Реакция обратной транскриптазы Включите нагревательный блок до 70-80 ° С и 42 ° C. Водяные бани также может быть использован в этом шаге. При использовании нагрева блоков, положить немного воды так, чтобы тепло равномерно. <ol><li> Грунтовка реакции <ol><li> Принимать 3 мкг РНК </li><li> Регулировка громкости до 13 мкл водой РНКазы свободный </li><li> Добавить 2,5 мкл случайных гексамера праймеров (2mg/mL) </li></ol></li><li> Хорошо перемешать и инкубировать при 70-80 ° С в течение 8 минут. Затем поместите на льду в течение 5 мин. </li><li> Подготовка РТ коктейль (14,5 мкл / Rxn): <table border="0"><tbody><tr><td> Компонент </td><td> Объем </td></tr><tr><td> 5X первых буфера Strand </td><td> 6 мкл </td></tr><tr><td> 0,1 М ДТТ </td><td> 3 мкл </td></tr><tr><td> 25X aminoallyl-дНТФ смеси </td><td> 1,2 мкл </td></tr><tr><td> Надстрочный II RT (200U/μl) </td><td> 2,3 мкл </td></tr><tr><td> Воды </td><td> 2,0 мкл </td></tr></tbody></table> * Для реакций п, подготовка Master Mix для п 0,5 порции коктейля, чтобы заверить, что вы не закончатся. </li><li> Добавить 14,5 мкл до охлаждения реакций. </li><li> Mix (не вихря) и инкубировать при 42 ° С в течение 3-4 часов </li><li> Образцы могут храниться при температуре -20 ° С, если это необходимо. </li></ol> Гидролиза РНК <ol><li> Для каждого образца, добавляют 3 мкл 1 N NaOH и 0,6 мкл 0,5 М ЭДТА. (Финальный conc.s = 100мм NaOH, 10 мМ ЭДТА) </li><li> Смешать и инкубировать при температуре 65 ° С в течение 10 минут. </li><li> Нейтрализовать добавлением 33,6 мкл 1М HEPES, рН = 7,0 (конечная конц .= 500 мм HEPES) </li><li> Образцы могут храниться при температуре -20 ° С, если это необходимо. </li></ol> Реакция очистка: Удаление неинкорпорированных аа-dUTP и свободные амины Примечание: Это очищение протокол изменяется от PCRpurification Qiagen протокол QIAquick комплект. Мыть фосфата и элюирования буферов заменить Qiagen поставляется буферов потому Qiagen буферы содержат свободные амины, которые конкурируют с реакции сочетания Cy красителя. Столбцы из мини-приготовительные комплект может также использоваться. <ol><li> Смешайте кДНК реакции с 300 мкл (или 5 раз объем реакционной смеси = 336 мкл) буфера PB (Qiagen входит в комплект) и трансфер в колонке QIAquick. </li><li> Место колонки в 2 мл пробирки (Qiagen входит в комплект) и центрифуги при ~ 13000 оборотов в минуту в течение 1 минуты. Пустая труба коллекции. </li><li> Чтобы промыть, добавить 750 мкл промывочного буфера фосфата (не Qiagen), чтобы колонны и центрифуги при ~ 13000 оборотов в минуту в течение 1 минуты. </li><li> Пустые пробирки и повторить 750 мкл мыть и центрифугирования шаг. </li><li> Пустые пробирки и центрифуги колонки еще 1 минуту при максимальной скорости. </li><li> Передача столбец на новое 1,5 трубки микроцентрифужную мл и осторожно добавить 30 мкл буфера для элюции фосфата. (См. раздел приготовления раствора) </li><li> Инкубируйте в течение 1 минуты при комнатной температуре. </li><li> Элюировать центрифугированием при 13000 оборотов в минуту ~ в течение 1 минуты. </li><li> Элюировать второй раз (и еще 30 мкл фосфатного буфера элюирования) в ту же трубку, повторив шаги 6-8. Конечный объем элюирования должно быть ~ 60 мкл. </li><li> Количество кДНК может быть определена количественно на этом этапе: нг кДНК = (коэффициент разбавления) (OD260) (37) (общий объем вымывают из колонки) </li><li> Сухой образец в вакууме скорость при 45 ° C. </li><li> Образцы могут храниться при температуре -20 ° С, если это необходимо. </li></ol> Муфта аа-кДНК Су Dye Эстер <ol><li> Ресуспендируют aminoallyl меченные кДНК с 10 мкл 50 мМ Na-бикарбонат, рН = 9,0, если необходимо. (Этот буфер должен быть свежим каждые две недели) </li><li> Работа в темном месте, добавить зонда трубка соответствующего красителя Су. Внесите вверх и вниз несколько раз, чтобы ресуспендирования красителя. </li><li> Инкубируйте реакции в течение 1 часа в темном месте при комнатной температуре. (Инкубация может доходить до двух часов) </li></ol> Реакция Очистка II: Удаление несвязанных красителя <ol><li> К реакционной добавить 35 мкл 100 мМ NaOAc рН 5,2. Тщательно перемешать. </li><li> Добавить 250 мкл (или 5 раз объем реакционной смеси = 225 мкл) буфера PB (Qiagen прилагается) для каждого образца и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. </li><li> Место колонке QIAquick спина в 2 мл пробирки (Qiagen в комплект поставки), применять образец столбца, а центрифуги при ~ 13000 в течение 1 минуты. Пустая труба коллекции. </li><li> Чтобы промыть, добавить 0,75 мл буфера PE (Qiagen в комплект поставки) к колонне и центрифуги при ~ 13000 в течение 1 минуты. </li><li> Повторите шаг 4. </li><li> Пустая труба сбора и центрифуги колонку еще на 1 минуту при максимальной скорости. </li><li> Место колонку в чистую 1,5 трубки микроцентрифужную мл и осторожно добавить 30 мкл буфера EB (Qiagen в комплект поставки) к центру колонки мембраны. </li><li> Инкубируйте в течение 1 минуты при комнатной температуре. </li><li> Элюировать центрифугированием при 13000 оборотов в минуту ~ в течение 1 минуты. </li><li> Элюировать второй раз в ту же трубку, повторяяшаги 7-9. Окончательный элюировали объем должен быть ~ 60 мкл. </li></ol> Анализ маркировки Реакция Количество кДНК и метка может быть определена количественно на этом этапе: <ul><li> Мера 260 OD, 550 и 650 (Бланк является вода.) Используйте nanodrop программы микрочипов. </li><li> Рассчитать пмоль красителей регистрации и пмоль ДНК и пис / красителя отношения с заданными уравнениями ниже: пмоль нуклеотидов = [OD260 * объем (мкл) * 37 нг / мкл * 1000 пг / нг] / 324,5 пг / пмоль </li></ul> Примечание: 1 OD260 = 37 нг / мкл для кДНК; 324,5 пг / пмоль средней молекулярной массой дНТФ) пмоль Cy3 = OD550 * объем (мкл) / 0,15 пмоль Cy5 = OD650 * объем (мкл) / 0,25 нуклеотидов / красителя соотношение = пмоль кДНК / пмоль Су красителя Если вы используете nanodrop, это уже дает пмоль / мкл для каждого красителя. Вам нужно только умножить это число на объем, чтобы получить общее пмоль включению красителя. Обратите внимание:&gt; 150-200 пмоль красителя включения в образец и отношение менее 20 нуклеотидов / молекул красителя является оптимальным для гибридизации. <ul><li> Образцы могут храниться при температуре -20 ° С в темноте. <ul><li> Комбинат зонды для гибридизированных вместе и сухой вниз в speedvac на 42 ° C. </li><li> Образцы могут храниться при температуре -20 ° С до готовности Hyb. </li></ul></li></ul> Предварительно Hyb слайдов <ol><li> Лицо Место сползают вниз по РТ 100 мл воды в чистую красный держатель слайдов в течение 3-5 минут </li><li> Привязка сухой слайд, поставив лицом вверх на 100 ° Блок отопления С в течение нескольких секунд - следите за конденсации исчезают </li><li> УФ перекрестные ссылки слайд при 250 mJoules (Введите 2500 до УФ сшивателя) </li><li> Гидратов слайды, опуская в предварительно разогретой воды 42 ° C. Спиновые 5 мин при 700 RPM при комнатной температуре. </li><li> Инкубируйте слайдов в 50 мл банку Коплин содержащие подогретого предварительно Hyb (5XSSC, 1% БСА, 0,1% SDS) не менее 45 минут при 42 ° С, а инкубационный может идти дольше, если это необходимо. 50 мл предварительно Hyb буфера: 12,5 мл 20х SSC, 10 мл 5% БСА, 0,5 мл 10% SDS, 27 мл воды </li><li> Dip слайдов в подогретого воде (42 ° С) и агитировать за пару минут, чтобы удалить предварительно Hyb буфера. </li><li> Полоскание в изопропанола и спина 5 мин при 700 оборотах в минуту, комнатной температуры, чтобы высохнуть. </li></ol> Подготовка образцов для гибридизации <ol><li> Ресуспендируют зонд в воде (объемы приведены ниже) <table border="0"><tbody><tr><td> Для общего об. = 30μl </td><td> Для общего об. = 35μl </td><td> Для полной том .= 40μl </td><td></td></tr><tr><td> 19,8 мкл воды </td><td> 23,55 мкл воды </td><td> 27,2 мкл воды </td><td> </td></tr><tr><td> 1,5 мкл </td><td> 1,5 мкл </td><td> 1,5 мкл </td><td> 10 мг / мл ДНК спермы лосося (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1,2 мкл </td><td> 1,2 мкл </td><td> 1,2 мкл </td><td> 12,5 мг / мл тРНК </td></tr><tr><td> 4,5 мкл </td><td> 5,25 мкл </td><td> 6 мкл </td><td> 20XSSC (3X окончательный) </td></tr><tr><td> 3 мкл </td><td> 3,5 мкл </td><td> 4 мкл </td><td> 1% SDS </td></tr></tbody></table> Примечание: порядок добавления реагентов важны. Не готовьте мастера микса. </li><li> Кипятить 5 минут, затем спина 5 минут при 14000 оборотах в минуту. Прохладный в течение 2 мин при комнатной температуре. </li></ol> Гибридизация <ol><li> Добавить 10-12 мкл 3Х SSC для скважин гибридизации камеры на каждом краю и в центре. </li><li> Добавить чистой скольжения ручка для соответствующей области слайда и аккуратно нагрузки в гибридизации решения (30 -40 мкл). Там должно быть очень образца на обеих боковых покровным стеклом. </li><li> Место слайда в камере. Затяните винты и места в 65 ° С водяной бане в течение ночи. Не устанавливайте камеру непосредственно на дно ванны. Место блока в верхней части верхней камере провести все на месте. Держите крышкой на водяной бане для защиты светочувствительных образцов. </li></ol> Hyb Моет <ol><li> Подготовьте следующие буферов: <ul><li> 1X SSC, 0,05% SDS </li><li> 0,06 X SSC </li></ul></li><li> После инкубации распечатать камеру гибридизации. Удалить слайд из камеры, следя за тем, чтобы не нарушить покровное. </li><li> Для удаления покровные, погрузи слайдов в блюдо с теплой 1X SSC, 0,05% SDS промывочный буфер покровное направлен к нижней части блюда. Покровное будет падать, перемещая слайд стороны в сторону. </li><li> После покровное удаляется, место слайда в стойку свежие ванну с теплой 1XSSCm 0,05% SDS. Агитировать за пару минут </li><li> Передача слайдами плюс стойки для ванны 0,06 X SSC. </li><li> Передача слайдов на другой бам на 0,06 X SSC содержащие свежие стойку, промокательной слайд на бумажное полотенце, чтобы удалить как можно больше SDS-содержащих буфера возможно прежде, чем поместить на свежем ванну. </li><li> Перемешивают слайды в течение нескольких минут. </li><li> Спиновые сразу при комнатной температуре в течение 5 мин при 700 оборотах в минуту, то слайды готов к сканированию. Хранить в темноте, пока проверяются. </li></ol>

<ol>
	<li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for.">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> Microarrays &amp; TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , .</li><li>Gilbert, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+&amp;+Hybridization+of+probed+labels.">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays &amp; Hybridization of probed labels.</a> , .</li><li>Hedge, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II.">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , .</li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>AA-dUTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A0410</td>
<td>5-(3-aminoallyl)-2&#x2019;deoxyuridine-5&#x2019;-triphosphate</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>27-2035-01</td>
<td>100 mM dNTP Set PCR grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Random Hexamer primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>27-2166-01</td>
<td>3mg/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>SuperScript III RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>80800444</td>
<td>200U/&#x03BC;L</td>
</tr>
<tr>
<td>CyDye&#x2122;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>RPN5661</td>
<td>Post-Labelling Reactive Dye Pack</td>
</tr>
<tr>
<td>QIAquick</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28104</td>
<td>PCR Purification kit</td>
</tr>
<tr>
<td>1M K2HPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M KH2PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M KPO4</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:
9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate wash buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.
** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate elution buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Carbonate Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.
Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

bacterial gene expression analysis using microarrays

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays at JoVE.com

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Бактериальный анализ экспрессии генов Использование Microarrays

bacterial-gene-expression-analysis-using-microarrays

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Views.  University of California Santa Cruz - UCSC. 

Video: Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

Analogous to metagenomics, environmental transcriptomics (metatranscriptomics) retrieves and sequences environmental mRNAs from a microbial assemblage without prior knowledge of what genes the community might be expressing. Thus it provides the most unbiased perspective on community gene expression in situ. Environmental transcriptomics protocols are technically difficult since prokaryotic mRNAs generally lack the poly(A) tails that make isolation of eukaryotic messages relatively straightforward 1 and because of the relatively short half lives of mRNAs 2. In addition, mRNAs are much less abundant than rRNAs in total RNA extracts, thus an rRNA background often overwhelms mRNA signals. However, techniques for overcoming some of these difficulties have recently been developed. A procedure for analyzing environmental transcriptomes by creating clone libraries using random primers to reverse-transcribe and amplify environmental mRNAs was recently described was successful in two different natural environments, but results were biased by selection of the random primers used to initiate cDNA synthesis 3. Advances in linear amplification of mRNA obviate the need for random primers in the amplification step and make it possible to use less starting material decreasing the collection and processing time of samples and thereby minimizing RNA degradation 4. In vitro transcription methods for amplifying mRNA involve polyadenylating the mRNA and incorporating a T7 promoter onto the 3 end of the transcript. Amplified RNA (aRNA) can then be converted to double stranded cDNA using random hexamers and directly sequenced by pyrosequencing 5. A first use of this method at Station ALOHA demonstrated its utility for characterizing microbial community gene expression 6.

We present a method for generating cDNA from environmental mRNA. In general, total RNA is first collected from the environment, rRNA is selectively removed, mRNA is selectively amplified, and cDNA synthesized from the enriched mRNA pool is sequenced. Recovered sequences can be annotated using standard bioinformatics techniques to identify the expressed genes.

Анализ экспрессии генов из морских микробных сообществ использованием экологических транскриптомику

Analogous to metagenomics, environmental transcriptomics (metatranscriptomics) retrieves and sequences environmental mRNAs from a microbial assemblage ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 2 of 3.

Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

РНК Изоляция от эмбриональных данио рерио и кДНК синтеза для анализа экспрессии генов

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Глобальный анализ экспрессии генов Использование данио рерио Платформа Microarray олигонуклеотидов

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Использование генной Pulser MXcell Электропорация системы для трансфекции первичных элементов с высоким КПД

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Использование автоматизированных счетчиков сотовый для упрощения исследования экспрессии генов: миРНК Нокдаун ИЛ-4 зависимости экспрессии генов в клетках Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Анализ экспрессии генов в Борер Изумрудный Эш ( Agrilus planipennis) С использованием количественных Real Time PCR-

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Генома Анализ аминоацилирования (зарядка) уровни тРНК Использование Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Парафин и замороженные Разделы Drosophila Мышцы взрослых

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...