وأيد هذا العمل جزئيا من خلال منحة لا. 213/09 من مؤسسة العلوم الإسرائيلية ، ومنحة لا. 2005258 من مؤسسة البنك السعودي الفرنسي ، ومنحة لا. 201665 من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) ، وتقنية النانو في معهد روسيل Berrie في التخنيون. نعترف بمساعدة البروفيسور نعوم أدير وفارس سلامة من كلية Schulich الكيمياء في التخنيون بشأن العرض والتعامل مع البكتيريا الزرقاء. يحظى بتقدير كبير في مساعدة ودعم Yoffis سفيتلانا من وحدة التصنيع التخنيون الصغير نانو.

1. نظرة عامة على ESR الصغرى ، التصوير أولا ، نحن نقدم شرحا موجزا ESR ، ESR المجهري ، ومختلف مكونات نظامنا ، ومن ثم فإننا سوف تصف تجارب التصوير الفعلي. الإلكترون تدور الرنين هي تقنية التحليل الطيفي الذي يمتص الإشعاع الكهرومغناطيسي على تردد محدد من جزيئات الإلكترون يدور مع المفردة ، وضعت تحت حقل مغناطيسي خارجي ثابت (الشكل 1). ESR يعمل في مجالات واسعة من العلوم ، مثل الكيمياء والبيولوجيا والفيزياء وعلوم المواد ، من أجل الكشف والتعرف على الجذور الحرة ومراكز ممغطس. انها وسيلة قوية لدراسة البيئة من الجزيئات في الأنواع الحية ممغطس ويوفر معلومات حول الحموضة (PH) ، واللزوجة ، والأكسجين ، وعلى رد الفعل الأوكسجين الأنواع تركيزات 3. للعينات غير متجانسة ، يمكن الحصول على المعلومات الطيفية ESR بطريقة حل مكانيا (أي عن طريق الحصول على صورة) ، من خلال استخدام تدرجات المجال المغناطيسي 4. هذه هي مشابهة جدا لطريقة أكثر شيوعا من التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) الذي يدور أساسا يلاحظ البروتون. حتى الآن ، تم تطبيق تقنيات التصوير مثل ESR لعينات حية مع حجم كبير نسبيا من بضعة سنتيمترات ومم على نطاق القرار. (على سبيل المثال انظر الشكل 2 ، المأخوذ من المرجع 5) وهناك تطور حديث نسبيا في مجال التصوير ESR هو امتداد لقدراتها من النظر إلى الحيوانات الصغيرة الحجم في المليمتر القرار إلى قياسات لعينات من الملليمتر ، وشبه عادية مع الحجم ميكرون على نطاق القرار. ويعرف هذا المجال ، حيث ESR المجهري ، والتي يمكن اليوم تقديم صور ESR 3D مع قرار يقترب 1 2 ميكرون (انظر الأمثلة ممثل في الشكل 3). مجهر ESR يشبه أساسا إلى مطياف ESR التقليدية. انها عامل جذب لتوليد حقل ثابت ، ونظام الميكروويف لتدور الإثارة واكتشاف الإشارات ، تحقيقا لعقد العينة ، وحدة محوسبة للتحكم في عملية اقتناء ومعالجة البيانات. مكونات أخرى فريدة من نوعها التصوير ESR بشكل عام والموجودة أيضا في مصغرة ESR ممغنطة مصادر التدرج الميدانية ، التي هي جزء من النظام الالكتروني ، وملفات الانحدار التي تقع في التحقيق التصوير. ويرد مزيد من التفاصيل حول نظامنا محددة في الفيلم ، ووصف بروتوكول في إشارة 2. 2. ESR إعداد نموذج مايكرو التصوير ويصف هذه المرحلة طريقة لإعداد نموذج للتجربة التصوير ESR متناهية الصغر. في نهاية هذه المرحلة يتم وضع الخلايا في الجزء السفلي من الزجاج ESR أعدت خصيصا لحاوية العينة المجهر جنبا إلى جنب مع حل جذري trityl العازلة 6. يصف هذا البروتوكول قياس خلايا البكتيريا الزرقاء ، وبالتالي ، بالنسبة لأنواع أخرى من الخلايا ، قد تكون هناك حاجة إلى إجراء تعديلات مناسبة على عينة مرحلة التحضير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، يتم اتخاذ مربعات قليلة من ورقة ماصة بحجم 400 400 ميكرومتر ~ وإدراجها في أنبوب إيبندورف التي شغلها في وقت لاحق مع 1.2 مل من تعليق البكتيريا الزرقاء (بتركيز 40 ملغ / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم طرد تعليق لمدة 2 دقيقة عند 6000 دورة في الدقيقة في microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد هذا ، تتم إزالة تماما العازلة طاف باستثناء ميكرولتر 50 ~ التي يتم ترك البكتيريا الزرقاء لتجنب الجفاف. نتيجة لهذه العملية ، مشبعة الآن ورقة ماصة من قبل خلايا البكتيريا الزرقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط غرامة ، ويتم استخراج ألياف قليلة من الورق وتوضع في قاع فنجان تشبه الزجاج أعدت خصيصا صاحب العينة 7. بعد أن تتم إضافة 3 ملم من trityl في حل BG - 11 8 ، 9 (انظر المخطط 1) لصاحب العينة من خلال المعونة من حقنة الغرامة. ومن ثم ختم صاحب الأشعة فوق البنفسجية يمكن علاجها باستخدام الغراء ، وترك منفذ الهواء صغيرة مفتوحة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الأسهم 4 </td><td> الأسهم 3 </td><td> الأسهم 2 </td><td> المخزون 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 هبو 4 : 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4 : 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> غ 2 ملغ EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2 : 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> الحديديك سترات الأمونيوم 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4 : 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> حامض الستريك : 1H2O 0.6g/liter </td></tr><tr><td>كبريتات النحاس (4) : 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2 : 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> رمع الفتح المهبطي 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4 : 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> مخطط (1) إعداد المتوسطة BG 11. </li></ol> 3. ESR مايكرو التصوير التجارب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء تجربة التصوير ، وتشغيل نظام التصوير الجزئي ESR وتضاف العينة إلى أن يذهب مرنان داخل مسبار التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن ، وذلك باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة الكمبيوتر ، وضبط النظام على الوضع &quot;اللحن&quot; والعثور على تردد صدى الميكروويف لجنة التحقيق ، والتي سيتم استخدامها لقياس ESR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك ، تعيين الحقل المغناطيسي ثابتة على القيمة التي تتوافق مع وتيرة الميكروويف التطبيقية ، وتعيين المعلمات توقيت لتسلسل النبض ومراقبة إشارة ESR للتأكد من أن نظام وظائف جيدة والعينة مستعدة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم ، تعيين المعلمات والتصوير ، مثل عدد البكسل ، وقوة من التدرجات ، وطول البقول الانحدار إلى القيم المطلوبة لديهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الإعداد ، وجمع ثلاث صور ESR 3D بواسطة تسلسل صدى نبض التصوير هان (الشكل 4) مع فصل interpulse والقيم من 600 ، 500 ، 700 و NS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تشغيل الضوء المسقط على عينة أو إيقاف تشغيله اعتمادا على الظروف التجريبية المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال اقتناء وحفظ البيانات تلقائيا. ثم تتم معالجة البيانات الخام الأطروحات الملفات عن طريق برنامج ماتلاب النصي لتوفير صور من تركيز trityl الراديكالية ووقت الاسترخاء T 2 الخريطة ، والتي تترجم الى تركيز الأوكسجين عن طريق صورة موجودة مسبقا المعايرة. </li></ol> 4. ممثل النتائج نتائج التجربة عدة ثلاثي الأبعاد ESR متناهية الصغر الصور المسجلة على قيم τ مختلفة. يتم توفير البيانات الخام الصور النمطية في الشكل 5. أعلى ثلاث صور ، ويقاس في ظروف مظلمة ، متشابهة جدا ، باستثناء انخفاض في كثافة الإشارة. من ناحية أخرى ، يتغير نمط الصور تحت أشعة ضوء نتيجة اوقات الاسترخاء مختلفة في أجزاء مختلفة من العينة. يمكن معالجة هذه البيانات من 1 إلى الحصول على صورة السعة ، كما هو مبين في الشكل (6) وأيضا صور من الوقت للاسترخاء ، تي 2 (الشكل 7). وتترجم على شكل حرف T 2 الصور في قيم تركيز الأوكسجين عبر منحنى المعايرة قبل القائمة التي تربط بين تركيز الأكسجين إلى وقت الاسترخاء عن طريق المعادلة : <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="المعادلة 1" /> هنا ، T 2 0 هو وقت الاسترخاء تدور تدور بسرعة التحقيق في ظل ظروف نقص الأكسجين (اعتمادا على تركيز التحقيق ، وجيم ، ومعامل لنشرها ، D) ، و k هو ثابت التناسب. في معظم الحالات ، فإن معامل الانتشار لا تختلف كثيرا عن عينات حية (على الرغم من ذلك ، إذا لزم الأمر ، من حيث المبدأ يمكن أن يكون أيضا من خلال تقييمها مباشرة ESR 6 ، 10) ، ويتم الحصول على تركيز تدور أثناء عملية التصوير. ولذلك ، يمكن استخدام هذه العلاقة لقياس تركيز الأوكسجين مباشرة. بالعودة إلى الشكل (6) ، يتضح من الصورة السعة التي كانت موجودة في خلايا البكتيريا الزرقاء أساسا على الجانب الأيمن لصاحب العينة. وعلاوة على ذلك ، على أساس الشكل 7 ، فمن الواضح أن الضوء يبدأ إنتاج O 2 ويؤدي إلى زيادة كبيرة في تركيز المحلول 2 O ، وأساسا في voxels بالقرب من البكتيريا الزرقاء. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : مستويات الطاقة في الرنين الالكتروني المغناطيسي. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 : صورة نموذجية للتركيز الأوكسجين ماوس مع الورم. الصورة على اليسار يظهر المعلومات التشريحية ، استنادا إلى صورة بالرنين المغناطيسي. تم حقن مستقرة خالية العضوية جذرية للفأرة وخصائصها ESR توفير تركيز الأكسجين في بيئتها (يمين). يتم فرضه على أساس النتائج ESR على الصورة التشريحية التصوير بالرنين المغناطيسي. مجال الرؤية هو 32 ملم. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3 : مثالين على صور عالية الصغيرة الحجم القرار ESR من العينة photolithographically ولدت مع مسحوق N @ C 60 (يسار) وLiPcبلورات ممغطس (يمين) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4 : النموذجية هاهن تسلسل نبض التصوير تبين الميكروويف (MW) ، والتدرج ، ومجموعة X ، Y G G والبقول ض. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5 : نموذجي البيانات الخام ESR متناهية الصغر الصور : أ ، ب ، ج والبيانات الأولية من عينة Cyanobacterium مع عدم وجود إنارة الضوء المقاسة لτ = 500600700 نانوثانية ، على التوالي. البنود د ، ه ، و هي نفس أ ، ب ، ج ، ولكن مع الإضاءة الخفيفة. يتم رسم كثافة في حجم التعسفي (ولكن متناسقة داخل كل مجموعة من ثلاثة الظلام أو الضوء صور البيانات الخام) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 6 : صورة السعة المقابلة لتركيز جذري في حل (مقياس التعسفي). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="الشكل 7" /> الشكل 7 : T 2 الصور والمناظر و[O 2] القيم في ظل ظروف (يمين) الظلام (يسار) والخفيفة.

<ol>
	<li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance.">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li><li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution:+methodology+and+applications.">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li><li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+EPR:+when,+how+and+why?.">In vivo EPR: when, how and why?.</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li><li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).</li><li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI.">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li><li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE.">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , (2010).</li><li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy.">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li><li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae.">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+Assignments,+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria.">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance.">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذا البروتوكول يوضح كيف يمكن تطبيقها ESR التصوير الجزئي لتعيين تركيز الأكسجين بالقرب من عينات صغيرة حية. قرار المكاني لل~ 30 × 30 × 100 ويتجلى ميكرون ، مع قرب micromolar تركيز الأوكسجين حساسية ودون حساسية فيمتومول الأكسجين المطلق لكل فوكسل. استخدام ESR الدقيقة لرسم الخرائط والتصوير بالقرب من الخلايا الأوكسجين يكمل التقنيات المتوفرة حاليا على أساس الدقيقة الأقطاب أو مضان / تفسفر. علاوة على ذلك ، مع التحقيق ممغطس السليم ، فإنه يمكن تطبيقه بسهولة لتصوير الخلايا المجهرية الأكسجين ، وقدرة وسائل أخرى والتي تجد من الصعب جدا تحقيقه. في المستقبل القريب نخطط لزيادة تحسين هذه المنهجية لتقديم عينة من الصور الحية مع قرار من بضعة ميكرونات ، وتوفير معلمات النقيض من مثل تركيز أكسيد عظمى والحموضة (PH) ، نشر وتحقيق معامل ، بالطبع ، وتركيز الأوكسجين. هذه القدرات هي مكملة لمنهجيات البصرية الحالي القائم على حد سواء من حيث النوع ، وكذلك على النقيض من خصائص العينات (مثل عينات غير شفافة وسميكة ، في بعض الحالات ، مقابل قياسات الخلايا خارج الخلية).

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Heraus, 75003235</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Microliter 7000.5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet Curing</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA63, or NOA61.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electron spin resonance micro-imaging of live species for oxygen mapping

يصف هذا البروتوكول الرنين الالكتروني المغناطيسي (ESR) الصغيرة التصوير طريقة لرسم خرائط ثلاثية الابعاد لمستويات الأوكسجين في البيئة المباشرة من الخلايا الحية مع ميكرون على نطاق القرار 1. الأوكسجين هي واحدة من الجزيئات الأكثر أهمية في دورة الحياة. وهو بمثابة محطة المتقبلة الإلكترون الفسفرة المؤكسدة في الميتوكوندريا ، ويستخدم في إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية. قياسات الأكسجين هامة لدراسة وظائف الميتوكوندريا والتمثيل الغذائي ، مما يشير الممرات ، وآثار مختلف المحفزات ، نفاذية الغشاء ، وتمايز المرض. استهلاك الأوكسجين وبالتالي علامة بالمعلومات الأيض الخلوي ، والتي تنطبق على نطاق واسع لمختلف النظم البيولوجية من الميتوكوندريا إلى خلايا للكائنات كلها. نظرا لأهميتها ، وقد وضعت العديد من الأساليب لقياس الأوكسجين في الأنظمة الحية. وتستند المحاولات الجارية لتوفير مستوى عال من الدقة التصوير الأكسجين بشكل رئيسي على مضان البصرية وأساليب تفسفر التي تفشل في تقديم نتائج مرضية كما أنها توظف تحقيقات مع ارتفاع السمية الصورة وحساسية منخفضة الأوكسجين. ومن المعروف ESR ، والذي يقيس إشارة من تحقيقات ممغطس الخارجية في العينة ، لتوفير قياسات دقيقة للغاية من تركيز الأوكسجين. في حالة نموذجية ، والقياسات ESR خريطة توسيع المسبار lineshape و / أو الاسترخاء في الوقت تقصير التي ترتبط مباشرة إلى تركيز الأوكسجين المحلية. (الأوكسجين ممغطس ، وبالتالي ، عندما يصطدم مع التحقيق ممغطس الخارجية ، فإنه ضيق أوقات الاسترخاء والخمسين.) تقليديا ، يتم تنفيذ هذا النوع من التجارب كان خارجا مع القرار منخفضة ، ملليمتر النطاق ESR للتصوير الحيوانات الصغيرة. هنا نبين كيف يمكن أيضا أن يكون التصوير ESR التي نفذت في الحجم ميكرون لفحص عينات حية صغيرة. ESR الدقيقة التصوير منهجية جديدة نسبيا ، والتي تمكن من الحصول على اشارات ESR مكانيا حل مع قرار يقترب 1 ميكرون في درجة حرارة الغرفة 2. الهدف الرئيسي من هذه الورقة هو بروتوكول لاظهار كيف ان هذه الطريقة الجديدة ، جنبا إلى جنب مع مجسات حساسة للأكسجين المطورة حديثا ، يمكن تطبيقها على رسم خرائط لمستويات الأكسجين في عينات حية صغيرة. قرار المكاني لل~ 30 × 30 × 100 ويتجلى ميكرون ، مع قرب micromolar تركيز الأوكسجين حساسية ودون حساسية فيمتومول الأكسجين المطلق لكل فوكسل. استخدام ESR الدقيقة لرسم الخرائط والتصوير بالقرب من الخلايا الأوكسجين يكمل التقنيات المتوفرة حاليا على أساس الدقيقة الأقطاب أو مضان / تفسفر. علاوة على ذلك ، مع التحقيق ممغطس السليم ، سيكون أيضا ينطبق بسهولة لتصوير الخلايا المجهرية الأكسجين ، والقدرة التي تجد وسائل أخرى من الصعب جدا تحقيقه.

Watch this Scientific Journal Video about Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping at JoVE.com

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

يصف هذا البروتوكول وسيلة لتصوير ثلاثي الأبعاد ميكرون النطاق للتركيز الأوكسجين في البيئة المباشرة من الخلايا الحية التي تدور الإلكترونات المجهري الرنين.

سبين الإلكترون التصوير بالرنين الصغرى ، من الأنواع الحية لرسم خرائط الأوكسجين

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K Views.  The Technion, Israel Institute of Technology. يصف هذا البروتوكول وسيلة لتصوير ثلاثي الأبعاد ميكرون النطاق للتركيز الأوكسجين في البيئة المباشرة من الخلايا الحية التي تدور الإلكترونات المجهري الرنين.

Video: Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

عينات الشعر نونينفاسيفي تقنيات الحمض النووي للحصول على ارتفاع الجودة من الثدييات الصغيرة المراوغ

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

اكتشاف اكسيد النيتريك وانيون الراديكالي فوق الأكسيد بواسطة الكترون ممغطس التحليل الطيفي بالرنين من الخلايا باستخدام الفخاخ سبين

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

كشف، تصور وQuantitating الجيل من أنواع الاكسجين التفاعلية في النظام النموذجي الاميبا

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

تعزيز الشمالية كشف طخة الأنواع RNA الصغيرة في<em&gt; الدروسوفيلاميلانوجاستر</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

توصيف تكلس الأحداث عن طريق لايف البصرية والمجهر الإلكتروني تقنيات في Tubeworm البحرية

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

المتزامن لرسم الخرائط وكوانتيتاتيون من ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي البشري

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

التحقيق "تضر الآثار من منخفضة الضغط البلازما التعقيم" على البقاء لجراثيم Bacillus نجحت "باستخدام خلية يعيش مجهرية"

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient production of ROS in situ efficiently activates cell proliferation in stem cell niches and stimulates tissue regeneration as strongly manifested through the acceleration of burn healing and hair follicle growth processes. The protocol is based on a regulatable photodynamic treatment that treats the tissue with precursors of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX and further irradiates the tissue with red light under tightly controlled physicochemical parameters. Overall, this protocol constitutes an interesting experimental tool to analyze ROS biology.

The aim of this protocol is to induce transient in vivo production of nonlethal levels of reactive oxygen species (ROS) in mouse skin, further promoting physiological responses in the tissue.

تحفيز منافذ الخلايا الجذعية وتجديد الأنسجة في جلد الفأر عن طريق التوليد الضوئي المعتمد على البروتوبورفيرين التاسع لأنواع الأكسجين التفاعلية في الموقع

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

تقييم المخاطر الكيميائية الزراعية لملكات نحل العسل المتزاوج

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...