The authors thank Mike Myles, Sam Saunders, and C.W. Elton at the ECU Multimedia &amp; Technology Services for providing assistance in video production. We acknowledge the grant support from North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association, and ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. and M.J.R.).

1. إغلاق الفحص مدينة الثقافة الجرح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا من نسيج لوحة الثقافة باستخدام 0.25٪ التربسين-EDTA حل. بيليه الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية بواسطة الطرد المركزي، ونضح طاف، واعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام والثقافة. لوحة العدد المناسب من الخلايا في لوحة 6 جيدا للالتقاء 100٪ في غضون 24 ساعة. ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى اختبارات لتحديد الوقت وعدد من الخلايا لتحقيق 100٪ التقاء بسبب نوع من الخلايا وحجم البئر وتستخدم (على سبيل المثال، هي المصنفة 1 × 10 6 خلايا سرطان الجلد B16F10 في بئر ل لوحة 6 جيدا قبل 24 ساعة من الجيل الجرح). بدلا من ذلك، يمكن استخدام 12 أو 24 جيدا جيدا لوحات. ملاحظة: إذا كان متوفرا، يمكن خلايا المصنف إلى إدراج الثقافة (من ibidi LLC) على التعامل مع الأنسجة لوحة الثقافة جعل الجرح قبل مسبوكة. A الثقافة إدراج يمكن حماية السطح من لوحة زراعة الأنسجة من التلف من قبل طرف ماصة. إذا تم استخدام الثقافة إدراج خطوة تجاهل1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في بيئة معقمة (عادة غطاء السلامة الأحيائية) استخدام غيض ماصة 200 ميكرولتر للضغط بحزم ضد الجزء العلوي من لوحة زراعة الأنسجة وجعل بسرعة جرح رأسي إلى أسفل من خلال أحادي الطبقة الخلية. A مختلفة غيض ماصة الحجم يمكن استخدامها لجعل حجم الجرح الذي هو المطلوب. لا تستخدم القوة المفرطة ضد لوحة زراعة الأنسجة مع طرف ماصة لأنه قد يتلف السطح. إذا كان الجرح محمل مسبقا، قد يتم حذف هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية وسائل الإعلام والحطام الخلية. إضافة ببطء بما فيه الكفاية سائل الإعلام والثقافة ضد الجدار جيدا لتغطية قاع البئر وتجنب فصل خلايا إضافية. بعد جيل والتفتيش على الجرح ينبغي أن تؤخذ صورة الأولي. وضع لوحة زراعة الأنسجة في حاضنة وضعت في درجة حرارة مناسبة وأول أكسيد الكربون 2 تركيز (عادة 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في عدة نقاط الوقت، مثل كل 3 ساعات، وإزالة لوحة من incubatأو وضعه تحت مجهر مقلوب لالتقاط صورة لقطة وللتحقق من إغلاق الجرح. إذا كان الوقت الفاصل بين المجهري هو متاح، التقاط صورة كل عدد X من دقيقة (تبدأ عادة مع كل 5 دقائق) لأي مدة زمنية في درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2 غرفة التحكم. اعتمادا على نوع من الخلايا، قد تختلف الجرح وقت الإغلاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل نتائج الصور لقطة، وقياس المسافة من جانب واحد من الجرح إلى أخرى باستخدام شريط مقياس. تحليل والحاضر بوضوح إغلاق الجرح مع مرور الوقت باستخدام مؤامرة مبعثر أو شريط الرسم البياني، مثل الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل الصور الوقت الفاصل بين، استيراد الصور في البرنامج يماغيج (متاحة بحرية في http://rsb.info.nih.gov/ij/) لجعل الفيديو. للقيام بذلك يماغيج مفتوحة، انقر فوق ملف، استيراد، وتسلسل الصور. العثور على الملف مع الصور؛ انقر على الصورة الأولى في الملف. حفظ الفيديو عن طريق تحديد ملف، حفظ، وافي. ويمكن ملاحظة الخلايا المهاجرة واحد لشاراcterize حركة الاتجاه. وعلاوة على ذلك، والخصائص المورفولوجية مثل تشكيل أقدام صفاحية وراء حافة التراجع قد تدرس كذلك (الشكل 2 والفيديو التكميلية). </li></ol> 2. Transwell الهجرة الخليوي والغزو الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في بيئة معقمة (عادة غطاء السلامة الأحيائية) فصل الخلايا من نسيج لوحة الثقافة باستخدام غير الأنزيمية العازلة تفارق الخلية أو 0.25٪ التربسين-EDTA حل، وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي، ونضح وسائل الإعلام القائمة وترك الخلايا مكعبات. اعادة تعليق الخلايا في مصل سائل الإعلام والثقافة الحرة الخلية تحتوي على 0.1٪ BSA (ألبومين المصل البقري). ملاحظة: اعتمادا على خط الخلية التي يجري التحقيق 0.25٪ التربسين EDTA-قد تؤثر الهجرة الخلية والغزو بسبب الانقسام من المستقبلات المختلفة على سطح الخلية 17. ملاحظة: عدد الخلايا لكل مل يعتمد على حجم الخلايا. قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الاختبارات للعثور على كثافة البذر التي محترفينفيديس على أفضل النتائج. عادة 1 × 10 6 خلية / مل هو نقطة انطلاق جيدة لمعظم أنواع الخلايا عند استخدام جيدا 24 transwell إدراج. هناك مجموعة واسعة من الأحجام transwell إدراج وينبغي تعديل عدد الخلايا المضافة لوفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 100 ميكرولتر من محلول الخلية على الجزء العلوي من الغشاء المرشح في إدراج transwell واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 للسماح للخلايا ليستقر. ملاحظة: حجم المسام معينة من الغشاء transwell المستخدمة تعتمد على حجم الفردية من الخلايا في العينة. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا صغيرة جدا فإنها قد تمر من خلال المسام دون الحاجة إلى تسهيل الهجرة أو إذا كانت كبيرة جدا فإنها قد لا تناسب من خلال المسام. وهناك العديد من إدراج transwell مع أحجام المسام التي تتراوح من 3 ميكرون، 5 ميكرون، و 8 ميكرومتر لفحوصات الهجرة الخلية. تتوفر تجاريا على إدراج transwell من شركات مثل كورنينج. ملاحظة: transwell مigration مقايسة يمكن تعديلها بسهولة لإجراء فحص غزو الخلية. للقيام بذلك، قم بإضافة المصفوفة خارج الخلية (ECM) مواد على رأس الغشاء transwell ثم قم بإضافة خلايا على رأس ECM. على سبيل المثال، يتم إذابة Matrigel ومسالة على الجليد، ومن ثم يتم إضافة 30-50 ميكرولتر من Matrigel إلى جيدا 24 transwell إدراج وعزز في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة لتشكيل طبقة رقيقة هلام. يضاف حل الخلية على رأس طلاء Matrigel لمحاكاة الغزو من خلال المصفوفة خارج الخلية. ملاحظة: هناك اختلافات واضحة بين الهجرة الخلية transwell والمقايسات غزو الخلايا transwell. يقيس الفحص الهجرة الخلية transwell القدرة الكيميائي للخلايا نحو الكيماوي جاذبة. مقايسة غزو الخلايا transwell، ومع ذلك، يقيس كلا الكيميائي خلية وغزو الخلايا من خلال المصفوفة خارج الخلية، وهي العملية التي توجد عادة في الانبثاث السرطان أو التطور الجنيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة، caref جدامع ully إضافة 600 ميكرولتر من المطلوب الكيماوي جاذبة في الجزء السفلي من مجلس النواب في 24 لوحة جيدا. إضافة الكيماوي جاذبة دون تحريك إدراج transwell وتجنب توليد فقاعات. تأكد من أن السائل الكيماوي جاذبة في البئر أسفل يجعل الاتصال مع الغشاء في البئر العليا لتشكيل التدرج الكيميائي. فترة حضانة تعتمد على نوع من الخلايا والكيماوي جاذبة المستخدمة. ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الاختبارات لتحديد فترة الحضانة. ملاحظة: للحصول على الخلايا الملتصقة، فإن الخلايا هاجر نعلق على الجانب الآخر من الغشاء 1،8. الكمي من الخلايا هاجر لا يمكن أن يؤديها التالية الخطوات 2،4-2،8 (الخطوات 2،4-2،8 لا تحتاج إلى أن يؤديها في بيئة معقمة). لخلايا غير ملتصقة، فإن الخلايا هاجر تسقط في وسائل الاعلام في مجلس النواب. يمكن الاعتماد على عدد من الخلايا باستخدام عدادة الكريات هاجروا أو تدفق عداد الكريات 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة إدراج transwell من لوحة. استخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس عدة مرات حسب الحاجة لإزالة بعناية وسائل الإعلام والخلايا المتبقية التي لم هاجروا من الجزء العلوي من الغشاء دون الإضرار بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600-1،000 ميكرولتر من الايثانول 70٪ في بئر من 24 لوحة جيدا. وضع إدراج transwell في الإيثانول 70٪ لمدة 10 دقيقة للسماح التثبيت الخلية. إزالة transwell إدراج من 24 لوحة جيدا واستخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس لإزالة الإيثانول المتبقية من الجزء العلوي من الغشاء. يسمح الغشاء transwell لتجف (عادة 10-15 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600-1،000 ميكرولتر من 0.2٪ الكريستال البنفسجي في بئر من 24 لوحة جيدا ووضع الغشاء في ذلك لتلطيخ. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إزالة البنفسجي الكريستال من أعلى الغشاء مع طرف ماصة أو القطن يميل قضيب. بعناية فائقة، لتجنب غسل قبالة خلايا ثابتة، وتراجع الغشاء إلى الماء المقطر عدة مرات حسب الحاجة لإزالة الزائدة الكريستال violeر. يسمح الغشاء transwell لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض تحت مجهر مقلوب وحساب عدد الخلايا في مختلف المجالات من أجل الحصول على متوسط ​​مجموع الخلايا التي هاجروا عبر الغشاء تجاه الكيماوي جاذبة وتعلق على الجانب السفلي من الغشاء (الشكل 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+tumor+cell+migration+and+metastasis+by+the+proton-sensing+GPR4+receptor.">Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor.</a> Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+cancer.">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).</li><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li><li>Peter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+to+apoptotic+&amp;#34;find-me&amp;#34;+signals+is+mediated+via+the+phagocyte+receptor+G2A.">Migration to apoptotic &amp;#34;find-me&amp;#34; signals is mediated via the phagocyte receptor G2A.</a> J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).</li><li>Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+through+the+G2A+receptor.">T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).</li><li>Buul, J. D., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+in+leukocyte+transendothelial+migration.">Signaling in leukocyte transendothelial migration.</a> Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).</li><li>Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+promoters+and+polyadenylation+regulate+tissue-specific+expression+of+Hemogen+isoforms+during+hematopoiesis+and+spermatogenesis.">Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis.</a> 228 (4), 606-616 (2003).</li><li>Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi-independent+macrophage+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+via+the+immunoregulatory+GPCR+G2A.">Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A.</a> Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).</li><li>Yoshida, M., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+chemotaxis+and+regulation+of+flagellar+movement+by+Ca2+.">Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+.</a> Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).</li><li>Albini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+endothelial+cell+invasion+of+basement+membranes.+The+matrigel+chemoinvasion+assay+as+a+tool+for+dissecting+molecular+mechanisms.">Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms.</a> Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+determinants+of+metastasis.">Critical determinants of metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+mechanistic+insights+and+clinical+challenges.">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).</li><li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+cancer.">Chemotaxis in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+3D+morphology+and+functions+on+genetically+engineered+mouse+melanoma+cells.">Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells.</a> Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).</li><li>Junger, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+regulation+of+neutrophil+chemotaxis.">Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).</li><li>Lazennec, G., Richmond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+new+insights+into+cancer-related+inflammation.">Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation.</a> Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17, (2010).</li><li>Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-mediated+proteolysis+of+paxillin+negatively+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration.">Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration.</a> J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).</li><li>Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+microtubules+and+focal+adhesion+dynamics+during+cell+migration.">Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

الهجرة الخلية هو أحد الجوانب الهامة للدراسة في أبحاث السرطان، ويمكن أيضا أن تطبق على النمو، والجرح الدراسات المناعية الشفاء. ثقافة الخلية الجرح إغلاق الفحص والكشف عن الهجرة الخلية transwell والغزو المقايسات معلومات مفصلة من السلوكيات الخلايا المهاجرة، ويمكن استخدامها...

حركية هو سمة أساسية من سمات الخلايا الحية. وتشارك الهجرة خلية في مفهوم الحياة، والتطور الجنيني، الاستجابة المناعية، والعديد من العمليات المرضية مثل السرطان والتهاب ثانوي لورم خبيث 1-9. وبالتالي، وأساليب لدراسة الخلية السلوك المهاجرة هي أدوات البحث مفيد جدا لمجموعة واسعة من التخصصات في العلوم الطبية الحيوية، وعلم الأحياء، والهندسة الحيوية، والمجالات ذات الصلة. دراسة الهجرة الخلية في أبحاث السرطان هو من مصلحة خاصة فيما يرتبط السبب الرئيسي للوفاة في مرضى السرطان لتطور النقيلي. من أجل السرطانية تنتشر وتنشر في جميع أنحاء الجسم، يجب أن تهاجر الخلايا السرطانية وغزو من خلال المصفوفة خارج الخلية (ECM)، intravasate في الدورة الدموية، ونعلق على موقع بعيد، وأخيرا يتسرب إلى تشكيل بؤر بعيدة 1،10-12. لذا يمكن استخدام الأساليب البيولوجية المختلفة لدراسة هذه الأحداث بالتفصيل. ثقافة الخلية جرح إغلاق لوتستخدم على نطاق واسع د هجرة transwell والمقايسات الغزو في الأوساط العلمية 1،10. هذه الاختبارات يمكن أن توفر البيانات اللازمة التي قد تسمح لفهم مدى نوع خلية معينة يمكن ترحيل من تلقاء أنفسهم أو الرد على الكيماوي جاذبة وتهاجر إتجاهي نحو ذلك. وقد وصفت العديد من الظواهر المهاجرة. قد تهاجر الخلايا في شكل خلية واحدة من هذا القبيل كما رأينا في الوسيطة أو حركة تشبه حركة أميبية أو متعددة الخلايا وصفت الهجرة الجماعية أو خلية تدفق 13. طريقة الحركة المستخدمة في خلايا متحركة يمكن ملاحظتها بسهولة باستخدام زراعة الخلايا إغلاق الجرح الفحص. من بين العديد من الطرق لدراسة الهجرة الخلية، الجرح خلية إغلاق الفحص هو واحد من أبسط. وهذه الطريقة مفيدة لتحديد القدرة هجرة الجماهير خلية كاملة. عندما اتخذت خطوة أخرى يمكن استخدامها لمراقبة الخصائص المورفولوجية خلية الفرد أثناء الترحيل 14. بعد تحليل إغلاق الجرح قد كشفت العديد من الظواهر. قياس المسافة المغلقة مع مرور الوقت عند مقارنة إلى عنصر تحكم قد تكشف عن تغييرات محددة الهجرة أو النمط الظاهري المهاجرة ضعاف التي لم تكن معروفة سابقا. علاوة على ذلك، تشكيل واحد قدم صفاحية خلية، وذيل سحب، وحركة الاتجاه قد تعطي مؤشرات لما قد تنخفض قيمتها أو محسنة في خلايا الفائدة 14. هجرة transwell والمقايسات الغزو يمكن أن تستخدم لتحليل قدرة الخلايا واحد للرد إتجاهي لمختلف الكيماوي جاذبة سواء كانوا كيموكينات، عوامل النمو، والدهون، أو النيوكليوتيدات 4،5،8،15،16. كما أنه قد تقييم قدرة المهاجرة الفرق بسبب الإفراط في التعبير عن مستقبلات 1،14. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه المقايسات لتحديد وتوصيف المنظمين الرئيسيين للهجرة الخلية مثل الأسرة رو من GTPases الصغيرة 2. بعد هذه قصيرة وبسهولة القويمكن أيضا تحديد اختبارات إيصال خدمات الإيداع، ووضع الهجرة الخلية، وقدرة الخلية لغزو في مصفوفة 3-D.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">11995-073</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:133px;">Gemini</td>
			<td style="width:107px;">100106</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A4503-50G</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:169px;">Trypsin EDTA 0.25%</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25200-056</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">14190-250</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:169px;">Crystal violet</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">C0775-100G</td>
			<td style="width:193px;">Dissolved in water at 0.2%</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Cell disassociation buffer</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">13151-014</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:193px;">Model # 3145</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">SterilGARD biosafety hood</td>
			<td style="width:133px;">The Baker Company, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:193px;">Model # VBM-600</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">EVOS Fl inverted microscope</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:193px;">Model # AMF-4302-US</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:169px;">Tissue culture plate</td>
			<td style="width:133px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:107px;">353046</td>
			<td style="width:193px;">Catalog number varies depending on the type of culture plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:169px;">Corning Transwell insert</td>
			<td rowspan="2" style="width:133px;">Fisher</td>
			<td rowspan="2" style="width:107px;">07-200-150</td>
			<td rowspan="2" style="width:193px;">Catalog number varies depending on the pore size of the membrane</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro cell migration and invasion assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

أجريت إغلاق فحص الجرح وفحص الهجرة الخلية transwell المقدمة هنا باستخدام خلايا فأر B16F10 سرطان الجلد كنظام نموذج. في مقايسة إغلاق الجرح، وكانت المصنفة B16F10 الخلايا في 6 جيدا نسيج لوحة الثقافة ونمت إلى 100٪ التقاء في غضون 24 ساعة. ولدت وجرح ما يقرب من 700 ميكرون واسع باستخدام طرف م?...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Cell Migration and Invasion Assays at JoVE.com

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

تستخدم عادة، يتم وصف طرق للوصول للغاية لدراسة الهجرة الخلية والغزو في المختبر. الأسلوب الأول هو الجرح خلية إغلاق الفحص الذي يقيس حركية الخلية. الأسلوب الثاني هو transwell الهجرة والغزو الفحص أن يقيم الكيميائي والقدرة الغازية من الخلايا.

في المختبر الهجرة الخليوي والغزو فحوصات

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

in-vitro-cell-migration-and-invasion-assays

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Unit 1

Cell Polarization and Migration

SCIENTISTS IN ACTION

136.9K Views.  East Carolina University.  تستخدم عادة، يتم وصف طرق للوصول للغاية لدراسة الهجرة الخلية والغزو في المختبر. الأسلوب الأول هو الجرح خلية إغلاق الفحص الذي يقيس حركية الخلية. الأسلوب الثاني هو transwell الهجرة والغزو الفحص أن يقيم الكيميائي والقدرة الغازية من الخلايا. 

Video: In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

مقايسة للالتصاق وغزو آجار في البيرة س.

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

فحوصات Neurocircuit عن المضبوطات في المسوخ من الصرع ذبابة الفاكهة</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

و في المختبر غزو الورم FluoroBlok الفحص

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

في المختبر تجميع فحوصات عن طريق Hyperphosphorylated تاو البروتين

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

طرق للبشرة إصابة وفحوصات لالردود الجرح في<em&gt; C. ايليجانس</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

الكميات من البطانية الإلتصاق الخليوي<em&gt; في المختبر</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity greatly impacts cell behavior to regulate normal and pathologic processes including cell proliferation, differentiation, adhesion signaling and directional migration. In this regard, the innate ability of certain cell types to migrate towards a stiffer, or less compliant matrix substrate is referred to as durotaxis. This phenomenon plays an important role during embryonic development, wound repair and cancer cell invasion. Here, we describe a straightforward assay to study durotaxis, in vitro, using polydimethylsiloxane (PDMS) substrates. Preparation of the described durotaxis chambers creates a rigidity interface between the relatively soft PDMS gel and a rigid glass coverslip. In the example provided, we have used these durotaxis chambers to demonstrate a role for the cdc42/Rac1 GTPase activating protein, cdGAP, in mechanosensing and durotaxis regulation in human U2OS osteosarcoma cells. This assay is readily adaptable to other cell types and/or knockdown of other proteins of interests to explore their respective roles in mechanosignaling and durotaxis.

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

نظام مبسط لMechanosensing تقييم خلية وDurotaxis<em&gt; في المختبر</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between cells, the extracellular matrix, and soluble and non-soluble chemical factors (e.g., chemoattractants). Standard methods for measuring the migration of cells, such as the Boyden chamber assay, work by counting cells on either side of a divider. These techniques are easy to use; however, they offer little geometric modification for different applications. In contrast, microfluidic devices can be used to observe cell migration with customizable concentration gradients of soluble factors1,2. However, methods for making microfluidics based assays can be difficult to learn.
Here, we describe an easy method for creating cell culture chambers to measure cell migration in response to chemical concentration gradients. Our cell migration chamber method can create different linear concentration gradients in order to study cell migration for a variety of applications. This method is relatively easy to use and is typically performed by undergraduate students.
The microchannel chamber was created by placing an acrylic insert in the shape of the final microchannel chamber well into a Petri dish. After this, poly(dimethylsiloxane) (PDMS) was poured on top of the insert. The PDMS was allowed to harden and then the insert was removed. This allowed for the creation of wells in any desired shape or size. Cells may be subsequently added to the microchannel chamber, and soluble agents can be added to one of the wells by soaking an agarose block in the desired agent. The agarose block is added to one of the wells, and time-lapse images can be taken of the microchannel chamber in order to quantify cell migration. Variations to this method can be made for a given application, making this method highly customizable.

This protocol details a customizable method to measure cell migration in response to chemoattractants that may also be used to determine the diffusion rate of a drug out of a polymer matrix.

للدائرة للتخصيص لقياس الهجرة الخلية

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...