Este trabajo fue parcialmente apoyado por la beca no. 213/09 de la ciencia israelí Fundación, no se conceda ninguna. 2005258 de la fundación BSF, no se conceda ninguna. 201665 del Consejo Europeo de Investigación (CEI), y por el Instituto de Nanotecnología Russell Berrie en el Technion. Reconocemos la ayuda del profesor Noam Adir y Salame Faris de la Facultad de Química Schulich en el Technion en relación con el suministro y manejo de las cianobacterias. La ayuda y el apoyo de Svetlana Yoffis del Technion Micro-Nano Unidad de fabricación es muy apreciada.

1. Resumen de ESR Micro-imágenes En primer lugar, ofrecemos una breve explicación de ESR, microscopía de ESR, y los diversos componentes de nuestro sistema, a continuación, se describirán los experimentos de imagen real. Resonancia de spin electrónico es una técnica espectroscópica en la que se absorbe la radiación electromagnética a una frecuencia específica de moléculas con espines de los electrones no apareados, bajo un campo magnético estático externo (Figura 1). ESR se emplea en grandes áreas de la ciencia, como la química, la biología, la física y la ciencia de materiales, para la detección e identificación de los radicales libres y centros paramagnéticos. Es un poderoso método para estudiar el medio ambiente de las moléculas paramagnéticas en especies vivas y proporciona información sobre la acidez (pH), la viscosidad, el oxígeno y las concentraciones de especies reactivas de oxígeno 3. Para muestras heterogéneas, la información espectral ESR se puede obtener de una manera resuelta espacialmente (es decir, mediante la obtención de una imagen), a través del uso de gradientes de campo magnético 4. Esto es muy similar al método más común de la resonancia magnética (MRI), que observa principalmente spins de protón. Hasta ahora, las técnicas de imagen como ESR se aplicaron para especímenes vivos de tamaño relativamente grande de unos pocos centímetros y milímetros escala de resolución. (Por ejemplo, véase la figura 2, tomada de referencia 5.) Un desarrollo relativamente reciente de la VSG imagen es la ampliación de su capacidad de mirar a los animales pequeños en escala milimétrica resolución de las mediciones de las muestras milimétricas y submilimétricas tamaño con escala micrométrica resolución. Este campo se conoce como microscopio de ESR, que hoy puede ofrecer imágenes 3D ESR con una resolución de acercarse a 1 micra 2 (ver ejemplos representativos en la Figura 3). Un microscopio de ESR es esencialmente similar a un espectrómetro de ESR convencionales. Tiene un imán para generar el campo estático, un sistema de microondas para la excitación de giro y la detección de señales, una sonda para la celebración de la muestra, y una consola computarizada para controlar el proceso de adquisición y manejo de datos. Otros componentes únicos de la imagen de ESR en general y también existente en microscopia ESR son magnéticos fuentes de gradiente de campo, que forman parte del sistema electrónico, y bobinas de gradiente que se encuentran en la sonda de imagen. Más detalles sobre nuestro sistema específico se muestran en la película y el protocolo descrito en la referencia 2. 2. ESR Micro-Preparación de la muestra de imágenes Esta etapa se describe el método para la preparación de muestras para la velocidad de sedimentación globular de micro-imágenes experimento. Al final de esta etapa las células se colocan en el fondo de un recipiente de vidrio especialmente preparadas ESR muestra de microscopio con una solución radical tritilo tampón 6. Este protocolo describe la medición de las células de cianobacterias y, por tanto, para otros tipos de células, los ajustes adecuados puede ser necesaria en la etapa de preparación de la muestra. <ol><li> En primer lugar, algunos cuadrados de papel absorbente con un tamaño de ~ 400 400 micras se toman y se inserta en un tubo Eppendorf que posteriormente se llena con 1,2 ml de la suspensión de las cianobacterias (en una concentración de 40 mg / ml). </li><li> La suspensión se centrifuga durante 2 minutos a 6000 rpm en una microcentrífuga. </li><li> A continuación, el búfer de sobrenadante se elimina por completo a excepción de ~ 50 l que se dejan para evitar la deshidratación cianobacterias. Como resultado de este proceso, el papel absorbente está saturado por las células de cianobacterias. </li><li> Con unas pinzas finas, algunas fibras se extraen de la de papel y se coloca en el fondo de una taza-como titular de la muestra preparada especialmente de vidrio 7. Después de que un 3 mm de tritilo de BG-11 una solución 8, 9 (ver Esquema 1) se añade el soporte de muestras con la ayuda de una jeringa bien. El titular se sella con pegamento curable UV, dejando una pequeña salida de aire abierto. <table border="1"><tbody><tr><td> Archivo 4 </td><td> Stock 3 </td><td> Stock 2 </td><td> Stock 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 Mg EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> Citrato férrico amónico 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO4: 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> El ácido cítrico: 1H2O 0.6g/liter </td&gt; </tr><tr><td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Esquema 1. Preparación de BG-11 medianas. </li></ol> 3. ESR Micro-imágenes de los experimentos <ol><li> Para comenzar con el experimento de imágenes, a su vez en la velocidad de sedimentación globular de micro-sistema de imágenes e insertar la muestra en el resonador que va dentro de la sonda de imagen. </li><li> Ahora, usando el software de control por ordenador, configure el sistema en &quot;Tune&quot; y el modo de encontrar la frecuencia de resonancia de microondas de la sonda, que será utilizado para las mediciones de ESR. </li><li> A continuación, establezca el campo magnético estático en el valor que coincide con la frecuencia de microondas aplicada, establecer los parámetros de tiempo de la secuencia de pulsos y observar la señal de ESR para asegurarse de que el sistema funciona bien y la muestra está bien preparado. </li><li> A continuación, establezca los parámetros de imagen, tales como el número de píxeles, la fuerza de los gradientes, y la duración de los pulsos de gradiente a sus valores requeridos. </li><li> Después de la instalación, conseguir tres imágenes 3D ESR por una secuencia de eco de Hahn imagen de pulso (Figura 4) con una separación entre impulsos, los valores de  500, 600 y 700 ns. </li><li> La luz proyectada en la muestra se activa o desactiva en función de las condiciones experimentales necesarias. </li><li> Durante la adquisición, los datos se guardan automáticamente. Archivos de datos en bruto tesis se procesan a través de scripts de software Matlab para proporcionar imágenes de la concentración de tritilo radical y el tiempo de relajación T 2 del mapa, que se traduce en una imagen de la concentración de oxígeno a través de pre-existentes de calibración. </li></ol> 4. Resultados representante Los resultados del experimento son varias tridimensional ESR micro-imágenes grabadas en diferentes valores de τ. Típicas imágenes de los datos en bruto se proporcionan en la figura 5. Los tres mejores imágenes, medido bajo condiciones de oscuridad, son muy similares, excepto por la reducción en la intensidad de la señal. Por otro lado, el patrón cambia la imagen a la radiación de la luz debido a los tiempos de relajación en diferentes partes de la muestra. Estos datos se pueden procesar de 1 a obtener una imagen de amplitud, como se muestra en la Figura 6 y también las imágenes del tiempo de relajación, T 2 (Figura 7). La T 2 imágenes se traducen en valores de concentración de oxígeno a través de una curva de calibración pre-existente que une a la concentración de oxígeno en el tiempo de relajación a través de la ecuación: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="La ecuación 1" /> Aquí, T 2 0 es el tiempo de relajación spin-spin de la sonda en condiciones de anoxia (dependiendo de la concentración de la sonda, C, y su coeficiente de difusión, D), y k es una constante de proporcionalidad. En la mayoría de los casos, el coeficiente de difusión no varía mucho de las muestras en vivo (aunque, si es necesario, puede, en principio, ser directamente evaluadas también por ESR 6, 10), y la concentración de giro se obtiene durante el proceso de imágenes. Por lo tanto, esta relación se puede utilizar para medir directamente la concentración de oxígeno. Volviendo a la Figura 6, es evidente de la imagen de la amplitud que las células de cianobacterias se localizaron principalmente en el lado derecho del titular de la muestra. Por otra parte, sobre la base de la figura 7, está claro que la luz se inicia la producción de O 2 y causa un aumento significativo en la solución de O 2 de la concentración, sobre todo en los voxels cerca de las cianobacterias. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Los niveles de energía de resonancia de spin electrónico. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: imagen típica de la concentración de oxígeno de un ratón con tumores. La imagen de la izquierda muestra la información anatómica, basada en una imagen de resonancia magnética. Un radical libre estable orgánica se inyectó a los ratones y sus características ESR proporcionan la concentración de oxígeno en su entorno (derecha). ESR-basada en los resultados se superponen a la imagen anatómica MRI. Campo de visión es de 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Dos ejemplos de alta resolución de micro-escala ESR imágenes de la muestra photolithographically generado con N @ C 60 en polvo (izquierda) y los cristales CFIG paramagnético (derecha) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: Típica Hahn imágenes que muestran la secuencia de pulsos de microondas (MW) y el gradiente, G x, y G y G z pulsos. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: Típica de datos sin ESR micro-imágenes: a, b, c son los datos en bruto de la muestra cianobacteria sin iluminación de la luz medida para τ = 500600700 ns, respectivamente. Los literales d, e, y son las mismas que a, b, c, pero con una iluminación de luz. La intensidad se representan en la escala arbitraria (pero es consistente dentro de cada conjunto de tres imágenes en bruto oscuras o claras de datos) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6: la imagen de amplitud correspondiente a la concentración de radicales en la solución (escala arbitraria). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7: T 2 imágenes y el correspondiente [O 2] Los valores en negro (izquierda) y luz (derecha) las condiciones.

<ol>
	<li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance.">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li><li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution:+methodology+and+applications.">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li><li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+EPR:+when,+how+and+why?.">In vivo EPR: when, how and why?.</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li><li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).</li><li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI.">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li><li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE.">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , (2010).</li><li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy.">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li><li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae.">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+Assignments,+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria.">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance.">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li></ol>

Este protocolo muestra cómo ESR micro-imagen se pueden aplicar a la concentración de oxígeno del mapa cerca de vivir pequeñas muestras. Una resolución espacial de aproximadamente 30 x 30 x 100 m se demuestra, con casi micromolar sensibilidad concentración de oxígeno y sub-femtomol sensibilidad absoluta de oxígeno por voxel. El uso de ESR micro-imágenes para el mapeo de oxígeno cerca de las células complementa las técnicas disponibles actualmente sobre la base de micro-electrodos o de fluorescencia / fosforescencia. Además, con la sonda paramagnética adecuada, será de fácil aplicación para intracelular de oxígeno micro-imagen, una capacidad que otros métodos resulta muy difícil de lograr. En un futuro próximo tenemos la intención de mejorar aún más esta metodología para ofrecer imágenes en directo de la muestra con una resolución de unos pocos micrones, proporciona parámetros de contraste, tales como la concentración de superóxido, la acidez (pH), el coeficiente de difusión de la sonda y, por supuesto, la concentración de oxígeno. Estas funciones son complementarias a las actuales metodologías basadas en la óptica, tanto en términos de tipo de cambio y también de las características de las muestras (por ejemplo, la falta de transparencia muestras de espesor y, en algunos casos, las mediciones intracelulares vs extracelular).

<table><tbody><tr><td>Centrifuge </td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical</td><td>Novosibirsk</td><td></td><td>Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>BG-11 buffer</td><td></td><td></td><td>For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9.</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolet Curing</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63, or NOA61.</td><td></td></tr></tbody></table>

electron spin resonance micro-imaging of live species for oxygen mapping

Este protocolo describe una resonancia de spin electrónico (ESR) micro-método para imágenes tridimensionales de mapeo de los niveles de oxígeno en el entorno inmediato de las células vivas con una resolución de escala micrométrica 1. El oxígeno es una de las moléculas más importantes en el ciclo de vida. Que sirve como receptor terminal de electrones de la fosforilación oxidativa en las mitocondrias y se utiliza en la producción de especies reactivas del oxígeno. Las mediciones de oxígeno son importantes para el estudio de las funciones mitocondriales y metabólicos, vías de señalización, los efectos de los diversos estímulos, permeabilidad de la membrana, y la diferenciación de la enfermedad. El consumo de oxígeno es por lo tanto, un marcador informativo del metabolismo celular, que es ampliamente aplicable a diferentes sistemas biológicos de las mitocondrias en las células de organismos completos. Debido a su importancia, muchos métodos han sido desarrollados para las mediciones de oxígeno en los sistemas vivos. Los intentos actuales para proporcionar imágenes de alta resolución de oxígeno se basan principalmente en la fluorescencia óptica y los métodos de fosforescencia que no ofrecen resultados satisfactorios, ya que emplean sondas con fotografías de alta toxicidad y sensibilidad con poco oxígeno. ESR, que mide la señal de las sondas paramagnéticas exógenos en la muestra, es conocida por proporcionar mediciones muy precisas de la concentración de oxígeno. En un caso típico, las mediciones de ESR mapa LineShape ampliación de la sonda y / o relajación, acortando el tiempo que están vinculados directamente a la concentración de oxígeno local. (El oxígeno es paramagnética, por lo tanto, al chocar con la sonda paramagnética exógenos, que falta de su tiempo de relajación.) Tradicionalmente, este tipo de experimentos se llevan a cabo con una resolución baja, a escala milimétrica ESR para obtener imágenes de pequeños animales. Aquí mostramos como ESR imágenes también se pueden realizar en la escala micrométrica para el examen de las pequeñas muestras vivas. ESR micro-imagen es una metodología relativamente nueva que permite la adquisición de resolver espacialmente las señales de ESR con una resolución de 1 micra acercarse a temperatura ambiente 2. El principal objetivo de este protocolo de papel es mostrar cómo este nuevo método, junto con el nuevo desarrollo sensibles al oxígeno, sondas, se puede aplicar a la cartografía de los niveles de oxígeno en pequeñas muestras vivas. Una resolución espacial de aproximadamente 30 x 30 x 100 m se demuestra, con casi micromolar sensibilidad concentración de oxígeno y sub-femtomol sensibilidad absoluta de oxígeno por voxel. El uso de ESR micro-imágenes para el mapeo de oxígeno cerca de las células complementa las técnicas disponibles actualmente sobre la base de micro-electrodos o de fluorescencia / fosforescencia. Además, con la sonda paramagnética adecuada, sino que también será de fácil aplicación para intracelular de oxígeno micro-imagen, una capacidad que otros métodos resulta muy difícil de lograr.

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Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Este protocolo describe un método de tres dimensiones escala micrométrica imágenes de la concentración de oxígeno en el entorno inmediato de las células vivas por microscopía electrónica de resonancia de spin.

Resonancia de spin electrónico micro imágenes en vivo de las especies para la asignación de oxígeno

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

22.3K vistas.  The Technion, Israel Institute of Technology. Este protocolo describe un método de tres dimensiones escala micrométrica imágenes de la concentración de oxígeno en el entorno inmediato de las células vivas por microscopía electrónica de resonancia de spin.

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Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of redox-regulated signaling in biological settings. Electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) is the only direct method to assess free radicals unambiguously. Its advantage is that it detects physiologic levels of specific species with a high specificity, but it does require specialized technology, careful sample preparation, and appropriate controls to ensure accurate interpretation of the data. Cyclic hydroxylamine spin probes react selectively with superoxide or other radicals to generate a nitroxide signal that can be quantified by EPR spectroscopy. Cell-permeable spin probes and spin probes designed to accumulate rapidly in the mitochondria allow for the determination of superoxide concentration in different cellular compartments.
In cultured cells, the use of cell permeable 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) along with and without cell-impermeable superoxide dismutase (SOD) pretreatment, or use of cell-permeable PEG-SOD,&#160;allows for the differentiation of extracellular from cytosolic superoxide. The mitochondrial 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) allows for measurement of mitochondrial ROS (predominantly superoxide).
Spin probes and EPR spectroscopy can also be applied to in vivo models. Superoxide can be detected in extracellular fluids such as blood and alveolar fluid, as well as tissues such as lung tissue. Several methods are presented to process and store tissue for EPR measurements and deliver intravenous 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin probe in vivo. While measurements can be performed at room temperature, samples obtained from in vitro and in vivo models can also be stored at -80 &#176;C and analyzed by EPR at 77 K. The samples can be stored in specialized tubing stable at -80 &#176;C and run at 77 K to enable a practical, efficient, and reproducible method that facilitates storing and transferring samples.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is an unambiguous method to measure free radicals. The use of selective spin probes allows for detection of free radicals in different cellular compartments. We present a practical, efficient method to collect biological samples that facilitate treating, storing, and transferring samples for EPR measurements.

Uso de resonancia paramagnética electrónica en muestras biológicas a temperatura ambiente y 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Investigación

Bioquímica

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs O2 sensitive luminescent sensor foils (planar optodes) in combination with a specialized camera system for imaging luminescence lifetime in the frequency-domain. Planar optodes are prepared by dissolving the O2-sensitive indicator dye in a polymer and spreading the mixture on a solid support in a defined thickness via knife coating. After evaporation of the solvent, the planar optode is placed in close contact with the sample of interest - here demonstrated with the roots of the aquatic plant Littorella uniflora. The O2 concentration-dependent change in the luminescence lifetime of the indicator dye within the planar optode is imaged via the backside of the transparent carrier foil and aquarium wall using a special camera. This camera measures the luminescence lifetime (&#181;s) via a shift in phase angle between a modulated excitation signal and emission signal. This method is superior to luminescence intensity imaging methods, as the signal is independent of the dye concentration or intensity of the excitation source, and solely relies on the luminescence decay time, which is an intrinsically referenced parameter. Consequently, an additional reference dye or other means of referencing are not needed. We demonstrate the use of the system for macroscopic O2 imaging of plant rhizospheres, but the camera system can also easily be coupled to a microscope.

Luminescence Lifetime Imaging of O2 with a Frequency-Domain-Based Camera System

We describe the use of a novel, frequency-domain luminescence lifetime camera for mapping 2D O2 distributions with optical sensor foils. The camera system and image analysis procedures are described along with the preparation, calibration and application of sensor foils for visualizing the O2 microenvironment in the rhizosphere of aquatic plants.

Luminescence Lifetime Imaging of O2 con un sistema de cámara basado en dominio de frecuencia

We describe a method to image dissolved oxygen (O2), in 2D at high spatial (&#60; 50-100 &#181;m) and temporal (&#60; 10 s) resolution. The method employs ...

Química

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

El rápido escaneo de electrones resonancia paramagnética abre nuevas vías para Imaging fisiológicamente parámetros importantes<em&gt; En Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Bioingeniería

<meta charset="utf8"></head><body>Imágenes preclínicas de los niveles de oxígeno tumoral mediante EPRI y ultrasonido

Tumor Hypoxia Assessment: In Vivo 3D Oxygen Imaging Through Electron Paramagnetic Resonance

The precise and real-time measurement of oxygen partial pressure (pO2) brings valuable information in many pathologies, including cancer. Low tumor pO2 (i.e., hypoxia) is connected to tumor aggressiveness and poor response to therapy. The quantification of tumor pO2 allows the evaluation of treatment effectiveness. Electron Paramagnetic Resonance Imaging (EPRI), particularly Pulse EPRI, has emerged as an advanced three-dimensional (3D) method of assessing tissue oxygenation in vivo. This innovation was enabled by the technological developments in EPR (Electron Paramagnetic Resonance) and the application of the water-soluble oximetric spin probes from the triaryl family, offering fast and sensitive oxygenation data. The relaxation time of the spin probe (T1 and/or T2) provides accurate information about pO2 in selected voxels.
Human glioblastoma LN229 tumors were grown in the interscapular fad pad of BALB/c nude mice. Ultrasound (US) imaging was used as a reference for tumor anatomical information. To image tissue pO2, the animals were placed in a fixed position in the animal bed with fiducials, enabling registration between the imaging modalities. After the OX071 contrast agent was administered, EPRI was performed, followed by US B-mode. Because of the low spin probe toxicity, the procedure can be repeated during tumor growth or treatment. Following imaging, the registration process was carried out using software written in MATLAB. Ultimately, the hypoxic fraction can be calculated for a specific tumor, and the histogram of pO2 tissue distribution can be compared over time. EPRI combined with ultrasound is an excellent tool for oxygen mapping of tumors in the preclinical setting.

<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación de la hipoxia tumoral: imágenes de oxígeno en 3D in vivo mediante resonancia paramagnética electrónica

Quantitative 3D oxygen maps of murine tumors were imaged noninvasively using Pulse Electron Paramagnetic Resonance. Ultrasound B-mode and Power Doppler were used for anatomy and vascular structure. Images from both modalities were superimposed enabling multi-parametric tumor analysis.

Evaluación de la hipoxia tumoral: imágenes de oxígeno en 3D in vivo mediante resonancia paramagnética electrónica 

The precise and real-time measurement of oxygen partial pressure (pO2) brings valuable information in many pathologies, including cancer. Low tumor pO2 ...

Investigación sobre el cáncer

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

La detección de óxido nítrico y el radical anión superóxido por espectroscopía de resonancia paramagnética de electrones de las células utilizando atrapadores

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Biología

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Biofabricación asequible asistida por microscopía de oxígeno de esferoides multicelulares

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro del ratón para el diagnóstico de tejidos

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Resonancia de spin electrónico micro imágenes en vivo de las especies para la asignación de oxígeno

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

Uso de resonancia paramagnética electrónica en muestras biológicas a temperatura ambiente y 77 K

Luminescence Lifetime Imaging of O₂ con un sistema de cámara basado en dominio de frecuencia

El rápido escaneo de electrones resonancia paramagnética abre nuevas vías para Imaging fisiológicamente parámetros importantes

Evaluación de la hipoxia tumoral: imágenes de oxígeno en 3D in vivo mediante resonancia paramagnética electrónica

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La detección de óxido nítrico y el radical anión superóxido por espectroscopía de resonancia paramagnética de electrones de las células utilizando atrapadores

Biofabricación asequible asistida por microscopía de oxígeno de esferoides multicelulares

In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada

Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro del ratón para el diagnóstico de tejidos