כל ההליכים אושרו על ידי אוניברסיטת ויסקונסין ועדת טיפול בבעלי חיים היו בהתאם להנחיות NIH. אנו מודים לד&quot;ר קתרין קליל לשימוש הנדיבה של המכשיר Nucleofector שלה. אנו מודים גם אנשי המעבדה דנט הערות על פרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH R01-NS064014, דנה קרן וייטהול קרן אל EWD כריסטופר Viesselmann, ג&#39;ייסון Ballweg ודרק Lumbard תרמו באופן שווה על הנייר הזה.

1. הכנת Coverslips ו צ&#39;יימברס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת coverslips ותאי נקי חיונית תרבויות בריא. קיצורי דרך לא צריך לקחת את כל הצעדים האלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips (עגול 12mm או 22mm, זכוכית הגרמנית - מותג קרוליינה עוזר) לילה חומצה חנקתית מרוכזת (HNO3) בצנצנת זכוכית או כוס ייעודי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslips של חומצה חנקתית ולשטוף בהרחבה (5-7x) במים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את coverslips ויבש במנדף זרימה למינרית או ארון biosafety. כאשר יבש, לעקר אותם עם אור UV במשך 30 דקות. המקום מעוקרים coverslips לתוך מנות פטרי סטרילית לאחסון. אם הנוירונים ציפוי על coverslips 12mm ישירות למקום coverslips בצלחת 35mm סטרילית ולהמשיך סעיף 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדרי הדמיה בנויים על ידי קידוח חור 15mm בתחתית של מנות 35mm פטרי (להסיר את כל הקוצים) ו הצמדת coverslips לנקות בתערובת 03:01 של פרפין וזלין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את פרפין / תערובת וזלין בתוך צינור חרוטי בתוך אמבט מים רותחים. השתמשו במברשת צבע קטנה מעיל התחתון של המנה סביב החור 15mm. הקפד לשמור על ערבוב פרפין / תערובת וזלין כפי שהוא יהיה נפרד. בדרך כלל זה גורם לתאי מודבק יחד עם ריכוז גבוה של וזלין, אשר תהפוך צמיגה כאשר המנות ממוקמות בתוך האינקובטור, וכתוצאה מכך ניתוק coverslip. פרפין הנותרים / וזלין ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת הפוכה על מגש שטוח המקום coverslip מעל החור. מחממים תנור 80 ° C עד שהתערובת פרפין הוא נמס (~ 10 דקות). הסר הכלים על גבי משטח שטוח ולתת להגדיר תערובת פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הכלים שוב לעקר הן הפנימי של מכסה בתחתית לתאי עם האור האולטרה סגול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל coverslips או אזורים כוס לתאי עם 1.0mg/mL Poly-d-ליזין (30kDa) ב borate חיץ (borate 0.1M נתרן, pH 8.5) למשך שעה אחת. יש לשטוף 3-5 פעמים עם כמויות של מים תרבות כיתה רקמות deionized. הקפד להסיר כל עקבות של חיץ borate. יבש ולהשתמש מיד או לאחסן בתאי / coverslips לשימוש מאוחר יותר. אנחנו בדרך כלל להשתמש coverslips לנקות בתוך חודש אחד של הכנה. </li></ol> 2. הכנת Dissection העצבית ובינוניים תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום דיסקציה (DM) על ידי הוספת כמויות מתאימות של HBSS 10x ו HEPES 100x למים בתרבית רקמה כיתה. חנות ב 4 ° C. שמור על הקרח במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני לנתיחה מכינים את ציפוי בינוני (PM) ו - סרום ללא בינוני (SFM). PM מורכב בינוני Neurobasal, תוסף B27, גלוטמין 2 מ&quot;מ, גלוקוז 0.3%, 37.5 mM NaCl ו - 5% בסרום שור העובר (FBS). SFM מורכב בינוני Neurobasal, תוסף B27, גלוטמין 2 מ&quot;מ, גלוקוז 0.3% ו 37.5 mM NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספיק לעשות רק לנתיחה ולאחסן בתרבות רקמה חממה לילה עם כובע פתוחה מעט, כך הטמפרטורה CO 2 תוכן equilibrates בינוני. אנו מוסיפים גלוקוז נוסף ולהגדיל את osmolality כדי 310mOsm עם כ NaCl. אנו מוצאים התרבויות לעשות טוב יותר osmolality פיזיולוגי יותר (osmolality Neurobasal הוא בדרך כלל 205-245mOsm). </li></ol> 3. שכבה קליפתיים גליה מזין הכנה לטווח ארוך תרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרבויות לטווח ארוך הן כדי להיות מוכן, לבצע את החלק הזה של שבועיים עד שלושה שבועות פרוטוקול לפני שתמשיך עם חתכים או קליפת המוח בהיפוקמפוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני גליה (GM) עם מזכרות, גלוקוז 0.3%, פניצילין / סטרפטומיצין ו בסרום סוס 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים P1-P3 גורים העכבר על ידי קירור על הקרח במשך 5 דקות. הסר כל הגור מן הקרח תרסיס עם אתנול 70%. במהירות לערוף במספריים. הסר את המוח כולו מאכל המכיל קר DM (שלב 2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שני חצאי המוח קרומי המוח. הניאוקורטקס והבלו ולהסיר את צלחת חדשה המכילה אין מדיה. הכן בקורטקס המוח מתוך 4 בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשר טחון קליפת המוח עם להב, גילוח נקי סטרילי כמו קנס ככל האפשר ולהסיר רקמה קצוץ עם טפטפת פלסטיק צינור חרוטי 50 מ&quot;ל המכיל 12 מ&quot;ל של קר DM. הוספת טריפסין ו DNase לריכוזים הסופי של 0.25% (1.5 מ&quot;ל) ו - 0.1% (1.5 מ&quot;ל), בהתאמה. מדגירים את אמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם מתערבל לסירוגין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שפופרת המכילה את רקמת קליפת המוח ולנקות ביסודיות עם אתנול 70% לפני הבאת לתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה. רקמה Pipet קליפת המוח מעלה ומטה עם טפטפת 10 מ&quot;ל כ 10-15 פעמים, או עד שרוב נתחי להיעלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הצינור כדי 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 10 דקות עם מתערבל לסירוגין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ביסודיות את הצינור עם 70% אתנול ו להחזיר אותו למכסה המנוע בתרבית רקמה. Pipet רקמת קליפת המוח מעלה ומטה עם 5 מ &#39;L פיפטה כ 10-15 פעמים, או עד נתחי נעלמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 מ&quot;ל של GM חם צנטריפוגות ב 200xg (1000rpm) במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspend התאים pelleted ב 20 מ&quot;ל של GM טריים לספור עם hemocytometer. 5-7.5x10 פלייט 6 תאים 15 מ&quot;ל של GM לכל בקבוק 2 75 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי יום אחד כל 2-3 ימים לאחר מכן בתרבות, לסלק תאים משוחרר על ידי דופק את הבקבוק נגד היד שלך. הסר את בינוני יחד עם כל התאים וחילצה ולהחליפו 15 מ&quot;ל של GM טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גליה ניתן לקצור לאחר 1-2 שבועות של צמיחה צלוחיות, כאשר הם על 70-100% ומחוברות. כדי להכין coverslips הפרט מצופה גליה, מקום 6 חומצה חנקתית ניקה מעוקרים 25mm coverslips סביב צלחת 10 ס&quot;מ, ומקום 3 נקודות תערובת 03:01 של פרפין / וזלין על coverslip כל תבנית משולש עם מברשת צבע קטנה . פנקו את הכלים לפתוח עם אור UV במשך 30 דקות. המעיל coverslips עם 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Poly-d-ליזין (30kDa) במאגר borate במשך שעה אחת, ולאחר מכן לשטוף בהרחבה (3-5x) עם תרבות סטרילי מים כיתה רקמות deionized ולתת להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבקבוק גליה המכילים מן האינקובטור, להשליך את המדיום ולשטוף עם 5 מ&quot;ל של טרום חימם טריפסין / פתרון EDTA. הסר את הפתרון טריפסין / EDTA מהבקבוק ו פיפטה 3 מ&quot;ל של טרי מראש חימם טריפסין / EDTA לתוך הבקבוק. דגירה את הבקבוק למשך דקה 1 ב 37 ° C לפני הוספת 5 מ&quot;ל של GM כדי לעצור את trypsinization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את גליה מבקבוקון ידי חזר pipetting 10-15 פעמים, ולאחר מכן להעביר את התקשורת צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב 200xg (1000rpm) במשך 8 דקות. הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ&quot;ל של GM, תאים לספור, 5x10 צלחת 5 תאים 12.5 מ&quot;ל של GM לכל צלחת 10 ס&quot;מ המכיל את coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבורסה בינוני עם טרי מראש חימם GM כל 2-3 ימים. יום לפני לנתיחה הנוירון, להסיר את GM ולהחליף SFM (סעיף 2.2). השתמש SFM גליה ממוזג בשלב 4.12 כאשר הצפה תרבויות או קליפת המוח בהיפוקמפוס. </li></ol> 4. Dissection הקורטיקליים / או בהיפוקמפוס electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כמויות מתאימות של פתרונות nucleofection (Lonza), לשלב, חם לטמפרטורת החדר לפני תחילת הניתוח. מאז יש פתרון Nucleofection מוגבלת לכל החיים כאשר הוא משולב, אנחנו רק לשלב את הסכום הדרוש להכנת כל אחד (100 μL לכל transfection). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר בהריון E15.5 עם CO 2 (יום התקע E0.5) להסיר את הרחם כדי בצלחת פטרי 10 ס&quot;מ. הסר עוברים לערוף לתוך קר DM (סעיף 2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח כולו לתוך צלחת נפרדת של DM קר עם מחט טונגסטן כפופות, יש להסיר גם neocortices. הסר את קרומי המוח עם microforceps ו הקורטקס מקום לתוך צלחת החדש של DM קר. עם מספריים קטנים קשתית או Wecker, להסיר את קליפת המוח להיפוקמפוס או ומכניסים צינור 1.5 Eppendorf מ&quot;ל מלאים 1.0 מ&quot;ל של קר DM. שמור את זה צינור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לנתח כל קליפת המוח או hippocampi, להוסיף 110 μL של טריפסין 2.5% ל הצינור Eppendorf המכיל את הצינור רקמות מקום 37 ° C החממה במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קליפת המוח supernatant לשטוף או hippocampi עם 1.0 מ&quot;ל PM (סעיף 2.2) על ידי צינור היפוך בעדינות Eppendorf. חזור על לשטוף פעמיים, והשאיר 1 מ&quot;ל של PM בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate גושי 15 פעמים עם טפטפת P1000, ולהסיר תאים supernatant / לצינור 15 חדש חרוטי מ&quot;ל המכיל 4 מ&quot;ל של ראש הממשלה, להשאיר גושים שנותרו בצינור Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין שפופרת 15 מ&quot;ל ב 20xg (350rpm) במשך 7 דקות עם הבלם משם. בטל supernatant ולהוסיף 100 μL של מעורבבים מראש, פתרון nucleofection הטמפרטורה בחדר (Lonza) עבור כל transfection. Triturate 5 פעמים בתנועות עדינות מעלה ומטה של ​​פיפטה P1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 100 μL של התערובת nucleofection פתרון / תא הצינור כל Eppendorf חדשה ולהוסיף את הכמות המתאימה של ה-DNA. עבור תרבויות לטווח ארוך אנו משתמשים בדרך כלל 1-2μg של ה-DNA לכל transfection. עם זאת, תוויות רק חלק &lt;10% קטן של נוירונים בתרבות. אנו משתמשים בדרך כלל 5-10μg של ה-DNA לכל transfection אם רוצים transfection יעילות גבוהה לתרבות לטווח קצר. השתמשנו עד לסך של 40μg של ה-DNA כאשר transfecting עם שני פלסמידים שונים. פלסמידים מאוחסנים TE למאגר ב 1μg / μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ההשעיה תא / DNA של קובט (Lonza) ו electroporate התאים Nucleofector (Lonza), באמצעות תוכנית O-005 (CNS נוירונים עכבר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במהירות, להוסיף 500 μL של PM מראש התחמם equilibrated כדי קובט ולהסיר פתרון / התאים צינור חדש Eppendorf 1.5 מ&quot;ל. הוסף PM מספיק כדי להביא את נפח transfection לכל mL 1.0. ספירת התאים עם hemocytometer צלחת בבית 3-5x10 3 תאים / ס&quot;מ 2 עבור תרבויות צעירים, או 5-10x10 3 תאים / ס&quot;מ 2 לטווח ארוך תרבויות. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לטווח קצר תרבויות, להציף את הכלים תרבות 35mm עם 2.0 מ&quot;ל של התחמם, CO 2-equilibrated SFM אחרי שעה אחת של ציפוי. אם אתה משתמש coverslips, אנו מסירים וחצי של ראש הממשלה ולהחליפה SFM, ולאחר מכן לחזור עוד פעמיים. או מציפים את חדרי הדמיה או לשטוף את תוצאות coverslips בתוכן בסרום נמוך מאוד (&lt;0.5%). לטווח קצר תרבויות לא צריך להיות מתורבת בשכבה מזין גליה ולא צריך להיות מחדש נמאס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לטווח ארוך תרבויות, אנו להסיר coverslip גליה מכוסה המכיל שלוש נקודות של פרפין / וזלין ו להפוך אותו מעל החור 15mm בצלחת 35mm, שעה אחת לאחר ציפוי ראשוני. שני מיליליטרים של SFM המותנה מצלחת גליה הוא הוסיף אז אל חדר הדמיה. כדי להאכיל את לטווח ארוך תרבויות, אנו להסיר שליש SFM כל 2-3 ימים ולהחליף אותו SFM 2-equilibrated טרי, מחומם מראש ו-CO. </li></ol> 5. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. חיים נוירונים בהיפוקמפוס בשלבים רצופים של פיתוח. מותאמים תמונות של נציג חי נוירונים בהיפוקמפוס מוצגים גם תמונה הפרעות בניגוד דיפרנציאלי מיקרוסקופ פלואורסצנטי המקביל. כל התאים הללו כבר transfected עם טובולין ו-EGFP DsRed2 ב וקטורים pCAX. הנוירונים הם צילמו את הימים הבאים במבחנה (DIV): שלב 1 (1DIV), שלב 2 (1DIV), שלב 3 (2DIV), שלב 4 (11DIV) ואת שלב 5 (32DIV). סרגל קנה המידה 20μm.

<ol>
	<li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.">Chapter 13.</a> Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches.">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li><li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton.">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li><li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation.">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li><li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines.">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li><li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+Ena/VASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1.">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li><li>Meberg, P. J., Miller, M. W., Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7.">Chapter 7.</a> Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , 112-129 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection.">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול זה עבור עובריים culturing נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח עכבר פותחה כשינוי של פרוטוקול בנקאי, אשר משתמשת נוירונים 1,2 חולדה. השתמשנו בפרוטוקול זה על עכבר culturing ונוירונים אוגר גם 3,4,5,6,7. פרוטוקול זה פועל באותה מידה גם עבור שניהם נוירונים בהיפוקמפוס neocortical והוא דומה פרוטוקול שפורסם על ידי Meberg ומילר 8. באופן כללי, אנו משתמשים נוירונים בהיפוקמפוס לתרבות לטווח ארוך כי הם מאופיינים היטב מערכת מודל מבוססות יותר. יתר על כן, הם עשויים להכיל אוכלוסיה הומוגנית יותר של נוירונים מאשר הניאוקורטקס. עם זאת, נוירונים בתרבית neocortical בפרוטוקול זה גם לשרוד להבדיל דומה (נתונים שלא פורסמו). אנו משתמשים באופן שגרתי נוירונים בהיפוקמפוס neocortical לתרבות לטווח קצר. Dissection של הניאוקורטקס גם התוצאות נוירונים באופן משמעותי יותר (1.5x10 6 נוירונים בקליפת המוח לכל זוג) מאשר דיסקציה בהיפוקמפוס (2.5x10 5 נוירונים לכל זוג hippocampi), מה שהופך אותו בחירה טובה יותר של חומר סופג המערבי, למשל. כמו כל תרבות ראשוני, חיוני כדי למזער את הזמן שזה לוקח ממותו של בעל החיים כדי ציפוי של התאים. זה יהיה בדרך כלל לוקח 10-20 והניתוחים להיות מהיר בעקביות לנתיחה ו ציפוי. כמו כן, כאשר עובדים עם Nucleofector Lonza, חשוב לעבוד במהירות במהלך ההליך electroporation, כמו את הכדאיות של נוירונים פוחתת במהירות אם הם נותרו למאגר nucleofection. הרבה הדמיה שלנו מתנהל עם סך מיקרוסקופ פלואורסצנטי פנימי ההחזרה (TIRFM). סוג זה של מיקרוסקופיה הוא מסוגל רק הדמיה מאות ננומטרים אחדים מעבר coverslip. לכן, אזורים של נוירונים שאנו לעתים קרובות תמונה, חרוט צמיחה axonal ו הקוצים הדנדריטים, צריך להיות דבק ישירות coverslip. לפיכך, אנו משתמשים בתרבויות צפיפות נמוכה שדורשים האכלה גליה לתרבות לטווח ארוך. השתמשנו תרבויות צפיפות גבוהה (&gt; 2x10 4 תאים / ס&quot;מ 2), ללא שכבות מזין גליה, לטווח ארוך תרבויות גילו כי הם שורדים טוב מאוד עם מעט האכלה. עם זאת, הקוצים הדנדריטים של נוירונים אלה הם לעתים קרובות גם הרחק המצע על התמונה TIRFM, למרות שהם יכולים להתגלות בקלות עם מיקרוסקופ שדה רחב או מיקרוסקופיה confocal. ברוב המחקרים שלנו אנו transfect נוירונים לפני ציפוי, ויש להם צילמו חלבונים fluorescently שכותרתו לתקופה של עד שלושה חודשים בתרבות. ביטוי זה לטווח ארוך של חלבונים fluorescently שכותרתו נותן לנו בטחון באמצעות ריכוזים נמוכים של דנ&quot;א (1-2μg) אנחנו לא מייצרים חפצים overexpression בתוך הנוירונים. עם זאת, הליך זה יכול לשמש גם כדי ללמוד overexpression של חלבונים אם כמויות גדולות של DNA משמשים (10-20μg). פלסמידים שבו אנו משתמשים כדי transfect נוירונים מכילים בדרך כלל EGFP או mCherry חלבונים היתוך, למרות שאנחנו גם התווית הציטופלסמה העצבית עם DsRed2 או EGFP לבד. טכניקה זו electroporation עובד היטב עם מספר וקטורים. אנחנו מעדיפים פלסמידים המכילים מקדם β-אקטין עם משפר CMV ו - β-גלובין מרובה זנב (pCAGGs או pCAX פלסמידים) 9, עקב רמות גבוהות יחסית של ביטוי, ואת העובדה כי הם נסבל היטב על ידי הנוירונים בתרבות הן בטווח הקצר והן לטווח הארוך. באופן כללי, חלבונים מתחילים להביע בתוך כ -4 שעות של ציפוי להגיע לרמות מספיקות הדמיה תוך 10-24hrs 10. השתמשנו בהצלחה CMV-האמרגן מונחה פלסמידים בתרבויות בטווח הקצר, אך גילו כי הם יכולים לגרום לרמות גבוהות של overexpression כי להרוג נוירונים בתרבית לטווח ארוך. עם זאת, מצאנו כי מיזוג של תרבויות גליה צפיפות נמוכה מסייעת להישרדות של נוירונים transfected עם CMV-האמרגן פלסמידים מונע, לעומת צפיפות (לא נמאס גליה) תרבויות גבוה יותר.

* רוב ריאגנטים כי אנו מאחסנים ב -80 ° C יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C גם כן. אחסונם ב -80 ° C מאריך את חיי המדף שלהם ואת התוצאות בתרבויות מעט יותר עקבי.

nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons

נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד את מערכת העצבים המרכזית (CNS) קיטוב העצבית, האקסון / דנדריט תוצאה, היווצרות הסינפסה ותפקוד. היתרון של נוירונים אלה culturing היא שהם בקלות לקטב, להרכיב אקסונים הייחודי דנדריטים, על מצע דו מימדי בצפיפויות נמוכות מאוד. תכונה זו הפכה אותם מאוד שימושי לקביעת היבטים רבים של ההתפתחות העצבית. יתר על כן, על ידי מתן מיזוג גליה עבור הנוירונים האלה הם ימשיכו להתפתח, ויצרו קשרים סינפטיים פונקציונלי לשרוד במשך כמה חודשים בתרבות. בפרוטוקול זה אנו המתאר טכניקה לנתח, תרבות transfect נוירונים בהיפוקמפוס העכבר עובריים קליפת המוח. Transfection מושגת על ידי electroporating דנ&quot;א לתוך הנוירונים לפני ציפוי באמצעות nucleofection. פרוטוקול זה יש את היתרון של להביע חלבונים היתוך fluorescently-tagged מוקדם בהתפתחות (~ 4-8hrs לאחר ציפוי) כדי ללמוד את הדינמיקה ואת התפקוד של החלבונים במהלך תוצאה, האקסון הקיטוב הסתעפות. גילינו גם כי זה transfection יחיד לפני ציפוי שומרת fluorescently-tagged חלבון ביטוי היתוך ברמות המתאימות הדמיה במהלך חייו של נוירון (&gt; 2 חודשים בתרבות). לפיכך, מתודולוגיה זו שימושית ללימוד לוקליזציה חלבון ותפקוד בכל התפתחות מערכת העצבים המרכזית, עם הפרעה קטנה או לא של תפקוד עצבי.

Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons at JoVE.com

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לנתח, transfect דרך electroporation ועכבר תרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח. לטווח קצר תרבויות ניתן להשתמש ללימודי תולדה של האקסון והדרכה, ואילו לטווח ארוך תרבויות יכול לשמש מחקרים synaptogenesis ניתוח בעמוד השדרה הדנדריטים.

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

nucleofection-primary-culture-embryonic-mouse-hippocampal-cortical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.3K Views.  University of Wisconsin-Madison. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לנתח, transfect דרך electroporation ועכבר תרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח. לטווח קצר תרבויות ניתן להשתמש ללימודי תולדה של האקסון והדרכה, ואילו לטווח ארוך תרבויות יכול לשמש מחקרים synaptogenesis ניתוח בעמוד השדרה הדנדריטים.

Video: Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

בהיפוקמפוס ראשי בצפיפות נמוכה תרבות Neuron

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...