Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla concessione nr. 213/09 dalla Science Foundation israeliano, non concede. 2005258 dalla fondazione BSF, non concede. 201665 dal Consiglio europeo della ricerca (CER), e dall &#39;Istituto Russell Berrie Nanotechnology presso il Technion. Riconosciamo l&#39;aiuto del Prof. Noam Adir e Faris Salame Schulich presso la Facoltà di Chimica presso il Technion per la fornitura e la gestione dei cianobatteri. L&#39;aiuto e il supporto di Svetlana Yoffis dalla Micro-Nano Fabrication Unità Technion è molto apprezzato.

1. Panoramica di ESR Micro-imaging In primo luogo, forniamo una breve spiegazione di ESR, microscopia ESR, e le varie componenti del nostro sistema, e quindi verranno descritti gli esperimenti di imaging attuale. Risonanza di spin elettronico è una tecnica spettroscopica in cui viene assorbita la radiazione elettromagnetica ad una specifica frequenza di molecole con spin di elettroni spaiati, vincolate ad un campo magnetico statico esterno (Figura 1). ESR è impiegato in ampie aree della scienza, come la chimica, la biologia, fisica e scienza dei materiali, per la rilevazione e l&#39;identificazione dei radicali liberi e dei centri paramagnetici. Si tratta di un potente metodo per studiare l&#39;ambiente di molecole paramagnetiche in specie dal vivo e fornisce informazioni su acidità (pH), viscosità, ossigeno, e specie reattive dell&#39;ossigeno concentrazioni 3. Per i campioni eterogenei, informazioni spettrali ESR può essere ottenuto in modo risolta spazialmente (cioè, ottenendo un&#39;immagine), attraverso l&#39;uso di gradienti di campo magnetico 4. Questo è molto simile al metodo più comune di risonanza magnetica (MRI) che osserva principalmente gira protone. Fino ad ora, ad esempio tecniche di imaging ESR sono state applicate per gli esemplari vivi di dimensioni relativamente grandi di pochi centimetri e in mm scala risoluzione. (Per esempio vedi figura 2, tratta dal riferimento 5.) Uno sviluppo relativamente recente della VES imaging è l&#39;estensione delle sue capacità di guardare i piccoli animali in millimetri scala risoluzione alle misure di campioni millimetrica e sub-millimetriche dimensioni con micron scala risoluzione. Questo campo è nota come microscopia ESR, che oggi in grado di fornire immagini 3D ESR con una risoluzione avvicina 1 micron 2 (vedi esempi rappresentativi in Figura 3). Un microscopio ESR è essenzialmente simile a uno spettrometro ESR convenzionale. E &#39;una calamita per la generazione del campo statico, un sistema a microonde per l&#39;eccitazione di spin e la rilevazione del segnale, una sonda per la tenuta del campione, e una console computerizzata di controllare il processo di acquisizione e gestione dei dati. Altri componenti unica l&#39;imaging ESR in generale ed esistenti anche in ESR microcopia sono fonti di gradiente di campo magnetico, che fanno parte del sistema elettronico, e bobine di gradiente che si trovano nella sonda imaging. Maggiori dettagli sul nostro sistema specifico vengono mostrati nel film protocollo e descritti in riferimento 2. 2. ESR micro-imaging Preparazione del campione Questa fase descrive il metodo per la preparazione dei campioni per la micro-imaging esperimento ESR. Al termine di questa fase le cellule sono immessi sul fondo di un contenitore appositamente preparato ESR campione di vetro microscopia insieme ad un radicale tritil 6 soluzione tampone. Questo protocollo descrive la misurazione delle cellule cianobatteri e, quindi, per altri tipi di cellule, aggiustamenti possono essere necessari in fase di preparazione del campione. <ol><li> In primo luogo, alcune piazze di carta assorbente con una dimensione di circa 400 400 micron vengono presi ed inseriti in una provetta Eppendorf che viene successivamente riempita con 1,2 ml di sospensione cianobatteri (ad una concentrazione di 40 mg / mL). </li><li> La sospensione è centrifugata per 2 minuti a 6000 RPM in una microcentrifuga. </li><li> A seguito di questa, il buffer surnatante viene completamente rimosso tranne che per ~ 50 microlitri che sono a sinistra per evitare la disidratazione cianobatteri. Come risultato di questo processo, la carta assorbente è ormai saturo dalle cellule cianobatteri. </li><li> Utilizzando una pinzetta sottile, alcune fibre vengono estratte dalla carta e posto sul fondo di una coppa come porta bicchiere appositamente preparati campione 7. Successivo a quello di 3 mm di tritil in BG-11 soluzione 8, 9 (vedi schema 1) viene aggiunto il supporto del campione con l&#39;aiuto di una siringa sottile. Il titolare viene poi sigillato con colla curabili UV, lasciando una piccola presa d&#39;aria aperta. <table border="1"><tbody><tr><td> Stock 4 </td><td> Stock 3 </td><td> Stock 2 </td><td> Magazzino 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 EDTA Mg 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> Citrato ferrico di ammonio 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> Acido citrico: 1H2O 0.6g/liter </td&gt; </tr><tr><td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> CoCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Namoo 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Schema 1. Preparazione di BG-11 di media. </li></ol> 3. ESR micro-imaging Esperimenti <ol><li> Per iniziare l&#39;esperimento di imaging, attivare la micro-sistema di imaging ESR e inserire il campione nel risonatore che va all&#39;interno della sonda di imaging. </li><li> Ora, usando il software di controllo del computer, impostare il sistema in modalità &quot;Tune&quot; e trovare la frequenza di risonanza a microonde della sonda, che sarà utilizzato per le misurazioni ESR. </li><li> In seguito, impostare il campo magnetico statico sul valore che corrisponde alla frequenza delle microonde applicata, impostare i parametri di temporizzazione per la sequenza di impulsi e osservare il segnale ESR per assicurarsi che il sistema funziona bene e il campione è ben preparato. </li><li> Quindi, impostare i parametri di imaging, come ad esempio il numero di pixel, la forza dei gradienti, e la lunghezza degli impulsi gradiente ai valori richiesti. </li><li> A seguito di setup, raccogliere tre immagini 3D ESR da una sequenza eco Hahn di imaging cardiaco (Figura 4) con la separazione interpulso, i valori di  500, 600 e 700 ns. </li><li> Luce proiettata al campione è acceso o spento a seconda delle condizioni richieste sperimentali. </li><li> Durante l&#39;acquisizione, i dati vengono salvati automaticamente. Tesi file raw dati vengono poi elaborati tramite script software Matlab per fornire immagini della concentrazione tritil radicale e il tempo di rilassamento T 2 mappa, che si traduce in una immagine concentrazione di ossigeno tramite pre-esistente di calibrazione. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati I risultati dell&#39;esperimento sono diversi tridimensionale ESR micro-immagini registrate a differenti valori di τ. Tipiche immagini di dati grezzi sono forniti in Figura 5. Le prime tre immagini, misurato in condizioni di oscurità, sono molto simili tranne per la riduzione dell&#39;intensità del segnale. D&#39;altra parte, il modello cambia immagine sotto irradiazione di luce a causa delle differenti tempi di rilassamento in diverse parti del campione. Questi dati possono essere trattati da 1 a ottenere un&#39;immagine di ampiezza, come mostrato in figura 6 e anche le immagini del tempo di rilassamento, T 2 (Figura 7). T 2 immagini sono tradotti in valori concentrazione di ossigeno attraverso un pre-esistente curva di calibrazione che collega la concentrazione di ossigeno per il tempo di rilassamento tramite l&#39;equazione: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="Equazione 1" /> Qui, T 2 0 è la spin-spin tempo di rilassamento della sonda in condizioni anossiche (in funzione della concentrazione della sonda, C, e il suo coefficiente di diffusione, D), e k è una costante di proporzionalità. Nella maggior parte dei casi, il coefficiente di diffusione non varia molto per i campioni dal vivo (anche se, se necessario, può in linea di principio essere direttamente valutati anche da ESR 6, 10), e la concentrazione di spin si ottiene durante il processo di imaging. Pertanto, questa relazione può essere utilizzato per misurare direttamente la concentrazione di ossigeno. Tornando alla figura 6, è evidente dall&#39;immagine ampiezza che le cellule cianobatteri si trovavano principalmente sul lato destro del supporto del campione. Inoltre, sulla base di Figura 7, è chiaro che la luce inizia la produzione di O 2 e provoca un aumento significativo nella soluzione di concentrazione di O 2, principalmente nel voxel vicino al cianobatteri. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: I livelli di energia a risonanza di spin elettronico. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Tipica immagine concentrazione di ossigeno di un mouse cuscinetto tumore. L&#39;immagine a sinistra mostra le informazioni anatomiche, basata su un&#39;immagine di risonanza magnetica. Un organico stabile radicali liberi è stata iniettata per il mouse e le sue caratteristiche ESR fornire la concentrazione di ossigeno al suo ambiente (a destra). ESR a base di risultati si sovrappongono alla risonanza magnetica immagine anatomica. Campo visivo è di 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Due esempi di alta risoluzione su scala micro-ESImmagini R del campione photolithographically generati con N @ C 60 in polvere (a sinistra) e cristalli paramagnetici LIPC (a destra) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: Tipico Hahn immagine che mostra la sequenza di impulsi a microonde (MW) e di pendenza, G x, y G e G z impulsi. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: Tipico dati grezzi ESR micro-immagini: a, b, c sono i dati grezzi del campione cianobatterio senza illuminazione luce misurata per τ = 500.600.700 ns, rispettivamente. Elementi d, e, e sono le stesse a, b, c, ma con illuminazione luce. L&#39;intensità è tracciata in scala arbitraria (ma è coerente all&#39;interno di ogni serie di tre immagini raw buio o luce di dati) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6: immagine di ampiezza corrispondente alla concentrazione dei radicali nella soluzione (scala arbitraria). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7: T 2 immagini e il corrispondente [O 2] valori sotto scuro (a sinistra) e leggero (a destra) condizioni.

<ol>
	<li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance.">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li><li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution:+methodology+and+applications.">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li><li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+EPR:+when,+how+and+why?.">In vivo EPR: when, how and why?.</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li><li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).</li><li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI.">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li><li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE.">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , (2010).</li><li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy.">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li><li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae.">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+Assignments,+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria.">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance.">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo mostra come ESR micro-imaging può essere applicato a mappa della concentrazione di ossigeno vicino vivono piccoli campioni. Una risoluzione spaziale di circa 30 x 30 x 100 micron è dimostrato, con quasi micromolari sensibilità concentrazione di ossigeno e sub-femtomole sensibilità ossigeno assoluto per voxel. L&#39;uso di ESR micro-imaging per la mappatura di ossigeno vicino cellule integra le tecniche attualmente disponibili sulla base di micro-elettrodi o fluorescenza / fosforescenza. Inoltre, con la sonda paramagnetica corretto, sarà di facile applicazione per intracellulare di ossigeno micro-imaging, una capacità che altri metodi trovo molto difficile da raggiungere. Nel prossimo futuro abbiamo in programma su un ulteriore miglioramento di questa metodologia di fornire immagini di esempio dal vivo con una risoluzione di pochi micron, fornendo i parametri di contrasto come la concentrazione di ossido super, l&#39;acidità (pH), coefficiente di diffusione della sonda e, naturalmente, la concentrazione di ossigeno. Queste funzionalità sono complementari agli attuali ottici basati su metodologie sia in termini di tipo di contrasto e anche delle caratteristiche dei campioni (ad esempio, campioni di spessore non trasparente e, in alcuni casi, le misurazioni intracellulari vs extracellulare).

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Heraus, 75003235</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Microliter 7000.5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet Curing</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA63, or NOA61.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electron spin resonance micro-imaging of live species for oxygen mapping

Questo protocollo descrive una risonanza di spin elettronico (ESR) micro-imaging metodo per la mappatura tridimensionale dei livelli di ossigeno nelle immediate vicinanze di cellule vive con risoluzione micron scala 1. L&#39;ossigeno è una delle molecole più importanti nel ciclo della vita. Serve come accettore terminale di elettroni della fosforilazione ossidativa nei mitocondri ed è usato nella produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno. Misure di ossigeno sono importanti per lo studio delle funzioni mitocondriali e metaboliche, vie di segnalazione, gli effetti di vari stimoli, permeabilità della membrana, e la differenziazione della malattia. Il consumo di ossigeno è quindi un marcatore informativo del metabolismo cellulare, che è ampiamente applicabile ai vari sistemi biologici dai mitocondri alle cellule di organismi interi. Per la sua importanza, molti metodi sono stati sviluppati per le misure di ossigeno in sistemi live. Attuali tentativi di fornire immagini ad alta risoluzione di ossigeno si basano principalmente sulla fluorescenza ottica e metodi di fosforescenza che non riescono a fornire risultati soddisfacenti in quanto utilizzano sonde ad alta foto-tossicità e la sensibilità di ossigeno. ESR, che misura il segnale dalle sonde paramagnetiche esogeni nel campione, è nota per fornire misurazioni molto accurate della concentrazione di ossigeno. In un caso tipico, le misure ESR mappa LineShape ampliamento della sonda e / o di rilassamento tempo accorciamento che sono collegati direttamente alla concentrazione di ossigeno locale. (L&#39;ossigeno è paramagnetico, quindi, in caso di collisione con la sonda paramagnetica esogeni, è la sua brevità tempi di rilassamento.) Tradizionalmente, questo tipo di esperimenti siano condotti a bassa risoluzione, scala millimetrica ESR per l&#39;imaging piccoli animali. Qui mostriamo come ESR immagini possono anche essere effettuata nel micron scala per l&#39;esame di piccoli campioni dal vivo. ESR micro-imaging è una metodologia relativamente nuova che consente l&#39;acquisizione di spazialmente risolta segnali ESR con una risoluzione di 1 micron si avvicina a temperatura ambiente 2. L&#39;obiettivo principale di questo protocollo-paper è quello di mostrare come questo nuovo metodo, insieme con nuova concezione sensibili all&#39;ossigeno sonde, può essere applicato alla mappatura dei livelli di ossigeno in piccoli campioni dal vivo. Una risoluzione spaziale di circa 30 x 30 x 100 micron è dimostrato, con quasi micromolari sensibilità concentrazione di ossigeno e sub-femtomole sensibilità ossigeno assoluto per voxel. L&#39;uso di ESR micro-imaging per la mappatura di ossigeno vicino cellule integra le tecniche attualmente disponibili sulla base di micro-elettrodi o fluorescenza / fosforescenza. Inoltre, con la sonda paramagnetica corretto, sarà anche facile applicazione per intracellulare di ossigeno micro-imaging, una capacità che altri metodi trovo molto difficile da raggiungere.

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Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Questo protocollo descrive un metodo per micron scala imaging tridimensionale della concentrazione di ossigeno nelle immediate vicinanze di cellule vive con la microscopia elettronica risonanza di spin.

Electron Spin Resonance micro-imaging delle specie dal vivo per la mappatura di ossigeno

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K Views.  The Technion, Israel Institute of Technology. Questo protocollo descrive un metodo per micron scala imaging tridimensionale della concentrazione di ossigeno nelle immediate vicinanze di cellule vive con la microscopia elettronica risonanza di spin.

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A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Ricerca

Biologia

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Rilevamento di ossido nitrico e anione superossido radicale da spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica da cellule con Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Individuare, visualizzare e quantificare la generazione di specie reattive dell&#39;ossigeno in un modello di sistema di Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Indagare interazioni proteina-proteina in cellule vive utilizzando il trasferimento bioluminescenza Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Maggiore Northern Blot rilevazione di piccoli RNA specie in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Caratterizzazione di calcificazione eventi utilizzando dal vivo ottica ed elettronica Microscopia tecniche in un tubeworm Marine

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

Mappatura simultanea e quantificazione di ribonucleotidi del DNA mitocondriale umano

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Indagando i dannosi effetti di basso pressione sterilizzazione al Plasma sulla sopravvivenza di Bacillus subtilis spore utilizzando Live Cell microscopia

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient production of ROS in situ efficiently activates cell proliferation in stem cell niches and stimulates tissue regeneration as strongly manifested through the acceleration of burn healing and hair follicle growth processes. The protocol is based on a regulatable photodynamic treatment that treats the tissue with precursors of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX and further irradiates the tissue with red light under tightly controlled physicochemical parameters. Overall, this protocol constitutes an interesting experimental tool to analyze ROS biology.

The aim of this protocol is to induce transient in vivo production of nonlethal levels of reactive oxygen species (ROS) in mouse skin, further promoting physiological responses in the tissue.

Stimolazione di nicchie di cellule staminali e rigenerazione tissutale nella pelle di topo mediante fotogenerazione commutabile protoporfirina IX-dipendente di specie reattive dell'ossigeno in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Valutazione del rischio agrochimico per le regine delle api da miele accoppiate

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...