのバッファがCyの染料のカップリング反応と競合する遊離アミンを含んでいるため、リン酸塩の洗浄および溶出バッファーは、キアゲン供給されたバッファに代入されます。ミニプレップキットから列を使用することもできます。 <ol><li> 300μlの（または5X反応体積= 336μl）のバッファーPB（キアゲン付属）でcDNA反応を混合し、QIAクイックカラムに移す。 </li><li> 2 mlのコレクションチューブにカラム（キアゲン社提供）を配置し、1分間〜13,000 rpmで遠心する。空のコレクションチューブ。 </li><li>洗浄のため、1分間〜13,000 rpmでカラムと遠心に750μlのリン酸塩の洗浄バッファー（ではないQiagenの）を追加します。 </li><li>コレクションチューブを空にし、750μlの洗浄と遠心分離のステップを繰り返します。 </li><li>コレクションチューブを空にし、列の最大速度で、追加1分遠心する。 </li><li>新しい1.5mlマイクロチューブにカラムを移し、慎重に、30μlのリン酸塩の溶出バッファーを添加します。 （溶液調製の項を参照） </li><li>室温で1分間インキュベートする。 </li><li> 1分間〜13,000 rpmで遠心分離して溶出します。 </li><li>手順6〜8を繰り返すことによって、同じチューブにもう一度（リン酸塩の溶出バッファーの別の30μlのある）溶出。最後の溶出量は約60μLにする必要があります。 </li><li> cDNAの量は、この段階で定量することができる。 ngのcDNAを=（希釈率）（OD260）（37）（カラムから溶出した総量） </li><li> 45℃VACスピードで乾燥したサンプル℃に</li><li>必要に応じてサンプルを-20℃で保存することができます。 </li></ol>ダイエステルをCyにAA - cDNAのカップリング<ol><li>再懸濁し、10μlの50mMのナトリウム - 炭酸水素塩、pH値= 9.0、必要に応じてcDNAをアミノアリル標識。 （このバッファは隔週で新鮮なされるべきである） </li><li>暗い場所での作業、適切なのCy色素のチューブにプローブを追加します。ピペッティングを数回は、色素を再懸濁します。 </li><li>室温、暗所で1時間反応をインキュベートする。 （インキュベーションは、2時間ほど行くことができる） </li></ol>反応精製II：非結合色素の除去<ol><li>反応に35μlの100mMのNaOAcのpHは5.2を追加します。充分に混合する。 </li><li>ピペッティングすることにより、各試料と混合して250μlの（または5X反応体積= 225μl）をバッファPB（キアゲン付属）を追加します。 </li><li> 2 mlのコレクションチューブにQIAクイックスピンカラム（キアゲン社提供）を配置し、カラムにサンプルを適用し、1分間〜13,000間遠心。空のコレクションチューブ。 </li><li>洗浄のため、1分間〜13,000で、列と遠心に0.75 mlのBuffer PE（キアゲン付属）を追加します。 </li><li>手順4を繰り返します。 </li><li>空のコレクションチューブと最大速度で追加の1分間の遠心カラム。 </li><li>場所は、新しい1.5 mlマイクロ遠心チューブ内の列と慎重にカラムのメンブレンの中央に30μlのBuffer EB（Qiagen社提供）を追加します。 </li><li>室温で1分間インキュベートする。 </li><li> 1分間〜13,000 rpmで遠心分離して溶出します。 </li><li>繰り返すことによって、同じチューブに二度目の溶出ステップ7-9最後の溶出量は約60μLにする必要があります。 </li></ol>ラベリング反応の解析 cDNAの量とラベルは、この段階で定量することができる。 <ul><li> OD 260、550、650（ブランクは水です。）㈱エルマイクロアレイのプログラムを使用して測定します。 </li><li>染料の取り込みと下記の式でpmolのDNAと色素/ NUC比のpmolを計算します。 pmolのヌクレオチド= [OD 260 *体積（μL）* 37 ng /μLの* 1000 PG / NG] / 324.5 PG / pmolの</li></ul> 注 ：1 OD260 cDNAのための= 37 ng /μLの、dNTPの324.5 PG / pmolの平均分子量） pmolのCy3標識= OD550 *体積（μL）/ 0.15 pmolのCy5標識= OD650 *体積（μL）/ 0.25 ヌクレオチド/染料比= pmolのピコモル/ cDNAのCyの染料あなたが光度計を使用している場合、それはすでにμL/ pmolの各色素のために与える。あなただけの合計pmolの色素の取り込みを取得するにはボリュームでこの数値を乗算する必要があります。 注 ：染料、サンプルあたりの取り込みと20未満のヌクレオチド/色素分子の比率の&gt; 150から200 pmolのは、ハイブリダイゼーションに最適です。 <ul><li>サンプルは、暗所で-20℃で保存することができます。 <ul><li>一緒にハイブリダイズするプローブを組み合わせて、42℃speedvacでダウン乾燥℃の</li><li>サンプルはふたに準備するまで-20℃で保存することができます。 </li></ul></li></ul>プリふたのスライド<ol><li> 3-5分のためのクリーン赤スライドホルダーの場所のスライド側を下にRT以上100mLの水</li><li>数秒のために100℃の加熱ブロックに表向きに配置することにより、スライドを乾燥させるスナップ - 結露が消えるまで待ってください</li><li> UVクロスリンク250 mJoules（UVクロスリンカーに2500を入力してください）​​で、スライド</li><li>予め温めておいた42℃の水中に浸漬することによって水和物スライド。 RTで700 RPMで5分間スピン。 </li><li>必要に応じて、少なくとも45分@ 42℃、およびインキュベーションのために予め温めておいたプリふた（5XSSC、1％BSA、0.1％SDS）を含む50ミリリットルコプリンジャーにスライドをインキュベートすると、長く行くことができます。 50mLのプリふたバッファ：12.5 mLを20 × SSC 10 mlの5％BSA、0.5 mlの10％SDS、27 mLの水 </li><li>ディップ予め温めておいた水（42℃）でのスライドとは、事前にふたのバッファを削除するには、数分撹拌。 </li><li>乾燥するために、イソプロパノール及び700rpmで、室温でスピン5分にすすいでください。 </li></ol>ハイブリダイゼーションのためのサンプルの準備<ol><li>水に再懸プローブ（ボリュームが下与えられます） <table border="0"><tbody><tr><td>合計巻用。 =30μlの </td><td>合計巻用。 =35μl </td><td>合計巻.=40μlのための </td><td></td></tr><tr><td> 19.8μlの水 </td><td> 23.55μlの水 </td><td> 27.2μlの水 </td><td> </td></tr><tr><td> 1.5μL </td><td> 1.5μL </td><td> 1.5μL </td><td> 10 mg / mlのサケ精子DNA（Invitrogen社） </td></tr><tr><td> 1.2μL </td><td> 1.2μL </td><td> 1.2μL </td><td> 12.5 mg / mlのtRNAの</td></tr><tr><td> 4.5μL </td><td> 5.25μL </td><td> 6μlの</td><td> 20XSSC（3X最終） </td></tr><tr><td> 3μlの</td><td> μlを3.5 </td><td> 4μlの</td><td> 1％SDS </td></tr></tbody></table> 注 ：試薬の添加の順序は重要です。マスターミックスを調製してください。 </li><li> 5分間沸騰し、14,000 rpmで5分をスピン。室温で2分間冷却してください。 </li></ol>交配<ol><li>各辺上と真ん中のハイブリダイゼーションチャンバーのウェルに3倍SSC 10〜12μlを添加する。 </li><li>スライドの適切な領域にクリーンリフタースリップを加え、穏やかにハイブリダイゼーション溶液（30 -40μL）でロードする。カバースリップのどちらかの端に余分なサンプルがあるはずです。 </li><li>チャンバー内のスライドを置きます。一晩65℃の水浴中にネジと場所を締めます。水浴の底に直接チャンバーを置かないでください。場所のすべてを保持するために一番上のチャンバーの上にブロックを置きます。光に敏感なサンプルを保護するために水浴上で蓋をしてください。 </li></ol>ふたは洗浄<ol><li>以下のバッファを準備します。 <ul><li> 1X SSC、0.05％SDS </li><li> 0.06 X SSC </li></ul></li><li>インキュベーション開封ハイブリダイゼーションチャンバーの後。カバースリップを乱さないように注意しながら、チャンバーからスライドを削除します。 </li><li>カバースリップを削除するには、暖かい1X SSC、皿の底に直面して0.05​​％SDSの洗浄緩衝液のカバーを含む皿に浸すのスライド。カバースリップは、サイドにスライド側を移動して減少していきます。 </li><li>カバースリップを除去した後、ラックのスライド暖かい1XSSCm 0.05％SDSで新鮮なお風呂を配置。数分間攪拌する</li><li> 0.06 X SSCのお風呂にスライドに加えてラックを転送します。 </li><li>別のBAにスライドを移し0.06 X SSCは、新鮮なお風呂に入れる前に、できるだけ多くのSDSを含む緩衝液を除去するためにペーパータオルでスライドをブロッティング、新鮮なラックを含むの目。 </li><li>分のカップルのためのスライドを振とうする。 </li><li> 5分@ 700rpmで室温ですぐにスピンして、スライドにはスキャンする準備が整いました。スキャンするまで暗所で保管してください。 </li></ol>

<ol>
	<li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for.">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> Microarrays &amp; TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , .</li><li>Gilbert, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+&amp;+Hybridization+of+probed+labels.">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays &amp; Hybridization of probed labels.</a> , .</li><li>Hedge, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II.">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , .</li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>AA-dUTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A0410</td>
<td>5-(3-aminoallyl)-2&#x2019;deoxyuridine-5&#x2019;-triphosphate</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>27-2035-01</td>
<td>100 mM dNTP Set PCR grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Random Hexamer primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>27-2166-01</td>
<td>3mg/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>SuperScript III RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>80800444</td>
<td>200U/&#x03BC;L</td>
</tr>
<tr>
<td>CyDye&#x2122;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>RPN5661</td>
<td>Post-Labelling Reactive Dye Pack</td>
</tr>
<tr>
<td>QIAquick</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28104</td>
<td>PCR Purification kit</td>
</tr>
<tr>
<td>1M K2HPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M KH2PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M KPO4</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:
9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate wash buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.
** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate elution buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Carbonate Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.
Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

bacterial gene expression analysis using microarrays

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析

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Research

JoVE Journal

Biology

8.7K ビュー.  University of California Santa Cruz - UCSC. 

ビデオ: Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

生物学

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 1 of 3.

ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 3 describes the process of fluorescently labeling the amplified RNA from both host and viral samples by amino allyl coupling of dyes. Part 3 of 3.

ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その3

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

脊髄電気生理学

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

エメラルドアッシュボーラーの遺伝子発現の解析（ Agrilus planipennis）を使用して定量的リアルタイム- PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

マイクロアレイを用いたtRNAのアミノアシル化（充電）レベルのゲノムワイド解析

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Methods Article

マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析