وقد وافق جميع الإجراءات المتبعة في جامعة ولاية ويسكونسن على لجنة رعاية الحيوان ، وكانت متفقة مع المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة. نشكر الدكتور كاثرين قليل قرب نابلس لاستخدام الجهاز سخية لها Nucleofector. ونشكر أيضا أعضاء في مختبر دنت للتعليق على هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 - NS064014 ، ومؤسسة دانا وايتهول لمؤسسة EWD ساهم Viesselmann كريستوفر ، وجايسون Ballweg Lumbard ديريك بالتساوي على هذه الورقة.

1. إعداد Coverslips والدوائر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد coverslips غرف نظيفة وضروري للثقافات صحية. لا ينبغي أن تؤخذ اختصارات في أي من هذه الخطوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips (الجولة 22mm و 12mm أو والزجاج ألماني -- كارولينا مساعد العلامة التجارية) بين عشية وضحاها في تركيز حمض النتريك (HNO3) في وعاء زجاجي مخصص أو الكأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة coverslips من حمض النتريك وتغسل على نطاق واسع (5 - 7X) في الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل coverslips والجافة في التدفق الصفحي أو غطاء لمجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. عندما تجف ، وتعقيم لهم ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. تعقيم مكان coverslips إلى أطباق بتري معقمة للتخزين. إذا الخلايا العصبية الطلاء على coverslips 12mm مكان coverslips مباشرة في طبق 35mm العقيمة ، والشروع في القسم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي التي شيدت غرف التصوير عن طريق حفر حفرة 15mm في الجزء السفلي من أطباق بتري 35mm (إزالة جميع نتوءات) ، وربط coverslips تنظيفها بمزيج 03:01 من البارافين والفازلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان البارافين / هلام البترول خليط في أنبوب مخروطي داخل حمام ماء يغلي. استخدام فرشاة الدهان الصغيرة ومعطف السفلي من صحن حول الثقب 15mm. تأكد للحفاظ على تحريك البارافين / هلام البترول خليط لأنها سوف منفصلة. هذه النتائج عادة في غرف لصقها معا مع تركيز أعلى من الفازلين ، والتي سوف تصبح لزجة عندما توضع الأطباق في الحاضنة ، مما أدى إلى انفصال ساترة. ويمكن تخزين البارافين المتبقية / الفازلين في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الطبق رأسا على عقب على صينية مسطحة ومكان ساترة فوق الحفرة. الحرارة 80 درجة مئوية في الفرن حتى يذوب الخليط البارافين (~ 10 دقيقة). إزالة الأطباق على سطح مستو ، والسماح للمجموعة خليط البارافين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره عبر الأطباق وتعقيم كل من الدواخل من الأغطية وقيعان من غرف للأشعة فوق البنفسجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips معطف أو المناطق زجاج الغرف مع 1.0mg/mL بولي د يسين (30kDa) في المخزن بورات (0.1M بورات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.5) لمدة ساعة. شطف 3-5 مرات مع كميات وفيرة من المياه وزراعة الأنسجة الصف منزوع الأيونات. تأكد من إزالة جميع آثار العازلة بورات. الجافة واستخدامها على الفور أو تخزين غرف / coverslips لاستخدامها لاحقا. نستخدم عادة coverslips تنظيفها غضون شهر واحد من الإعداد. </li></ol> 2. إعداد تشريح الخلايا العصبية ومتوسطة الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة تشريح (DM) وذلك بإضافة كميات مناسبة من HBSS 10x وHEPES 100X لزراعة الأنسجة المياه الصف. المحل في 4 درجات مئوية. تبقي على الجليد خلال التشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من تشريح تحضير الطلاء المتوسطة (AM) وخالية من مصل المتوسطة (SFM). PM يتكون من متوسطة Neurobasal ، ملحق B27 ، 2 ملي الجلوتامين ، والجلوكوز بنسبة 0.3 ٪ ، 37.5 ملم وكلوريد الصوديوم 5 ٪ مصل بقري جنيني (FBS). SFM يتكون من متوسطة Neurobasal ، ملحق B27 ، 2 الجلوتامين مم ، غلوكوز 0.3 ٪ و 37.5 ملي كلوريد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم ما يكفي فقط للتشريح وتخزينها في الأنسجة ثقافة حاضنة ليلا مع الغطاء قليلا حتى مواربا أن درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2 مضمون equilibrates المتوسط. نضيف السكر وزيادة اضافية الأسمولية ل310mOsm تقريبا مع كلوريد الصوديوم. نجد أن الثقافات ما هو أفضل في الأسمولية أكثر الفسيولوجية (الأسمولية Neurobasal عادة 245mOsm 205). </li></ol> 3. طبقة قشرية الطاعم الدبقية التحضير الطويلة الأجل الثقافات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا الثقافات على المدى الطويل هي أن نكون مستعدين ، تنفيذ هذا الجزء من اسبوعين الى ثلاثة اسابيع قبل البروتوكول المستمر مع تشريح القشرية أو قرن آمون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة الدبقية (GM) مع MEM والجلوكوز بنسبة 0.3 ٪ ، البنسلين / الستربتوميسين و 10 ٪ مصل الحصان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الجراء الماوس P1 - P3 عن طريق التبريد على الجليد لمدة 5 دقائق. إزالة كل الجرو من الجليد ورذاذ مع الايثانول 70 ٪. قطع رأس بسرعة مع المقص. إزالة المخ بأكمله إلى صحن يحتوي الباردة DM (الخطوة 2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة نصفي الدماغ والسحايا. استئصال وإزالة القشرة المخية الحديثة إلى طبق جديد لا تحتوي على وسائل الإعلام. إعداد القشور من مجموع 4 العقول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللحم المفروم مع القشور ونظيفة ، وشفرة حلاقة معقمة كما غرامة ممكن ، وإزالة الأنسجة المفروم مع ماصة بلاستيكية لأنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 12 مل من DM الباردة. إضافة التربسين والدناز لتركيزات النهائي 0.25 ٪ (1.5 مل) و 0.1 ٪ (1.5 مل) على التوالي. احتضان في حمام الماء ° 37 مئوية لمدة 10 دقيقة مع تحريكها على فترات متقطعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنبوب الذي يحتوي على أنسجة القشرية ونظيفة تماما مع الايثانول 70 ٪ قبل ان يصل إلى الأنسجة هود الثقافة. الأنسجة الماصة القشرية صعودا ونزولا مع ماصة 10 مل تقريبا 10-15 مرات ، أو حتى تختفي معظم أجزاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة الأنبوب إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 10 دقيقة مع تحريكها على فترات متقطعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف الأنبوب جيدا مع الايثانول 70 ٪ وإعادته إلى الأنسجة هود الثقافة. الماصة النسيج القشرية صعودا وهبوطا مع 5 مL ماصة حوالي 10-15 مرة ، أو حتى قطع تختفي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 مل من جنرال موتورز دافئة والطرد المركزي في 200xg (1000rpm) لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ، resuspend الخلايا مكعبات في 20 مل من جنرال موتورز الجديدة والعد مع عدادة الكريات. لوحة 5 - 7.5x10 6 خلايا في 15 مل من جنرال موتورز في قارورة 75cm 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يوم واحد كل 2-3 أيام لاحقة في الثقافة ، وطرد الخلايا فضفاضة يطرق القارورة ضد يدك. إزالة المتوسطة جنبا إلى جنب مع أية خلايا فكها واستبدالها مع 15 مل من جنرال موتورز جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن حصاده الدبقية بعد 1-2 أسابيع من النمو في قوارير ، وعندما توشك 7-10 ٪ متموجة. لإعداد coverslips الفردية المغلفة مع الدبقية ، وحامض النيتريك المركز 6 نظيفة ومعقمة 25mm coverslips جولة في صحن 10cm ، والمكان 3 نقاط من مزيج 03:01 من البارافين / الفازلين على كل ساترة في نمط الثلاثي مع فرشاة الدهان الصغيرة . علاج أطباق مفتوحة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. معطف coverslips بنسبة 0.1 ملغ / مل بولي د يسين (30kDa) في المخزن بورات لمدة ساعة ، ثم تغسل على نطاق واسع (3 - 5X) مع الماء المعقم نسيج ثقافة الصف منزوع الأيونات واسمحوا الجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القارورة التي تحتوي على الدبقية من الحاضنة ، تجاهل المتوسطة والشطف مع 5 مل من قبل تحسنت التربسين / حل EDTA. إزالة الحل التربسين / EDTA من القارورة وماصة 3 مل من التربسين قبل تحسنت طازجة / EDTA في القارورة. احتضان القارورة لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل ان يضيف 5 مل من جنرال موتورز لوقف trypsinization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الدبقية من القارورة التي تتكرر pipetting 10-15 مرات ، ومن ثم نقل وسائل الإعلام على أنبوب 15 مل المخروطية. الطرد المركزي في 200xg (1000rpm) لمدة 8 دقائق. إزالة طاف وإضافة 10 مل من جنرال موتورز ، وعدد الخلايا ، والخلايا لوحة 5x10 5 في 12.5 مل من جنرال موتورز في صحن يحتوي على coverslips 10cm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل المتوسطة مع الطازج قبل أيام تحسنت كل جنرال موتورز 2-3. قبل يوم من تشريح الخلايا العصبية ، وإزالة واستبدال جنرال موتورز مع SFM (القسم 2.2). استخدام هذا SFM الدبقية مكيفة في الخطوة عند 4.12 الفيضانات الثقافات القشرية أو قرن آمون. </li></ol> 4. قشري و / أو تشريح الحصين وElectroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الكميات المناسبة من الحلول nucleofection (Lonza) ، والجمع ، وإلى درجة حرارة الغرفة دافئة قبل البدء في تشريح. منذ حل Nucleofection لديه محدود مدى الحياة عند الجمع ، ونحن فقط الجمع بين المبلغ اللازم لإعداد كل (100 ميكرولتر في ترنسفكأيشن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء ماوس حاملا في E15.5 مع CO 2 (اليوم هو من المكونات E0.5) وإزالة الرحم إلى 10cm طبق بتري. إزالة قطع رأس الأجنة وإلى DM الباردة (القسم 2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المخ بأكمله في طبق منفصل DM الباردة وبإبرة التنغستن عازمة ، إزالة كل neocortices. إزالة السحايا مع microforceps والقشور مكان في صحن جديد من DM الباردة. مع مقص القزحية أو يكر الصغيرة ، وإزالة القشرة أو الحصين ومكان في أنبوب 1.5 مل إيبندورف مليئة 1.0 مل من DM الباردة. الحفاظ على هذا الانبوب على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تشريح جميع القشور أو الحصين ، إضافة 110 ميكرولتر من التربسين 2.5 ٪ إلى الأنبوب الذي يحتوي على أنبوب إيبندورف النسيج وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القشور ويغسل أو طاف الحصين مع 1.0 مل م (القسم 2.2) عن طريق أنبوب إيبندورف عكس بلطف و. تكرار غسل مرتين ، وترك 1 مل من بعد الظهر في الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسحن على قطع 15 مرة مع ماصة P1000 ، وإزالة الخلايا طاف / لأنبوب جديد 15 مل مخروطي يحتوي على 4 مل م ، ترك أي مساحات التي لا تزال في أنبوب إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في أنبوب 15 مل 20xg (350rpm) لمدة 7 دقائق مع قبالة الفرامل. تجاهل طاف وإضافة 100 ميكرولتر من خلط حل الغرفة ، nucleofection درجة الحرارة (Lonza) لكل ترنسفكأيشن. متمزج 5 مرات مع اقتراح لطيف صعودا وهبوطا من ماصة P1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 100 ميكرولتر من خليط محلول / خلية nucleofection لكل أنبوب إيبندورف جديدة وإضافة كمية مناسبة من الحمض النووي. للثقافات على المدى الطويل التي نستخدمها عادة 1 - 2μg من الحمض النووي لكل ترنسفكأيشن. ومع ذلك ، فإن هذه التسميات إلا نسبة صغيرة &lt;10 ٪ من الخلايا العصبية في الثقافة. نستخدم عادة 5 - 10μg من الحمض النووي لكل ترنسفكأيشن إذا أردت كفاءة أعلى للثقافة ترنسفكأيشن المدى القصير. وقد استخدمنا تصل إلى ما مجموعه 40μg من الحمض النووي عند transfecting مع اثنين من البلازميدات مختلفة. يتم تخزين في المخزن المؤقت البلازميدات TE في 1μg / ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تعليق خلية / الحمض النووي للكفيت (Lonza) وelectroporate الخلايا في Nucleofector (Lonza) ، وذلك باستخدام برنامج O - 005 (الماوس الجهاز العصبي المركزي الخلايا العصبية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل بسرعة ، وإضافة 500 ميكرولتر من قبل PM تحسنت ومعايرتها إلى حل وإزالة كفيت / الخلايا الجديدة إلى 1.5 مل أنبوب إيبندورف. إضافة PM كافية لجعل حجم كل ترنسفكأيشن إلى 1.0 مل. عدد الخلايا مع عدادة الكريات والخلايا في لوحة 3 3 - 5x10 / سم 2 للثقافات الشباب ، أو 5 - 10x10 3 خلية / سم 2 لمدة طويلة الأجل الثقافات &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> على المدى القصير الثقافات والفيضانات الأطباق الثقافة 35mm مع مل 2.0 من الدفء ، CO 2 - SFM معايرتها بعد ساعة واحدة من الطلاء. إذا باستخدام coverslips ، ونحن بإزالة واحد من نصف عدد الوزراء واستبداله SFM ، ثم كرر مرتين أخريين. الفيضانات إما غرف التصوير أو غسل النتائج coverslips في محتوى المصل منخفضة جدا (&lt;0.5 ٪). على المدى القصير الثقافات لا تحتاج إلى أن يكون مثقف بطبقة المغذية الدبقية ولست بحاجة إلى أن يعاد تغذيتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على المدى الطويل الثقافات ، ونحن إزالة ساترة الدبقية مغطاة تحتوي على ثلاث نقاط من البارافين / الفازلين وعكس ذلك خلال ثقب 15mm في الطبق 35mm ، بعد ساعة واحدة الطلاء الأولي. ثم يتم إضافة اثنين ملليلتر من SFM مشروطة من الطبق الدبقية إلى غرفة التصوير. لتغذية الثقافات على المدى الطويل ، ونحن إزالة ثلث من SFM كل 2-3 أيام واستبدالها SFM - 2 معايرتها العذبة ، وقبل حرارة وثاني أكسيد الكربون. </li></ol> 5. ممثل النتائج : <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. وتظهر الخلايا العصبية الحصين يعيشون في مراحل متتالية من التنمية. الصور المقترنة ممثل يعيشون الخلايا العصبية الحصين على حد سواء على النقيض من الصورة وتدخل الفرق المقابلة مجهرية الفلورسنت. وقد transfected كل من هذه الخلايا مع تويولين - EGFP وDsRed2 في ناقلات pCAX. وكان تصوير الخلايا العصبية في الأيام التالية في المختبر (DIV) : المرحلة 1 (1DIV) ، المرحلة 2 (1DIV) ، المرحلة 3 (2DIV) ، المرحلة 4 (11DIV) والمرحلة 5 (32DIV). شريط المقياس 20μm.

<ol>
	<li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.">Chapter 13.</a> Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches.">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li><li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton.">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li><li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation.">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li><li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines.">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li><li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+Ena/VASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1.">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li><li>Meberg, P. J., Miller, M. W., Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7.">Chapter 7.</a> Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , 112-129 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection.">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد تم تطوير هذا البروتوكول من أجل استنبات الخلايا العصبية الجنينية الماوس قرن آمون والقشرة وتعديل البروتوكول بانكر ، التي تستخدم الخلايا العصبية الفئران 1،2. وقد استخدمنا هذا البروتوكول للماوس وزراعة الخلايا العصبية كما الهامستر 3،4،5،6،7 جيدا. هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد على قدم المساواة كل من الخلايا العصبية للقرن آمون والقشرة المخية الحديثة ومشابه لبروتوكول نشرتها Meberg وميلر 8. عموما ، نحن نستخدم الخلايا العصبية الحصين على المدى الطويل لأن ثقافة تتميز أيضا أنها نموذج ونظام أكثر رسوخا. علاوة على ذلك ، من المرجح أن تحتوي على مجموعة من السكان أكثر تجانسا من الخلايا العصبية من القشرة المخية الحديثة. ومع ذلك ، الخلايا العصبية مثقف القشرة المخية الحديثة باستخدام هذا البروتوكول أيضا البقاء على قيد الحياة والتفريق بالمثل (بيانات غير منشورة). نستخدم عادة الخلايا العصبية قرن آمون والقشرة المخية الحديثة للثقافة على المدى القصير. نتائج تشريح القشرة المخية الحديثة أيضا في الخلايا العصبية أكثر بكثير (1.5x10 6 الخلايا العصبية لكل زوج من القشور) من تشريح الحصين (2.5x10 5 الخلايا العصبية لكل زوج من الحصين) ، مما يجعله خيارا أفضل المواد لالنشاف الغربية ، على سبيل المثال. كما هو الحال مع أي ثقافة الأولية ، فإنه من الضروري لتقليل الوقت الذي يستغرقه من موت الحيوان إلى طلاء للخلايا. وسوف يستغرق عادة 10-20 تشريح لتصبح سريع باستمرار في تشريح والطلاء. أيضا ، عند العمل مع Nucleofector Lonza ، من الأهمية بمكان العمل بسرعة أثناء إجراء electroporation ، وبقاء الخلايا العصبية يتناقص بسرعة إذا ما تركت في المنطقة العازلة nucleofection. ويجري تصوير الكثير من علاقاتنا مع الانعكاس الداخلي الكلي المجهري مضان (TIRFM). هذا النوع من الفحص المجهري هي الوحيدة القادرة على عدة مئات من نانومتر التصوير خارج ساترة. ولذلك ، فإن مناطق الخلايا العصبية التي كثيرا ما كنا الصورة ، مخروط النمو محواري والعمود الفقري شجيري ، والحاجة إلى التقيد مباشرة إلى ساترة. وبالتالي ، فإننا نستخدم الثقافات منخفض الكثافة التي تتطلب تغذية الدبقية لمدة طويلة الأجل الثقافة. وقد استخدمنا الثقافات العالي الكثافة (&gt; 2x10 4 خلايا / سم 2) ، من دون طبقات المغذية الدبقية ، على المدى الطويل الثقافات وجدت أنها البقاء على قيد الحياة بشكل جيد جدا مع قليل التغذية. ومع ذلك ، العمود الفقري شجيري من هذه الخلايا العصبية هي في كثير من الأحيان بعيدا جدا من الركيزة لصورة في TIRFM ، على الرغم من أنها يمكن الكشف عنها بسهولة مع واسعة المجال المجهري أو المجهري متحد البؤر. في معظم الدراسات لدينا نحن transfect الخلايا العصبية قبل الطلاء ، ولقد التقط fluorescently البروتينات التي تحمل علامات لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر في مجال الثقافة. هذا التعبير على المدى الطويل من البروتينات التي تحمل علامات fluorescently يعطينا الثقة بأن باستخدام تركيزات منخفضة من الحمض النووي (1 - 2μg) ونحن لا تنتج القطع الأثرية overexpression في الخلايا العصبية. ومع ذلك ، يمكن أيضا أن تستخدم هذا الإجراء لدراسة overexpression من البروتينات إذا تم استخدام كميات كبيرة من الحمض النووي (10 20μg). والبلازميدات التي نستخدمها لtransfect الخلايا العصبية عادة ما تحتوي على البروتينات أو الانصهار EGFP mCherry ، على الرغم من أننا أيضا تسمية السيتوبلازم العصبية مع DsRed2 أو EGFP وحدها. هذه التقنية تعمل بشكل جيد electroporation مع عدد من النواقل. نحن نفضل البلازميدات التي تحتوي على مروج β - أكتين مع محسن CMV وβ غلوبين بولي - A الذيل (pCAGGs أو البلازميدات pCAX) 9 ، ويرجع ذلك الى مستويات عالية نسبيا من التعبير ، والحقيقة التي تحملها جيدا من قبل الخلايا العصبية في كل ثقافة قصيرة الأجل وطويلة الأجل. عموما ، تبدأ في التعبير عن البروتينات داخل نحو 4 ساعات من الطلاء والوصول إلى مستويات كافية للتصوير في غضون 10 - 10 24hrs. وقد استخدمنا بنجاح CMV - المروج يحركها البلازميدات في الثقافات المدى القصير ، ولكن وجدت أنها يمكن أن تسبب مستويات عالية من overexpression التي تقتل الخلايا العصبية في المدى الطويل الثقافة. ومع ذلك ، فقد وجدنا أن تكييف الدبقية الثقافات منخفض الكثافة يساعد على بقاء الخلايا العصبية مع transfected CMV - المروج البلازميدات مدفوعة ، مقارنة مع ارتفاع الكثافة (غير الدبقية فدان) الثقافات.

* معظم الكواشف التي نقوم بتخزين في -80 درجة مئوية ويمكن تخزينها في -20 درجة مئوية كذلك. تخزينها في -80 درجة مئوية يطيل حياتها الجرف والنتائج في الثقافات قليلا أكثر اتساقا.

nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons

وقد استخدمت الخلايا العصبية قرن آمون والقشرية على نطاق واسع لدراسة الجهاز العصبي المركزي (CNS) الاستقطاب العصبية ، ثمرة محوار / تغصن ، وتشكيل المشبك وظيفة. ميزة هذه استنبات الخلايا العصبية هي أنها استقطاب بسهولة ، وتشكيل المحاور المميزة والتشعبات ، على ركيزة ثنائية الأبعاد في كثافة منخفضة جدا. وقد جعلت هذه الخاصية مفيدة جدا لهم لتحديد العديد من جوانب التنمية العصبية. علاوة على ذلك ، من خلال توفير تكييف الدبقية لهذه الخلايا العصبية فإنها تستمر في تطوير وتشكيل اتصالات متشابك وظيفية والباقين على قيد الحياة لعدة أشهر في الثقافة. نحن في هذا البروتوكول مخطط تقنية لتشريح والثقافة وtransfect الخلايا العصبية الجنينية الماوس الحصين والقشرية. ويتم إنجاز ترنسفكأيشن electroporating بواسطة الحمض النووي في الخلايا العصبية قبل الطلاء عبر nucleofection. هذا البروتوكول لديه ميزة للتعبير عن البروتينات الانصهار fluorescently الموسومة في وقت مبكر في عملية التنمية (~ 4 - 8hrs بعد الطلاء) لدراسة ديناميات وظيفة من البروتينات خلال ثمرة الاستقطاب المحور ، والمتفرعة. اكتشفنا ايضا ان هذا ترنسفكأيشن واحد قبل الطلاء يحافظ fluorescently الموسومة بروتين تعبير الانصهار عند مستويات مناسبة للتصوير طوال مدة الخلايا العصبية (&gt; 2 أشهر في الثقافة). وبالتالي ، فإن هذه المنهجية هي مفيدة لدراسة توطين وظيفة البروتين في جميع أنحاء التنمية اضطراب الجهاز العصبي المركزي مع ضئيلة أو معدومة في وظيفة الخلايا العصبية.

Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons at JoVE.com

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

هذا البروتوكول يحدد الخطوات المطلوبة لتشريح ، transfect electroporation عبر الماوس والخلايا العصبية قرن آمون والثقافة القشرية. يمكن استخدامها على المدى القصير للدراسات الثقافات ثمرة محوار والتوجيه ، في حين يمكن استخدامها على المدى الطويل للدراسات الثقافات synaptogenesis وتحليل شجيري العمود الفقري.

Nucleofection والثقافة الأولية من الخلايا العصبية الجنينية الماوس الحصين والقشرية

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

nucleofection-primary-culture-embryonic-mouse-hippocampal-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.2K Views.  University of Wisconsin-Madison. هذا البروتوكول يحدد الخطوات المطلوبة لتشريح ، transfect electroporation عبر الماوس والخلايا العصبية قرن آمون والثقافة القشرية. يمكن استخدامها على المدى القصير للدراسات الثقافات ثمرة محوار والتوجيه ، في حين يمكن استخدامها على المدى الطويل للدراسات الثقافات synaptogenesis وتحلي?...

Video: Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

في الرحم بعد Electroporation للثقافة متعلق بالخلايا العصبية الأولية لدراسة وظائف الجينات في مجموعة فرعية من العصبونات القشرية

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

ثنائي الصفائح المشارك ثقافة الجرذ الخلايا العصبية الابتدائية القشرية والدبقية

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران قبل الولادة

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

العزلة وثقافة الخلايا النجمية الماوس القشرية

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين الابتدائية

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

الثقافة الابتدائية من الخلايا العصبية الدوبامين ماوس

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

منخفض الكثافة الابتدائية الحصين العصبية الثقافة

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

جيل من المجالات العصبية من الخلايا العصبية خلية فرس النهر الأولية المختلطة والقشرية معزولة عن E14-E16 سبراغ دولي الفئران الجنين

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...