ويدعم عملنا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة / NIGMS ، جبهة الخلاص الوطني ، وزارة الزراعة / NIFA وBARD إلى VC.

خلفية متحد الجبلة النقل الجزيئات من خلال الاتصالات بين الخلايا النباتية ، ورابطات هيولية ، هو موضع اهتمام العديد من الأطباء وعلماء الأحياء النباتية. على سبيل المثال ، لا يعرف العديد من البروتينات الفيروسية لتنظيم plasmodesmal حدود حجم الاستبعاد لتمكين الحركة الفيروسية 1-3. كذلك ، يفترض بعض البروتينات المحلية ، ومن بينها منظمات تنموية هامة ، للانتقال من خلية إلى أخرى ، ويفترض من خلال رابطات هيولية ، إلى وظيفة غير خلية مستقلة 4. وهكذا ، منهجية يمكن الاعتماد عليها لتحديد ووضع تصور لنقل الجزيئات بين الخلايا النباتية بكثير في الطلب. 1) زراعة النباتات المستهدفة لكفاءة عالية التحول ، يجب استخدام صحي ، ومحطات قوية. النباتات Arabidopsis 1. تنمو في مصنع واحد Arabidopsis الموالية للBX ميكس في وعاء (10 سم x 10 سم x 10 سم) في غرفة البيئة التي تسيطر عليها مع الإضاءة قصيرة (8 ساعات من ضوء 130-150 م -2 -1 μE s في 23 ° C/16 ساعة مظلمة عند 20 درجة مئوية) والرطوبة النسبية 40-65 ٪ لمدة 6 إلى 8 أسابيع 5. تسميد منهم أحيانا مع المنتجات المتاحة تجاريا كما هو موضح 5. ويتم اختيار الأوراق مع حجم أكبر من 15 ملم × 35 ملم (قياس طول يشمل سويقات) للتجارب. 2. ن. benthamiana ونون تبغ تنمو في مصنع واحد الموالية للBX ميكس في وعاء (20 سم x 20 سم x 20 سم) في غرفة البيئة التي تسيطر عليها مع الإضاءة الطويلة (16 ساعة من 130-150 متر μE -2 -1 ضوء s في 23 درجة مئوية 8 / ساعة مظلمة عند 20 درجة مئوية) والرطوبة النسبية 40-65 ٪ لمدة 7 إلى 10 أسابيع. تسميد منهم أحيانا مع المنتجات المتاحة تجاريا باسم وصفها. يترك مع حجم أكبر من 50 ملم 70 ملم x لN. benthamiana أو 100 ملم x 125 ملم لN. تبغ (هذه القياسات لا تشمل طول سويقات) هي المحدد للتجارب. 2) إعداد جين خرطوشة بندقية مع الحمض النووي الذهب المطلي المجهرية الدقيقة وقد وصفت في بروتوكول لهذه الخطوة التجريبية بالتفصيل سابقا 6. من المهم جدا لاستخدام الحمض النووي البلازميد المنقى جيدا في تركيزات عالية (~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر) للحصول على أعلى كفاءة التحويل لسهولة التحليل المجهري مبائر خلال مراحل لاحقة من التجربة. لهذا الاختبار ، فمن المهم التأكد من أن لا أعد خرطوشة تحويل اثنين أو أكثر من الخلايا المجاورة في نفس الوقت في التردد العالي ، لأنه يتم استخدام عدد من الخلايا ربط مع كتلة إشارة الفلورسنت كمؤشر لمدى النقل متحد الجبلة (أي ، خلية واحدة تحتوي على أي إشارة إلى حركة ، في حين أن كتلة حركة يشير إشارة multicell). يمكن التحقق من جودة كل خرطوشة من خلال تحليل التعبير عن بروتين 16-20 قصف آخر ساعة. بروتوكول لدينا 6 خراطيش تنتج مجموعات التعبير التي تدر multicell فقط في 3 ٪ &lt;لجميع الأحداث التعبير في هذا الإطار الزمني ، وبالتالي مناسبة لهذه التجربة. 3) تسليم Biolistic من الحمض النووي المغلفة المجهرية الدقيقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أوراق المرحلة التنموية نفسها (أي مع نفس الحجم ونفس الفئة العمرية ، راجع الخطوة 1) مع شفرة حلاقة حادة والمكان على الفور مع الجانبين مجافي المحور مواجهة على سطح مستو الستايروفوم. مجافي المحور الجانب من ورقة يمثل الركيزة أفضل للقصف بسبب كثافته أقل شعري الشكل وأرق بشرة. ينبغي تغطية يترك Arabidopsis ، وذلك بسبب صغر حجمها نسبيا ، مع قطعة من شبكة نافذة الشاشة ، وشبكة المضمون ثم مع pushpins إلى السطح الستايروفوم. الحفاظ على أوراق شقة يزيد من كفاءة توصيل الجسيمات ، ويقلل من الأضرار التي لحقت الأنسجة أثناء microbombardment. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج خرطوشة مع الحمض النووي المغلفة المجهرية الدقيقة (المعد في الخطوة 1) في البندقية. لArabidopsis ، يتم تنفيذ إطلاق النار على ضغوط من 80-110 رطل ل1 ميكرون المجهرية الدقيقة ، و140-160 رطل عن 0.6 ميكرومتر المجهرية الدقيقة. لN. benthamiana والتبغ ، ويتم تنفيذ إطلاق النار على ضغوط من 100-120 رطل ل1 ميكرون المجهرية الدقيقة ، و160-180 رطل عن 0.6 ميكرومتر المجهرية الدقيقة. لArabidopsis ، فإننا عادة ما تستخدم خرطوشة واحدة لكل ورقة ، لأن كل ورقة لديها ما يكفي فقط لمساحة طلقة واحدة المجهرية الدقيقة التي تنتشر على مساحة من 10-12 ملم في القطر. مع أكبر N. benthamiana وأوراق التبغ ، والقصف متعددة من ورقة نفس ممكنة ، ومع ذلك ، لا بد من القيام به في مواقف متماثلة على كل جانب من منتصف الضلع لاستهداف المناطق ورقة في هذه المرحلة التنموية نفسها (انظر مناقشة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأوراق من على سطح الأرض ووضعها الستايروفوم طليس طبق بيتري على 3 طبقات من ورق الترشيح Whatman الرطب ، وختم طبق بيتري مع Parafilm ، واحتضان ذلك في درجة حرارة الغرفة ل36-48 ساعة للسماح للتعبير عن الجينات المحورة وتسليمها المحتملة الخلية الى خلية حركة المنتجات البروتين . </li></ol> 4) التصوير التعبير البروتين إشارة من البروتينات الفلورية أعرب عابر المفتاحية هي التي تصور المجهري متحد البؤر. وينبغي الحرص على إيجاد أفضل الإعدادات المجهري للكشف عن البروتين في كل اختبار. على سبيل المثال ، والبروتينات داخل الخلايا التي تظهر تراكم محدودة مع شدة إشارة ضعيفة ، مثل توطين plasmodesmal من البروتين فسيفساء التبغ حركة فيروس (TMV MP) 1-3،6 يراعى تحت عدسة الهدف 40X ، مما يتيح دقة أعلى و الحساسية ، في حين يمكن أن البروتينات التي تظهر توزيع هيولي مع شدة إشارة قوية ، مثل YFP الحرة ، يمكن تصور تحت عدسة الهدف 10X مع وظيفة التكبير والتصغير مبائر لسرعة التصوير (انظر الشكل 1). يستدل متحد الجبلة النقل من ظهور كتل multicell التي تحتوي على إشارة الفلورسنت. عدد الكتل وعدد من مثل هذه الخلايا في كل مجموعة مما يدل على مدى الخلية الى خلية النقل. للحصول على بيانات موثوق بها ، يجب أن تسجل مجموعات التعبير لا يقل عن 100 في كل نظام التجريبية. على سبيل المثال ، يجب أن تسجل إذا قورن حركة الخلية الى خلية من البروتين في الخلفيات two الجينية المختلفة (على سبيل المثال ، اكتب البرية والنباتات المعدلة وراثيا) ، من مجموع كتل التعبير 200. الأهم ، والتجارب ، ينبغي القيام نتائج التي يمكن مقارنتها مع بعضها البعض ، في وقت واحد. 5. ممثل النتائج الشكل أدناه يوضح التجارب ممثل للكشف عن النقل متحد الجبلة من البروتينات الموسومة fluorescently. لوحات ألف وباء عرض الصور النمطية التي يتم الحصول عليها مبائر microbombardment التالية من N. benthamiana نبات مع TMV MP - YFP - معربا عن بناء. في لوحة ويلاحظ وجود الحركة ، ومتحد الجبلة من YFP النائب TMV استنادا إلى ظهور كتل multicell الإشارة YFP. ليس كل TMV أعرب عابر MP - YFP غير قادرة على التحرك كما يدل على ذلك إشارة وحيدة الخلية في بعض microbombardments (لوحة باء). إحصائيا ، في &lt;40 ٪ من التجمعات اشارة عدها ، TMV MP - YFP غير قادر على التنقل بين الخلايا في حين أنه في&gt; 60 ٪ للمجموعات ، وينتقل البروتين بين 2-5 خلايا ، مع انتشار الخلايا اثنين كونها الأكثر شيوعا (حوالي 50 ٪ من الحالات ~) (الشكل 1C). يمكن للبروتينات مع حجم الجزيئات الصغيرة نسبيا دون حركة النشاط الفطري المنتشر من خلال التطوير المهني للانتقال من خلية إلى خلية. على سبيل المثال ، YFP مجانا أو 1xYFP (حوالي 27 كيلو دالتون ، لوحة D) ، وينتشر بين عدة خلايا في 30 ٪ من المجموعات تحسب (لوحات C). هذا الانتشار غير محددة لا يحدث عن باهتة YFP متعدية ، أو 2xYFP (54 كيلو دالتون ، E لوحة) ، والذي يماثل في الحجم لبروتين TMV الانصهار MP - YFP (57 كيلو دالتون) ، والذي هو حكم ذاتي كامل الخلية (الشكل 1C). <img src="/files/ftp_upload/2208/2208fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها من مقايسة النقل متحد الجبلة في N. benthamiana أنسجة نبات. (A ، B) من التصور TMV MP - YFP. (C) الكميات من كتل الإشارة. و1xYFP 2xYFP ، حرر YFP ومتعدية YFP ديمر ، على التوالي. (د) من 1xYFP التصور. (E) من 2xYFP التصور. في micrographs ، لوحات اليسار تظهر إشارة YFP والحق لوحات تظهر الصور المدمجة من YFP (باللون الأخضر) ، وتألق ذاتي بلاستيدات الخضراء (بيضاء) الاشارات. الصور هي أقسام مبائر واحد. النجمية في micrographs تظهر خلايا البشرة تظهر YFP الإشارة. قضبان = 50 ميكرومتر.

<ol>
	<li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+non-destructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses.+.">The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. .</a> Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).</li><li>Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+viral+movement+proteins:+agents+for+cell-to-cell+trafficking+of+viral+genomes.">Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes.</a> Virology. 344, 169-184 (2006).</li><li>Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+viruses+spread+by+diffusion+on+ER-associated+movement-protein-rafts+through+plasmodesmata+gated+by+viral+induced+host+beta-1,3-glucanases.">Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases.</a> Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).</li><li>Zambryski, P. C., Crawford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodesmata:+gatekeepers+for+cell-to-cell+transport+of+developmental+signals+in+plants.">Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).</li><li>Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+plants+and+presercation+of+seeds.">Growth of plants and presercation of seeds.</a> Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).</li><li>Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+transient+genetic+transformation+of+Arabidopsis+leaves+by+biolistic+bombardment.">Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment.</a> Nat Protoc. 4, 71-77 (2009).</li><li>Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+but+not+branched,+plasmodesmata+allow+the+nonspecific+trafficking+of+proteins+in+developing+tobacco+leaves.">Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves.</a> Cell. 97, 743-754 (1999).</li><li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues.">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11, 309-322 (1999).</li><li>Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+regulation+of+symplastic+trafficking+during+development+in+Arabidopsis+thaliana+apices.">Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices.</a> Development. 126, 1879-1889 (1999).</li><li>Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+movement+of+GFP+during+embryogenesis+and+early+seedling+development+in+Arabidopsis.">Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).</li><li>Crawford, K. M., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-targeted+and+targeted+protein+movement+through+plasmodesmata+in+leaves+in+different+developmental+and+physiological+states.">Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states.</a> Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).</li><li>Roberts, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phloem+unloading+in+sink+leaves+of+Nicotiana+benthamiana:+comparison+of+a+fluorescent+solute+with+a+fluorescent+virus.">Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus.</a> Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).</li><li>Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+mosaic+virus+(TMV)+replicase+and+movement+protein+function+synergistically+in+facilitating+TMV+spread+by+lateral+diffusion+in+the+plasmodesmal+desmotubule+of+Nicotiana+benthamiana.">Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المفتاح لنجاح تجربة النقل متحد الجبلة هو الحصول على كفاءة عالية التحول ، الذي يسمح للإنتاج مجموعات إشارة ذات دلالة إحصائية واكتشافها بسهولة. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام أوراق تحصد من النباتات وصحية قوية ، وإعداد جزيئات الذهب المطلي بواسطة الحمض النووي إعداد نقية ومرك?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Gold microparticles, 1.0 &mu;m in diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2262</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gold microparticles, 0.6 &mu;m in diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0266-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tefzel tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios cartridge preparatory station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing cutter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2422</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios gene gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2432</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helium gas regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2413</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a cell-to-cell macromolecular transport assay in planta utilizing biolistic bombardment

هنا ، نطرح على بروتوكول بسيط وسريع لكشف وتقييم مدى الخلية الى خلية النقل الجزيئات في بلانتا. في هذا البروتوكول ، وأعرب عن عابر a fluorescently الموسومة البروتين من الاهتمام في الأنسجة النباتية بعد الولادة biolistic من الحمض النووي لبناء الترميز. ثم يتم تحليل التوزيع داخل وبين الخلايا من البروتين الموسومة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. وصفنا هذه التكنولوجيا بالتفصيل ، وتوفير خطوة بخطوة لبروتوكولات الفحص وتقييم مدى النقل بروتين متحد الجبلة في الأنواع النباتية ثلاثة thaliana Arabidopsis ، ونيكوتيانا benthamiana N. تبغ (التبغ).

Watch this Scientific Journal Video about A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment at JoVE.com

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

ويمكن تقييم الاتجار الجزيئات بين الخلايا النباتية بالإعراب عابر بروتين fluorescently الموسومة المصالح وتحليل توزيعه داخل وبين الخلايا بواسطة المجهر مبائر.

خلية الى خلية ضخم الجزيئات النقل الفحص في بلانتا الاستفادة من قصف Biolistic

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

a-cell-to-cell-macromolecular-transport-assay-planta-utilizing

Research

JoVE Journal

Biology

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

11.8K Views.  State University of New York at Stony Brook. ويمكن تقييم الاتجار الجزيئات بين الخلايا النباتية بالإعراب عابر بروتين fluorescently الموسومة المصالح وتحليل توزيعه داخل وبين الخلايا بواسطة المجهر مبائر.

Video: A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

الحصاد والبرد تبريد بلورات من بروتينات الغشاء يزرع في Mesophases شحمي لتحديد هيكل للعلم البلورات ضخم الجزيئات

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

في تحليل المختبر من PDZ التي تعتمد على المجمعات ضخم الجزيئات CFTR اشارة

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

زراعة<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em &gt; في ممحوضة السائل وسائل الإعلام وإنشاء المعدلة وراثيا الديدان عن طريق قصف Microparticle

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

المصدر المفتوح تحليل عالية المحتوى الاستفادة الآلي الإسفار مدى الحياة التصوير المجهري

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX beamlines having been built and increased availability of structure refinement software. However, the neutron sources currently available for NMX are significantly weaker than equivalent sources for X-ray crystallography. Despite advances in this field, significantly larger crystals will always be required for neutron diffraction studies, particularly with the tendency to study ever-larger macromolecules and complexes. Further improvements in methods and instrumentation suited to growing larger crystals are therefore necessary for the use of NMX to expand.
In this work, we introduce rational strategies and a crystal growth bench (OptiCrys) developed in our laboratory that combines real-time observation through a microscope-mounted video camera with precise automated control of crystallization solutions (e.g., precipitant concentration, pH, additive, temperature). We then demonstrate how this control of temperature and chemical composition facilitates the search for optimal crystallization conditions using model soluble proteins. Thorough knowledge of the crystallization phase diagram is crucial for selecting the starting position and the kinetic path for any crystallization experiment. We show how a rational approach can control the size and number of crystals generated based on knowledge of multidimensional phase diagrams.

Structural studies of biomacromolecules by crystallography require high-quality crystals. Here we demonstrate a protocol that can be used by OptiCrys (a fully automated instrument developed in our lab) and/or microdialysis buttons for growing large high-quality crystals based on knowledge of the crystallization phase diagram.

تحسين النمو البلوري للبلورات النيوترونية الجزيئية

The use of neutron macromolecular crystallography (NMX) is expanding rapidly with most structures determined in the last decade thanks to new NMX ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

التصوير الحي المتزامن للأجنة الحشرية المتعددة في مجاهر فلورسينس ورقة الضوء المستندة إلى غرفة العينة

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

التحقيق في آلية نقل الزنك في خلايا الثدييات باستخدام مقايسة FluoZin-3

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف تنظيم الزنك الخلوي من خلال وظائف ZnT1 

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

توصيف ناقلات الزنك في الثدييات باستخدام مقايسة نقل الزنك في المختبر

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...