Ce travail a été partiellement financé par des subventions non. 213/09 de la science israélienne Fondation, accorder aucune. 2005258 de la fondation du BSF, accorder aucune. 201665 du Conseil européen de la recherche (CER), et par l&#39;Institut Russell Berrie Nanotechnology au Technion. Nous reconnaissons l&#39;aide du professeur Noam Adir et Faris Salame de la Faculté de chimie Schulich du Technion concernant la fourniture et la manutention des cyanobactéries. L&#39;aide et le soutien de Svetlana Yoffis du Technion Micro-Nano unité de fabrication est grandement appréciée.

1. Aperçu de l&#39;ESR de micro-imagerie D&#39;abord, nous donner une brève explication de l&#39;ESR, la microscopie ESR, et les différentes composantes de notre système, puis nous décrirons les expériences d&#39;imagerie réelle. Résonance paramagnétique électronique est une technique spectroscopique dans lequel le rayonnement électromagnétique à une fréquence spécifique est absorbée par les molécules avec des spins des électrons non appariés, placé sous un champ magnétique externe statique (figure 1). ESR est employé dans de vastes domaines de la science, comme la chimie, la biologie, la physique et la science des matériaux, pour la détection et l&#39;identification des radicaux libres et des centres paramagnétiques. C&#39;est une méthode puissante pour étudier l&#39;environnement de molécules paramagnétiques d&#39;espèces vivent et fournit des informations sur l&#39;acidité (pH), la viscosité, d&#39;oxygène et d&#39;espèces réactives d&#39;oxygène concentrations 3. Pour les échantillons hétérogènes, ESR informations spectrales peuvent être obtenus d&#39;une manière résolue spatialement (ie, par l&#39;obtention d&#39;une image), grâce à l&#39;utilisation des gradients de champ magnétique 4. Ceci est très similaire à la méthode plus commune de l&#39;imagerie par résonance magnétique (IRM) qui observe principalement des spins des protons. Jusqu&#39;à maintenant, ces techniques d&#39;imagerie RPE ont été appliquées pour les spécimens vivants de la taille relativement grande de quelques centimètres et en millimètres échelle résolution. (Par exemple, voir la figure 2, tirée de la référence 5.) Un développement relativement récent dans l&#39;imagerie ESR est l&#39;extension de ses capacités en regardant les petits animaux à l&#39;échelle millimétrique résolution à la mesure des échantillons millimétriques et submillimétriques-size avec l&#39;échelle du micron résolution. Ce champ est connue comme la microscopie ESR, qui aujourd&#39;hui peuvent fournir des images 3D ESR avec une résolution voisine de 1 micron 2 (voir des exemples représentatifs de la figure 3). Un microscope ESR est essentiellement similaire à un spectromètre RPE conventionnelle. Il a un aimant pour générer le champ statique, un système de micro-ondes pour l&#39;excitation de spin et de détection de signal, une sonde pour la tenue de l&#39;échantillon, et une console informatisée pour contrôler le processus d&#39;acquisition et de traitement des données. D&#39;autres composants uniques de l&#39;imagerie en général et ESR existantes également en microscopie ESR sont magnétiques sources gradient de champ, qui font partie du système électronique, et des bobines de gradient qui sont situés dans la sonde d&#39;imagerie. Plus de détails sur notre système spécifiques sont présentés dans le film du protocole et décrit dans la référence 2. 2. Préparation ESR exemples de micro-imagerie Cette étape décrit la méthode pour la préparation des échantillons pour l&#39;ESR de micro-imagerie expérience. A la fin de cette étape de cellules sont placées sur le fond d&#39;un conteneur spécialement préparé ESR échantillon de verre de microscopie avec un trityle radicale 6 solution tampon. Ce protocole décrit la mesure de cellules de cyanobactéries, et donc, pour d&#39;autres types de cellules, les ajustements appropriés peuvent être nécessaires au stade de la préparation de l&#39;échantillon. <ol><li> Tout d&#39;abord, quelques carrés de papier absorbant avec une taille d&#39;environ 400 400 um sont prises et inséré dans un tube Eppendorf qui est ensuite remplie de 1,2 ml de la suspension de cyanobactéries (à une concentration de 40 mg / ml). </li><li> La suspension est centrifugée pendant 2 minutes à 6000 RPM dans une microcentrifugeuse. </li><li> Suite à cela, le tampon surnageant est complètement enlevée, sauf pour ~ 50 uL qui sont à gauche pour éviter la déshydratation des cyanobactéries. En conséquence de ce processus, le papier absorbant est maintenant saturé par les cellules de cyanobactéries. </li><li> En utilisant une pince à épiler fine, quelques fibres sont extraites du papier et placés sur le fond d&#39;une coupelle porte-verre échantillons préparés spécialement 7. Après qu&#39;un mm 3 de trityle dans BG-11 solution de 8, 9 (voir schéma 1) est ajouté au porte-échantillon à l&#39;aide d&#39;une seringue fine. Le titulaire est alors scellé à l&#39;aide de la colle UV curable, laissant une petite ouverture de sortie d&#39;air. <table border="1"><tbody><tr><td> Stock 4 </td><td> Stock 3 </td><td> Stock 2 </td><td> Stock 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 Mg EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> Ferrique 0.6g/liter citrate d&#39;ammonium </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> L&#39;acide citrique: 1H2O 0.6g/liter </td&gt; </tr><tr><td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Namoo 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Schéma 1. Préparation du BG-11 moyennes. </li></ol> 3. ESR expériences de micro-imagerie <ol><li> Pour commencer l&#39;expérience d&#39;imagerie, tournez sur la RSE de micro-imagerie système et insérez l&#39;échantillon dans le résonateur qui va à l&#39;intérieur de la sonde d&#39;imagerie. </li><li> Maintenant, en utilisant le logiciel de contrôle d&#39;ordinateur, réglez le système sur le mode &quot;Tune&quot; et de trouver la fréquence micro-ondes de résonance de la sonde, qui sera utilisé pour les mesures de l&#39;ESR. </li><li> Suite à cela, définissez le champ magnétique statique sur la valeur qui correspond à la fréquence micro-ondes appliquée, réglez les paramètres de timing pour la séquence d&#39;impulsions et d&#39;observer le signal ESR pour s&#39;assurer que le système fonctionne bien et l&#39;échantillon est bien préparé. </li><li> Ensuite, définissez les paramètres d&#39;imagerie, telles que le nombre de pixels, la force des gradients, et la longueur des impulsions de gradient à leurs valeurs requises. </li><li> Après l&#39;installation, recueillir trois images 3D ESR par une séquence d&#39;écho de Hahn imagerie impulsion (figure 4) avec une séparation interpulse, les valeurs de  500, 600 et 700 ns. </li><li> Lumière projetée à l&#39;échantillon est allumé ou éteint selon les conditions requises expérimental. </li><li> Pendant l&#39;acquisition, les données sont automatiquement sauvegardées. Les thèses fichiers de données brutes sont ensuite traitées via le script du logiciel Matlab pour fournir des images de la concentration trityle radical et le temps de relaxation T 2 carte, qui est traduit en une image la concentration en oxygène via une pré-existants d&#39;étalonnage. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Les résultats de l&#39;expérience sont en trois dimensions de plusieurs ESR micro-images enregistrées à des valeurs τ différents. Typiques premières images données sont fournies dans la Figure 5. Les trois meilleurs images, mesurée dans des conditions sombres, sont très similaires, sauf pour la réduction de l&#39;intensité du signal. D&#39;autre part, les changements de modèle d&#39;image sous irradiation lumineuse due à des temps de relaxation différents dans différentes parties de l&#39;échantillon. Ces données peuvent être traitées une à obtenir une image d&#39;amplitude, comme le montre la figure 6 et également des images du temps de relaxation T 2 (figure 7). Les deux images T sont convertis en valeurs de concentration d&#39;oxygène à travers une courbe de calibration pré-existante qui relie la concentration en oxygène au temps de relaxation grâce à l&#39;équation: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="L&#39;équation 1" /> Ici, T 2 0 est le temps de relaxation spin-spin de la sonde dans des conditions anoxiques (en fonction de la concentration de la sonde, C, et son coefficient de diffusion, D), et k est une constante de proportionnalité. Dans la plupart des cas, le coefficient de diffusion ne varie pas beaucoup d&#39;échantillons vivants (quoique, si nécessaire, il peut en principe être directement évalués également par ESR 6, 10), et la concentration de rotation est obtenu au cours du processus d&#39;imagerie. Par conséquent, cette relation peut être utilisée pour mesurer directement la concentration en oxygène. Pour en revenir à la figure 6, il est évident d&#39;après l&#39;image d&#39;amplitude que les cellules de cyanobactéries ont été principalement situés sur le côté droit du porte-échantillon. En outre, sur la figure 7, il est clair que la lumière déclenche la production d&#39;O 2 et provoque une augmentation significative de la solution S 2 de concentration, principalement dans les voxels à proximité de la cyanobactérie. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Les niveaux d&#39;énergie dans la résonance spin de l&#39;électron. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: l&#39;image typique de la concentration en oxygène d&#39;une souris portant une tumeur. L&#39;image de gauche montre les informations anatomiques, basé sur une image IRM. Un libre stable radical organique a été injecté à la souris et ses caractéristiques ESR fournir la concentration d&#39;oxygène à son environnement (à droite). ESR-base des résultats sont superposées sur l&#39;image IRM anatomique. Champ de vision est de 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3: Deux exemples de haute résolution de micro-échelle ESImages R de l&#39;échantillon photolithographie générés avec N @ C 60 en poudre (à gauche) et des cristaux paramagnétiques LIPC (à droite) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4: typique Hahn imagerie séquence d&#39;impulsions micro-ondes montrant l&#39;(MW) et le gradient, G x, G y et z G impulsions. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5: typique données brutes ESR micro-images: a, b et c sont des données brutes de l&#39;échantillon cyanobactérie sans éclairage en lumière mesurée pour τ = 500600700 ns, respectivement. Articles D, E, et sont les mêmes que a, b et c, mais avec un éclairage en lumière. L&#39;intensité est tracée en échelle arbitraire (mais est compatible au sein de chaque ensemble de trois images sombres ou lumineuses données brutes) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6: image d&#39;amplitude correspondant à la concentration dans la solution radicale (échelle arbitraire). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Figure 7" /> Figure 7: T 2 images et les correspondants [O 2] valeurs sous sombres (à gauche) et léger (à droite) les conditions.

<ol>
	<li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance.">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li><li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution:+methodology+and+applications.">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li><li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+EPR:+when,+how+and+why?.">In vivo EPR: when, how and why?.</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li><li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).</li><li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI.">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li><li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE.">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , (2010).</li><li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy.">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li><li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae.">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+Assignments,+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria.">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance.">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li></ol>

Ce protocole montre comment ESR de micro-imagerie peut être appliquée à cartographier la concentration d&#39;oxygène à proximité de vivre de petits échantillons. Une résolution spatiale de ~ 30 x 30 x 100 um est démontré, avec une sensibilité quasi-micromolaires concentration en oxygène et sous-femtomoles sensibilité à l&#39;oxygène absolue par voxel. L&#39;utilisation de l&#39;ESR de micro-imagerie pour la cartographie de l&#39;oxygène à proximité de cellules complète les techniques actuellement disponibles à base de micro-électrodes ou de fluorescence / phosphorescence. Par ailleurs, avec la sonde paramagnétique appropriée, il sera facilement applicable pour l&#39;oxygène intracellulaire de micro-imagerie, une capacité qui trouvent d&#39;autres méthodes très difficile à réaliser. Dans le futur proche, nous prévoyons sur l&#39;amélioration de cette méthodologie pour fournir des images en direct de l&#39;échantillon avec une résolution de quelques microns, fournissant des paramètres de contraste telles que la concentration d&#39;oxyde de super, l&#39;acidité (pH), coefficient de diffusion de la sonde et, bien sûr, la concentration en oxygène. Ces capacités sont complémentaires à l&#39;actuelle optique basée sur des méthodologies à la fois en termes de type de contraste et aussi des caractéristiques des échantillons (par exemple, non transparente des échantillons d&#39;épaisseur et, dans certains cas, les mesures intracellulaire vs extracellulaire).

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Heraus, 75003235</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Microliter 7000.5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet Curing</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA63, or NOA61.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electron spin resonance micro-imaging of live species for oxygen mapping

Ce protocole décrit une résonance de spin électronique (ESR) de micro-imagerie méthode pour la cartographie en trois dimensions des niveaux d&#39;oxygène dans l&#39;environnement immédiat des cellules vivantes présentant de l&#39;échelle du micron de résolution 1. L&#39;oxygène est l&#39;une des molécules les plus importants dans le cycle de vie. Il sert de l&#39;accepteur d&#39;électrons terminal de la phosphorylation oxydative dans les mitochondries et est utilisé dans la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène. Les mesures de l&#39;oxygène sont importants pour l&#39;étude des fonctions mitochondriales et métaboliques, les voies de signalisation, les effets de différents stimuli, perméabilité de la membrane, et la différenciation de la maladie. La consommation d&#39;oxygène est donc un marqueur informatif du métabolisme cellulaire, qui est largement applicable à divers systèmes biologiques à partir des mitochondries dans les cellules d&#39;organismes entiers. En raison de son importance, de nombreuses méthodes ont été développées pour les mesures de l&#39;oxygène dans les systèmes de vivre. Les tentatives actuelles pour fournir l&#39;oxygène d&#39;imagerie à haute résolution sont essentiellement basées sur la fluorescence optique et les méthodes de phosphorescence qui ne fournissent pas de résultats satisfaisants car ils emploient des sondes avec photo-toxicité et une sensibilité élevées en oxygène est faible. ESR, qui mesure le signal provenant de sondes paramagnétiques exogènes dans l&#39;échantillon, est connu pour fournir des mesures très précises de la concentration en oxygène. Dans un cas typique, les mesures ESR carte élargissement LineShape de la sonde et / ou de détente en temps le raccourcissement qui sont directement liés à la concentration en oxygène local. (Oxygène est paramagnétique, par conséquent, en cas de collision avec la sonde paramagnétique exogènes, c&#39;est la brièveté de son temps de relaxation). Traditionnellement, ces types d&#39;expériences sont réalisées à faible résolution, l&#39;échelle millimétrique ESR pour l&#39;imagerie des petits animaux. Nous montrons ici comment ESR imagerie peuvent également être effectuées dans le micron-échelle pour l&#39;examen de petits échantillons vivants. ESR de micro-imagerie est une méthodologie relativement nouvelle qui permet l&#39;acquisition de signaux résolus spatialement ESR avec une résolution voisine de 1 micron à 2 température ambiante. L&#39;objectif principal de ce protocole-papier est de montrer comment cette nouvelle méthode, avec récemment développé des sondes sensibles à l&#39;oxygène, peuvent être appliquées à la cartographie des niveaux d&#39;oxygène dans de petits échantillons vivants. Une résolution spatiale de ~ 30 x 30 x 100 um est démontré, avec une sensibilité quasi-micromolaires concentration en oxygène et sous-femtomoles sensibilité à l&#39;oxygène absolue par voxel. L&#39;utilisation de l&#39;ESR de micro-imagerie pour la cartographie de l&#39;oxygène à proximité de cellules complète les techniques actuellement disponibles à base de micro-électrodes ou de fluorescence / phosphorescence. Par ailleurs, avec la sonde paramagnétique appropriée, il sera aussi facilement applicables pour l&#39;oxygène intracellulaire de micro-imagerie, une capacité qui trouvent d&#39;autres méthodes très difficile à réaliser.

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Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Ce protocole décrit une méthode pour l&#39;échelle du micron imagerie en trois dimensions de la concentration d&#39;oxygène dans l&#39;environnement immédiat des cellules vivantes par microscopie résonance de spin des électrons.

Résonance de spin électronique Micro-imagerie d&#39;espèces vivantes pour la cartographie d&#39;oxygène

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K vues.  The Technion, Israel Institute of Technology. Ce protocole décrit une méthode pour l'échelle du micron imagerie en trois dimensions de la concentration d'oxygène dans l'environnement immédiat des cellules vivantes par microscopie résonance de spin des électrons.

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A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Une technique non invasive cheveux d&#39;échantillonnage pour obtenir l&#39;ADN de haute qualité provenant Elusive petits mammifères

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Recherche

Biologie

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Détection de l&#39;oxyde nitrique et de l&#39;anion superoxyde radical par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique à partir de cellules en utilisant des pièges de spin

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Détection, visualisation et la quantification de la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène dans un système modèle Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Amélioration de la détection du Nord Blot des petits ARN espèces en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Caractérisation de calcification Events Utilisation en direct optiques et Electron Microscopy Techniques dans un tubeworm Marine

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

La cartographie simultanée et au dosage des ribonucléotides dans l’ADN Mitochondrial humain

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Enquête sur les néfastes effets de basse pression Plasma stérilisation sur la survie de Bacillus subtilis Spores en utilisant Live microscopie des cellules

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient production of ROS in situ efficiently activates cell proliferation in stem cell niches and stimulates tissue regeneration as strongly manifested through the acceleration of burn healing and hair follicle growth processes. The protocol is based on a regulatable photodynamic treatment that treats the tissue with precursors of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX and further irradiates the tissue with red light under tightly controlled physicochemical parameters. Overall, this protocol constitutes an interesting experimental tool to analyze ROS biology.

The aim of this protocol is to induce transient in vivo production of nonlethal levels of reactive oxygen species (ROS) in mouse skin, further promoting physiological responses in the tissue.

Stimulation de niches de cellules souches et régénération tissulaire dans la peau de souris par photogénération commutable d’espèces réactives de l’oxygène dépendantes de la protoporphyrine IX in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Évaluation du risque agrochimique pour les reines d’abeilles mellifères accouplées

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...