This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.

1. إعداد الكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عازلة تجميع (20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4، 100 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA). تخزين في RT ومستقرة لعدة أشهر. الملحق 1 ملي dithiothreitol (DTT) قبل الاستخدام. ملاحظة: منطقة عازلة على أساس HEPES (10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.5، 0.1 ملي EDTA، 5 ملي DTT) كما تنتج نتائج مماثلة في تاو التجميع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد thioflavin T أو thioflavin S حل الأوراق المالية (3 ملم، وحلت في المخزن التجميع)، وتصنف 0.22 ميكرون وحدة تصفية العقيمة. تخزينها في -20 درجة مئوية في أنبوب من رقائق الألومنيوم غطت ومستقرة لعدة أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون الهيبارين (300 ميكرومتر، وحلت في المخزن التجميع). تخزينها في -20 ° C ومستقر لعدة أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد dithiothreitol (DTT) الأسهم (1 M، يذوب في الماء). قسامة إلى 1.5 مل أنابيب. تخزين في -20 ° C. قبل المقايسات التجميع، وذوبان الجليد الحل 1 M في RT. من هذا المخزون 1،000x، وإعداد قسامة من 100 ملي الأسهم العمل مع الماء منزوع الأيونات. ترك على الجليدحتى جاهزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تاو من -80 ° C الفريزر. ذوبان الجليد على الجليد. ضبط تاو لتركيز محددة سلفا مع المخزن المؤقت التجميع. تدور في microcentrifuge في 20،800 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة الركام كبيرة شكلت مسبقا. هذه الخطوة ما قبل الغزل يزيد الاتساق في قياس مضان لاحق من كل دفعة من الإعدادية البروتين. نقل طاف لأنبوب آخر؛ ترك على الجليد حتى جاهزة لتجميع رد فعل التجميع. </li></ol> 2. لا صبغ، الفحص الطرفية ويتم تجميع رد فعل من هذا الاختبار في حالة عدم وجود صبغة الفلورسنت: ملاحظة. بعد خلط جميع المكونات، ولا يسمح للرد فعل للشروع في نقاط زمنية محددة مسبقا. ثم يتم أخذ مأخوذة من رد فعل تجميع ومختلطة مع تى اتش تى أو تي إتش إس للاميلويد ملزم قبل القراءة مضان. حجم الأولي من رد فعل تجميع يعتمد على عدد من النقاط الوقت اللازم. هذا النهج قد REQUغضب على كمية كبيرة من البروتين تاو، ولكن بشكل سريع، واضحة، ويمكن القيام به في التألق أو قارئ لوحة متعددة جيدا (انظر مناقشة). هو عملية خطوة بخطوة أدناه، وذلك باستخدام الطيفي المدمجة ISA سبكس FluoroMax-2 لمضان الكمي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خليط تجميع في 1.5 مل أنابيب إيبندورف كما في الجدول 1. ويمثل كل عمود المكونات اللازمة للتفاعل 100 ميكرولتر، وهو ما يكفي لأحد قياس الوقت نقطة. ضبط كمية من أجل مزيج تجميع كامل على أساس النقاط الوقت اللازم للتجربة معينة. إضافة إضافية بنسبة 10٪ لكل مكون لإعطاء مجال للخطأ pipetting ل. رد فعل تحتوي على الهيبارين نموذجي هو موضح هنا يمكن الاستعاضة عن حمض الأراكيدونيك أو عازلة التجميع. إضافة إلى DTT 1 ملم إلى خليط التفاعل. إذا يستمر رد الفعل كله أكثر من يوم واحد، تكملة جديدة DTT كل يوم (1 ملم) لضمان بيئة الحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس الأنبوب بضع مرات لخلط. جيش التحرير الشعبى الصينىCE كل رد فعل في الحاضنة 37 درجة مئوية أو ماء الحمام. ليست هناك حاجة للالتحريض تاو التجميع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل قياس مضان، بدوره على الطيفي (مصباح أولا، ثم الكمبيوتر). ملاحظة: مصباح قوس زينون التي يمكن استخدامها على الفور. ومع ذلك، لأفضل النتائج تسمح للآلة في عملية الاحماء لمدة 10 دقيقة قبل قراءة مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل البرنامج على جهاز الكمبيوتر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الوقت الحقيقي عرض الوضع في مركز التحكم صك، تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 450 نانومتر (الشق إلى 2 نانومتر) والطول الموجي الانبعاثات إلى 510 نانومتر (شق إلى 5 نانومتر). وثيق في الوقت الحقيقي نافذة عرض الوضع للعودة إلى مركز التحكم الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر تحليل الطول الموجي، اضغط إضافة &gt;&gt; مفتاح المستمر في الإطار العلوي لإضافة موجات مجموعات. تعيين المعلمات الاستحواذ على خطأ قياسي ل1 والمحاكمات القصوى إلى 3، ثم انقر فوق إضافة. انقر فوق انتقال! لفتح بيانات العرضالنافذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نافذة العرض بيانات، انقر فوق ابدأ ACQ لفتح مربع الحوار نموذج جديد. اختيار &quot;غير معروف&quot; لنوع العينة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى كل 100 ميكرولتر خليط التجميع، إضافة 98 ميكرولتر عازلة تجميع و 2 ميكرولتر 3 ملي thioflavin T. الماصة عدة مرات لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخليط بأكمله إلى كوفيت (FCA3، والبعد الخارجي، wxlxh = 12.5 مم × 12.5 مم × 45 مم). ضع كفيت في حامل العينة في عينة مقصورة وإغلاق الغطاء. انقر فوق تشغيل لجمع البيانات مضان. تسجيل البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كفيت وصب الحل. شطف كفيت بواسطة الماء المقطر 3 مرات. الجافة التي تهب الهواء داخل وخارج كفيت. </li></ol> 3. مع صبغ، المستمر الوضع الفحص على لوحة قارئ SpectraMax M2 ملاحظة: هذا الاختبار يختلف عن سابقتها في أن يتم تضمين صبغة الفلورسنت أو تي إتش إس تى اتش تى في aggregaرد فعل نشوئها. وهذا يسمح القياس المستمر من نفس مجموعة من ردود الفعل. بسبب استخدام المتكرر من رد الفعل، هو أفضل فعلت هذه الطريقة مع التلقائي متعددة جيدا قارئ لوحة (كما هو موضح أدناه تشغيل SpectraMax M2). يعمل والتألق العادية أيضا ولكن وتيرة قياس ردود الفعل تجميع سريع محدودة نوعا ما، نظرا لطبيعة اليدوي للعملية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج التجميع في لوحة 96-جيدا (96 جيدا لوحة سوداء صلبة، جيدا حجم 360 ميكرولتر، مسطحة القاع) كما في الجدول (2). ويمثل كل عمود المكونات اللازمة للتفاعل 200 ميكرولتر، وهو ما يكفي لواحد قياس الوقت نقطة. مزيج جيد من قبل pipetting عدة مرات. تكملة جديدة 1MM DTT كل يوم طوال فترة التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة 96-جيدا عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كل نقطة زمنية قبل قياس مضان، بدوره على وضع متعددة قارئ صفيحة ميكروسكوبية والكمبيوتر. إتاحة الوقت الكافي للأماهعمود فقري لتحقيق الاستقرار، حوالي 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل البرنامج على جهاز الكمبيوتر. ضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، واختيار شدة الإسفار (الأعلى FI مقروءة) واسطة، تعيين الطول الموجي الإثارة في 450 نانومتر، والانبعاثات الطول الموجي في 510 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج لوحة 96-جيدا في درج واضغط على مفتاح READ لبدء القياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد القراءة، وإزالة لوحة والعودة مرة أخرى إلى C حاضنة 37 درجة. نسخ البيانات ولصقها في جدول بيانات Excel لتحليل البيانات والتآمر. </li></ol> 4. مع صبغ، المستمر الوضع الفحص الطيفي على الاتفاق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خليط تجميع في 1.5 مل أنابيب إيبندورف كما في الجدول 3. ويمثل كل عمود المكونات اللازمة للتفاعل 200 ميكرولتر، وهو ما يكفي لأحد قياس الوقت نقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس الأنبوب بضع مرات لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الطيفي ووضع البرنامج كما في الخطوات 2.3 و 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخليط بأكمله رالزراعة العضوية كفيت. ضع كفيت في حامل العينة في عينة مقصورة وإغلاق الغطاء. انقر فوق تشغيل لجمع البيانات مضان. تسجيل البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة القراءة على فترات مناسبة من خلال النقر تشغيل وتسجيل البيانات. إذا كان التجميع هو أن يتم رصدها في ذات تردد عال (على سبيل المثال، كل 30 أو 60 ثانية)، وترك رد الفعل في كفيت وفي الجهاز حتى إما الانتهاء من القياس، أو عندما يكون هناك وقت كاف لمبادلة ردود الفعل أو cuvettes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كفيت وصب الحل. شطف كفيت بواسطة الماء المقطر 3 مرات. الجافة التي تهب الهواء داخل وخارج كفيت. </li></ol>

We have nothing to disclose.

هذا البروتوكول يوضح شروط الفحص المختلفة والأدوات التي كشف تاو سريع حركية التجميع التي تعتمد على الفسفرة. في مقايسة المحطة، يتم إضافة الصبغة مضان تى اتش تى لجزء من رد فعل إزالتها من مزيج الرئيسي في كل نقطة زمنية. اميلويد يسببها ملزم ثم يقاس مضان 26. في المجموعة ال?...

مرض الزهايمر (AD) هو واحد من مجموعة كبيرة من الاضطرابات العصبية المعروفة باسم tauopathies. في الجوهر tauopathy علم الأمراض الكامنة هو التشابك الليفي العصبي، NFTS، في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة 1-4. كثافة NFT يرتبط مع ضعف الادراك 3،5 والخلايا العصبية وفقدان 6. NFT يحتوي على بروتين تاو hyperphosphorylated في المقام الأول (المشار إليها باسم &quot;P-تاو&quot; من الآن فصاعدا) التي تشكل خيوط مستقيمة أو حلزونية تقرن (PHF) 7،8. تاو هو بروتين يرتبط أنيبيب يعتقد لتسهيل النقل المحاور التي لا غنى عنها للإشارات العصبية والاتجار 9،10. كل جزيء تاو يحتوي على 2 إلى 3 الفوسفات في الدماغ العادي، ولكن زيادة المحتوى فسفوريل عدة طيات في المرضى الذين tauopathy 11. من المحتمل أن تساهم في تاو hyperphosphorylation بما في ذلك GSK3β (الجليكوجين سينسيز كيناز 3β) وCDK5 (السيكلين دي تحركات متعددةكيناز معلقة 5) 12،13، ولكن على الزناد المباشر للالفسفرة المرضية لا يزال بعيد المنال 14. الفسفرة غير طبيعية في أو بالقرب من الزخارف ملزم أنيبيب تنأى تاو من أنيبيب 15، ويسبب تاو سوء الترجمة إلى المقصورة somatodendritic، حيث oligomerizes ف تاو إلى خيوط مستقيمة أو حلزونية تقرن التي يمكن أن تتبلمر في نهاية المطاف إلى الادراج NFT. أدى التعادل وثيق بين hyperphosphorylation تاو، وتشكيل NFT، والتنكس العصبي إلى فرضية السائدة التي التشابك ف تاو الحصول على ردود السامة للخلايا أفكارك وغيرها، وبالتالي هي السبب الكامن وراء tauopathy تنكس عصبي 16،17. تم إطلاق شاشات المخدرات والاختبارات السريرية في وقت مبكر على أساس هذا الافتراض 18. ومع ذلك، تواجه هذه الفرضية التحديات 19،20. على سبيل المثال، سانتا كروز وآخرون أظهرت أن الوظائف المعرفية من الفئران المعدلة وراثيا يمكن أن تتحسن عن طريق قمع التعبير عن المسختاو البشري، على الرغم من استمرار NFTS لتشكيل جزيئات من تاو القائمة 21. في نموذج ذبابة الفاكهة، فقد تبين NFT لعزل وعصاري خلوي تاو السامة لحماية الخلايا العصبية الكامنة 22،23. ومن الواضح أن دور التسبب في NFT، إن وجدت، سوف تؤثر بشكل كبير على اتجاه التنمية العلاجات tauopathy. في تركيزات عالية، المؤتلف أو العادي بروتين تاو الدماغ بشكل عفوي ولكن ببطء يبلمر إلى بنية تشبه PHF في المختبر، كما يتبين من ربط عدة ورقة β فضل الأصباغ الفلورية، المجهر الإلكتروني، وتشتت الضوء الطيفي 24-27. مضيفا الهيبارين أو حمض الأراكيدونيك، وهو من الأحماض الدهنية وفرة في دماغ الإنسان، ويسرع بشكل كبير في تشكيل PHF isoform- تاو ومحفز تعتمد على التركيز الخلق 28-32. يثير الاهتمام والفضول، تنقية تاو hyperphosphorylated من أدمغة AD أو عن طريق شاملة أعدت في تفاعلات الفسفرة المختبر لggregates أسرع وأكثر كفاءة 26،33-35. هذه النتائج هي في الاتفاق ممتازة مع الأدوار المرضية للف تاو. وبالتالي يجوز للنظام في المختبر على أساس تجميع ف تاو بمثابة أداة قوية لفحص AD المخدرات. ونظرا لارتباط وثيق بين تجميع تاو والتنكس العصبي التدريجي للم، وكذلك فشل الأخير في تطوير العقاقير التي تستهدف وحة Aβ، علامة أخرى النسيجية الرئيسية 36-38 م، والفائدة في اكتشاف العقاقير التي تتحكم تاو تجميع آخذ في الارتفاع. في الواقع، العديد من الجماعات قد بدأت بالفعل شاشات المخدرات في الإنتاجية المختلفة، وذلك باستخدام المختبر في ردود الفعل تاو التجميع كما الفحص الابتدائي. تم العثور على عدد من المواد الكيميائية لعرض الأنشطة المثبطة أو انعكاس على تاو التجميع في المختبر 39-42. ومع ذلك، كل الشاشات الحالية منظم تاو تاو تجميع تستخدم معدلة أن يفتقد العلامة المرضية الرئيسية من الفوسفورylation، ورفع مصدر قلق لخصوصية وفعالية استخدام هذه المركبات في علاج م. واحدة من العقبات الرئيسية لتطوير المقايسات تجميع لتوصيف والكيمياء الحيوية وفحص AD المخدرات هو إنتاج كميات كافية من البروتين تاو hyperphosphorylated ذات الصلة pathophysiologically. باستخدام نظام الحفز سحابات بمساعدة الذي شكل الإسوي 1N4R من تاو وكيناز GSK-3β وشارك أعرب في E. القولونية كما يسين سستة البروتينات الانصهار، وتغلبنا على هذا التحدي (. سوي وآخرون، المقدمة؛ انظر الشكل 1 للمنتجات النهائية تاو وف تاو، انظر أيضا 43 لأولي الشامل توصيف الطيف من ص-تاو). من لجنة من تسعة أجسام مضادة محددة لمواقع الفسفرة مختلفة من تاو، وشوهدت إشارات إيجابية في ثمانية مواقع (لا تظهر البيانات). أدناه، وصفنا البروتوكولات وأدوات القياس التي يمكن أن تفرق تجميع د الحركيifferences بين تاو معدلة والأنواع ف تاو. تم تعديل هذه المقايسات من البروتوكولات نشرت أن تقاس زيادة مضان من thioflavin T (تى اتش تى) أو thioflavin S (تي إتش إس) عند اميلويد (المجاميع تاو) ملزمة 26. في أول &quot;محطة&quot;، نهج لا صبغ، يتم تجميع ردود الفعل تجميع وحضنت في غياب الصبغة اميلويد. في نقاط زمنية مختلفة، تتم إزالة قسامة من كل رد فعل ومختلطة مع حجم مساو من المخزن المؤقت تى اتش تى التي تحتوي على وقف التجميع والسماح تى اتش تى لربط المجاميع تاو. ويقاس مضان من قبل IAP FluoroMax-2 التألق. في المجموعة الثانية &quot;مع صبغ&quot; مراقبة الفحص المستمر، يتم تضمين تى اتش تى أو تي إتش إس في ردود الفعل التجميع. ويمكن قياس مضان باستمرار طوال التجربة بأكملها يدويا أو باستخدام قارئ لوحة متعددة. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف مقايسة يستخدم تركيز شبه الفسيولوجية من تاو وف تاو للتجميع في مو قياس مستمردي. تأثير الفسفرة يبقى كشفها بسهولة. أدناه، فإننا سوف تصف الإجراءات العملية خطوة بخطوة، وتظهر نتائج ممثلة من هذه المقايسات. سوف مناقشة بعض من إيجابيات وسلبيات كل نهج، فضلا عن التطبيقات المحتملة متابعة فحص المخدرات. بتركيز عال، تاو المجاميع في هياكل تشبه اميلويد من تلقاء أنفسهم. ومع ذلك، في المختبر، وعادة ما تسارع تاو fibrillization من هذه المحرضات كما الهيبارين (متوسط ​​الوزن الجزيئي، 6،000 جم / مول) وحمض الأراكيدونيك. الأمثلة الموضحة في هذه الوثيقة تتضمن 30 ميكرومتر الهيبارين. ويتم رصد تشكيل تاو المجاميع اميلويد من قبل مضان الناتجة عن اميلويد ملزمة thioflavin T (تى اتش تى) أو thioflavin S (تي إتش إس). على ملزم لالمجاميع تاو، تى اتش تى يسلك التحول الأحمر في مضان (الإثارة: 450 نانومتر؛ الانبعاثات ذروتها: 485 نانومتر). تي إتش إس، من ناحية أخرى، لديها ضعف الانبعاثات في 510 نانومتر (الإثارة في 450 نانومتر) قبل اميلويد ملزمة، ولكن هذا fluorescencزيادات الإلكترونية بشكل كبير في وجود بروتين اميلويد مثل تاو مجمعة 44. كلا الأصباغ تعمل بشكل جيد في الكشف عن تاو وف تاو التجميع. بسبب ذروة الانبعاثات قوية واسعة نسبيا من تى اتش تى (انظر الشكل 2)، وهناك فقط 30٪ تخفيض في وحدة مضان في 510 نانومتر. للراحة، ونحن نستخدم نفس مزيج من موجات الإثارة / الانبعاثات (أي 450 نانومتر / 510 نانومتر) لمراقبة تاو تجميع عند استخدام إما صبغ. ويمكن أن يتم تجميع تاو في وجود أو عدم وجود الصبغة، وهذا يتوقف على الغرض من الفحص وتوافر البروتين تاو. وتظهر كل من وسائط من ردود الفعل أدناه. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن لشرح تشغيل اثنين من الأدوات المختلفة - مقياس التألق عينة واحدة (ISA-سبكس FluoroMax-2) وقارئ متعدد لوحة (SpectraMax M2). وينبغي أن تكون قادرة على التكيف مع هذه البروتوكولات لتناسب احتياجاتهم الخاصة وتوفر أداة القراء.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="449">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:103px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Trizma&#160;base</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1503</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">MAL-7581-06</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">15576-028</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T3516</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin S</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1892</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:116px;">heparin</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">H3393</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">D9779</td>
			<td style="width:103px;">Stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">96-well plate</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:103px;">3917</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">ISA SPEX FluoroMax-2</td>
			<td style="width:128px;">Horiba</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:116px;">SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader</td>
			<td style="width:128px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:128px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:103px;">MAB3494</td>
			<td style="width:103px;">Stored at &#8211;80&#176;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

باستخدام تاو المؤتلف وف تاو (الشكل 1)، أنشأنا اثنين من بروتوكولات مختلفة للمقارنة بين حركية تجميع تاو وف تاو، والاستفادة من انبعاث مضان قوي من تى اتش تى وتي إتش إس عليه وملزم لamyloidal المجاميع البروتين، بما في ذلك تاو وف تاو (الشكل 2). مع أو بدون صبغة الف?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein at JoVE.com

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

واستخدمت البروتينات تاو معدلة وhyperphosphorylated في اثنين من فحوصات في المختبر تجميع للكشف عن حركية تجميع سريع تعتمد على hyperphosphorylation. هذه المقايسات تمهد الطريق لشاشات المستقبلية للمركبات التي يمكن أن تعدل بميل تاو hyperphosphorylated لتشكيل الألياف التي تكمن وراء تطور مرض الزهايمر.

في المختبر تجميع فحوصات عن طريق Hyperphosphorylated تاو البروتين

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

in-vitro-aggregation-assays-using-hyperphosphorylated-tau-protein

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

18.2K Views.  Michigan State University.  واستخدمت البروتينات تاو معدلة وhyperphosphorylated في اثنين من فحوصات في المختبر تجميع للكشف عن حركية تجميع سريع تعتمد على hyperphosphorylation. هذه المقايسات تمهد الطريق لشاشات المستقبلية للمركبات التي يمكن أن تعدل بميل تاو hyperphosphorylated لتشكيل الألياف ?...

Video: In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

التصاق وتكدس الصفيحات تحت التدفق باستخدام خلايا تدفق ميكروفلويديك

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

في المختبر الهجرة الخليوي والغزو فحوصات

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

في المختبر مثلأيشن الفحص لدراسة البروتين أرجينين مثلأيشن

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...