Tüm işlemler, Wisconsin Komitesi Hayvan Bakım Üniversitesi tarafından onaylanan ve NIH kurallar ile uyumlu idi. Biz onu Nucleofector cihazın cömert kullanımı için Dr. Katherine Kalil teşekkür ederim. Biz, protokol hakkında yorum yapmak için Dent laboratuvar üyeleri de teşekkür ederim. Bu çalışma, hibe NIH R01-NS064014 Dana Vakfı ve Whitehall Vakfı EWD için tarafından desteklenen Christopher Viesselmann, Jason Ballweg ve Derek Lumbard bu kağıt eşit katkıda bulunmuştur.

1. Lameller ve Odalar hazırlanması <ol><li> Temiz lamelleri ve odaların hazırlanması, sağlıklı kültürler için esastır. Kısayollar bu adımların herhangi alınmamalıdır. </li><li> Gecede özel bir cam kavanoz ya da beher konsantre nitrik asit (HNO3) - lamelleri (Carolina Yardımcısı Marka 12mm veya 22mm yuvarlak, Alman cam) yıkayın. </li><li> Lamelleri çıkarın ve nitrik asit (5-7x) deiyonize su ile iyice yıkayın. </li><li> Laminer akış başlığı veya biyogüvenlik kabini lamelleri ve kuru ayırın. Kuru, 30 dakika UV ışık ile sterilize edin. Lamelleri sterilize depolama için steril bir petri kutularının içine yerleştirin. 12mm lamelleri kaplama nöronlar doğrudan steril bir 35mm çanak lamelleri yeri ve Bölüm 2 geçin. </li><li> Görüntüleme odaları, 15mm delik 35mm petri kutularının altında bir bütün çapak kaldırmak delme ve parafin ve vazelin 3:1 karışımı ile temizlenmelidir lamelleri takılarak tarafından inşa edilmiştir. </li><li> Parafin / vazelin karışımı kaynayan su banyosu içinde konik bir tüp içinde eritin. Küçük bir boya fırçası ve 15mm delik etrafında çanak alt kat kullanın. Parafin / vazelin karışımı karıştırarak ayrı olarak tutmak için emin olun. Bu genellikle yemekler inkübatör yerleştirilir lamel dekolmanı, viskoz olacak vazelin daha yüksek bir konsantrasyon, birlikte yapıştırılmış odaları sonuçlanır. Kalan parafin / vazelin oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> Düz bir tepsi üzerine ters çanak aşağı yerleştirin ve üzerine lamel deliğe yerleştirin. Isı 80 ° C fırında parafin karışımı eriyene kadar (~ 10 dakika). Düz bir yüzeye yemekleri çıkarın ve parafin karışımı ayarlamanıza izin. </li><li> Bulaşıkları ters çevirin ve UV ışığı ile kapakları ve odalarının dipleri içi hem de sterilize edin. </li><li> Kat lamelleri veya odaları 1.0mg/mL bir saat borat tamponu (pH 8.5, 0.1M sodyum borat) Poly-d-lisin (30kDa) ile cam bölgeleri. 3-5 kez bol miktarda doku kültürü notu deiyonize su ile durulayın. Borat tamponu tüm izlerini silmek için emin olun. Kuru ve hemen veya daha sonra kullanmak üzere saklayın odaları / lamelleri kullanabilirsiniz. Biz genellikle, bir ay içinde hazırlık temizlenir lamelleri kullanın. </li></ol> 2. Nöronal Diseksiyon ve Kültür Orta hazırlanması <ol><li> Diseksiyon orta (DM), 10x HBSS ve 100X Hepes uygun miktarlarda doku kültürü sınıf su ekleyerek hazırlayın. 4 ° C saklayınız Diseksiyonu sırasında buz üzerinde tutun. </li><li> Diseksiyonu bir gün önce, kaplama, orta (PM) ve serum serbest orta (SFM) hazırlar. PM Neurobasal Orta, B27 takviyesi, 2 mM glutamin,% 0.3 glikoz, 37.5 mM NaCl ve% 5 fetal sığır serumu (FBS) oluşur. SFM Neurobasal Orta, B27 takviyesi, 2 mM glutamin,% 0.3 glikoz ve 37.5 mM NaCl oluşur. </li><li> Kap ile bir gecede inkübatör biraz aralık orta equilibrates sıcaklık ve CO 2 içeriği bu sadece bir doku kültürü diseksiyon ve mağaza için yeterli olun. Biz ekstra glikoz ve NaCl ile yaklaşık 310mOsm osmolalitesi artırmak. Kültürler daha fizyolojik osmolalitesi (Neurobasal osmolalitesi genellikle 205-245mOsm) daha iyi bulabilirsiniz. </li></ol> 3. Uzun vadeli Kültürler Kortikal Glial Besleyici Layer Hazırlık <ol><li> Uzun vadeli kültürleri hazırlanan edilecekse, kortikal ve hipokampal diseksiyonları devam protokol 2-3 hafta önce bu bölümü gerçekleştirin. </li><li> MEM ile orta glial (GM),% ​​0.3 glukoz, penisilin / streptomisin ve% 10 at serumu hazırlayın. </li><li> 5 dakika buz üzerinde soğutma P1-P3 fare yavrularının Euthanize. % 70 etanol ile buz ve sprey her yavru çıkarın. Makas ile hızlı bir şekilde işten çıkarmak. Soğuk DM (adım 2.1) içeren bir çanak tüm beyin çıkarın. </li><li> Iki serebral hemisferlerin ve meninks çıkarın. Vergi neokorteks ve herhangi bir ortam içeren yeni bir çanak kaldırmak. Toplam 4 beyinleri korteks hazırlayın. </li><li> Mümkün olduğunca iyi, temiz, steril bir jiletle korteks Kıyma ve soğuk DM 12 ml içeren 50 ml konik tüp plastik bir pipet ile doğranmış doku kaldırmak. Son konsantrasyonları için sırasıyla% 0.25 &#39;lik (1.5 mL) ve% 0,1 (1,5 ml), tripsin ve DNaz ekleyin. Aralıklı dönen 10 dakika süreyle 37 ° C&#39;lik su banyosunda inkübe edin. </li><li> Kortikal doku içeren tüp çıkarın ve doku kültürü kaputu içine getirmeden önce% 70 etanol ile iyice temizleyin. 10 ml pipet ile pipetleyin kortikal doku yukarı ve aşağı yaklaşık 10-15 kat kadar veya en parçaları kaybolur. </li><li> Aralıklı dönen başka bir 10 dakika boyunca bir su banyosunda 37 ° C tüp dönün. </li><li> % 70 etanol ile tüp iyice temizleyin ve doku kültürü kaputu geri getirmek. 5 m ile pipetleyin kortikal doku yukarı ve aşağıL pipet yaklaşık 10-15 kat kadar veya parçaları kaybolur. </li><li> 15 ml sıcak GM ve 10 dakika 200xg (1000rpm) santrifüj ekleyin. </li><li> Süpernatant atın, 20 ml taze GM pelet hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve bir hemasitometre ile sayar. GM 75cm 2 şişesi ortalama 15 ml Plaka 5-7.5x10 6 hücre. </li><li> Bir gün ve her kültür sonraki 2-3 gün sonra, elinizi karşı balon vurma gevşek hücreleri yerinden. Herhangi bir yerinden hücreleri ile birlikte orta çıkarın ve 15 ml taze GM ile değiştirin. </li><li> Yaklaşık% 70-100 konfluent glia, matara büyüme 1-2 hafta sonra hasat edilebilir. Glia ile kaplanmış bireysel lamelleri hazırlamak için küçük bir boya fırçası ile bir üçgen desen, yer 6 nitrik asit, 3 nokta her lamel üzerine parafin / vazelin 3:1 karışımı temizlenir ve 10cm çanak 25mm yuvarlak lamelleri steril ve yer . UV ışık ile 30 dakika süreyle açık yemekleri davranın. Kat lamelleri 0.1 mg / ml borat tamponu Poly-d-lisin (30kDa), bir saat sonra (3-5x) steril doku kültürü notu deiyonize su ile iyice yıkayın ve kurumaya bırakın. </li><li> Inkübatör glial içeren şişeyi çıkarın, orta atmak ve önceden ısıtılmış tripsin / EDTA çözeltisi 5 ml ile durulayın. Tripsin / EDTA çözeltisi şişeden çıkarın ve balonun içine taze önceden ısıtılmış tripsin / EDTA 3 mL pipetle. Az 1 dakika süreyle 37 ° C trypsinization durdurmak için 5 ml GM eklemeden önce şişeyi inkübe edin. </li><li> 10-15 kez pipetleme tekrarlanan balon glia çıkarın ve sonra 15 ml konik tüp medya transfer. 8 dakika 200xg (1000rpm) Santrifüj. Süpernatantı ve lamelleri içeren 10cm çanak başına GM 12.5 ml 10 ml GM, sayısı hücreleri, ve plaka 5x10 5 hücre eklemek. </li><li> Taze önceden ısıtılmış GM 2-3 günde bir orta Alım Satım. Nöron diseksiyonu bir gün önce, GM kaldırmak ve SFM (bölüm 2.2) ile değiştirin. Kortikal ve hipokampal kültürleri sel adım 4.12 Bu glial klimalı SFM kullanın. </li></ol> 4. Kortikal ve / veya Hipokampal Diseksiyon ve Elektroporasyon <ol><li> Nucleofection çözümleri (Lonza) uygun miktarlarda çıkarın, diseksiyon başlamadan önce, birleştirmek ve oda sıcaklığına kadar sıcak. Kombine edildiğinde Nucleofection çözüm sınırlı bir ömrü olduğundan, biz sadece her hazırlığı (transfeksiyon başına 100 mcL) için gerekli miktarı birleştirir. </li><li> CO 2 (fiş gün E0.5) E15.5 hamile bir fare Euthanize ve 10cm petri rahim kaldırmak. Soğuk DM (bölüm 2.1) fetus ve başını kesmek çıkarın. </li><li> Soğuk DM ayrı bir kapta içine tüm beyin çıkarın ve bükülmüş bir tungsten iğne ile, hem de neocortices kaldırmak. Soğuk DM yeni çanak içine microforceps ve yer korteks meninksler çıkarın. Küçük bir iris veya Wecker makas, soğuk DM 1.0 ml ile dolu bir 1.5 ml Eppendorf tüp korteks ve hipokampus ve yer çıkarın. Bu tüp buz tutun. </li><li> Tüm korteks veya hippocampi diseksiyon sonra, 20 dakika boyunca 37 ° C inkübatör doku ve yer tüp içeren Eppendorf tüp% 2.5 tripsin 110 mcL ekleyin. </li><li> Supernatant ve yıkama korteks veya hippocampi yavaşça tersine Eppendorf tüp ile 1,0 mL PM (bölüm 2.2) ile çıkarın. PM 1 ml tüp içinde bırakarak, yıkama iki kez tekrarlayın. </li><li> P1000 bir pipet yardımıyla parçaları 15 kez Karışım ve Eppendorf tüp kalmasını parçaları bırakarak, 4 mL PM içeren yeni bir 15 ml konik tüp / supernatant hücreleri çıkarmak. </li><li> 7 dakika fren off 20xg (350rpm) 15 ml tüp Spin. Süpernatantı atın ve her transfeksiyon için önceden karıştırılmış, oda sıcaklığında nucleofection solüsyonu (Lonza) 100 mcL ekleyin. P1000 pipet yukarı ve aşağı yumuşak bir hareket ile 5 kez Karışım. </li><li> Her yeni Eppendorf tüp nucleofection çözüm / hücre karışımı 100 mcL çıkarın ve uygun miktarda DNA ekleyin. Uzun vadeli kültürleri için DNA transfeksiyon ortalama 1-2μg kullanmak. Ancak, bu etiketler kültür küçük bir nöron &lt;% 10 oranı. Biz genellikle kısa süreli kültür için daha yüksek transfeksiyon verimliliği istiyorsanız transfeksiyon başına DNA 5-10μg kullanabilirsiniz. Iki farklı plazmid transfecting 40μg DNA toplam kadar kullandık. Plazmidler mcL / 1μg TE tampon saklanır. </li><li> Hücre süspansiyon / DNA küvet (Lonza) ekleyin ve Program O-005 (Fare MSS nöronlar) kullanarak Nucleofector (Lonza) hücrelerin electroporate. </li><li> Hızlı çalışma, küvet, önceden ısıtılmış ve dengelenir PM 500 mcL ekleyin ve çözüm / yeni bir 1.5 ml Eppendorf tüp hücreleri çıkarmak. Her transfeksiyon hacmi 1,0 mL getirmek için yeterli. Uzun vadeli kültürlere genç kültürleri, ya da 5-10x10 3 hücre / cm 2 için 3-5x10 3 hücre / cm 2 hemasitometre ve plaka ile hücre sayımı &lt;/ P&gt; <li> Kısa vadeli kültürleri, sel ısındı, 2.0 mL, kaplama bir saat sonra CO 2-dengelenmiş SFM ile 35mm kültür yemekleri. Lamelleri kullanarak, bir buçuk PM kaldırmak ve SFM ile değiştirin, daha sonra iki kez daha tekrarlayın. Ya görüntüleme odaları sel ya da çok düşük serum içeriği (&lt;% 0.5) lamelleri yıkama sonuçlarını. Kısa vadeli kültürler glial besleyici bir tabaka ile kültür olması gerekmez ve yeniden beslenen gerekmez. </li><li> Uzun vadeli kültürleri için, parafin / vazelin üç nokta içeren bir glia kaplı lamel kaldırmak ve 35mm çanak 15mm delik, bir saat sonra ilk kaplama üzerine ters. İki mililitre glial çanak klimalı SFM sonra görüntüleme odasına eklenir. Uzun vadeli kültürleri beslemek için, her 2-3 günde bir SFM üçte birini kaldırmak ve taze, önceden ısıtılmış ve CO 2-dengelenmiş SFM ile değiştirin . </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Hipokampal nöronlar yaşayan temsilcisi hipokampal nöron gelişimi izleyen evrelerini yaşıyor. Eşleştirilmiş görüntüleri diferansiyel paraziti kontrastlı görüntü ve karşılık gelen bir floresan mikrografı olarak gösterilir. Bu hücrelerin her biri pCAX vektörler EGFP tubulin ve DsRed2 transfekte olmuştur. Sahne 1 (1DIV), Aşama 2 (1DIV) 3 (2DIV), Sahne, Sahne 4 (11DIV) ve Sahne 5 (32DIV): nöronlar in vitro olarak aşağıdaki gün (DIV) görüntülenmiştir. Ölçek çubuğu 20μm.

<ol>
	<li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.">Chapter 13.</a> Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches.">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li><li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton.">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li><li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation.">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li><li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines.">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li><li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+Ena/VASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1.">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li><li>Meberg, P. J., Miller, M. W., Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7.">Chapter 7.</a> Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , 112-129 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection.">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li></ol>

Bu protokol, sıçan nöronlar 1,2 kullanan Banker protokolü, bir değişiklik olarak kültür embriyonik hipokampal ve kortikal fare nöronları için geliştirilmiştir . Biz de 3,4,5,6,7 olarak kültür fare ve hamsteri nöronlar için bu protokolü kullanılır. Bu protokol, hem hipokampal ve neokortikal nöronlar için eşit derecede iyi çalışır ve Meberg ve Miller 8 tarafından yayınlanan bir protokol benzer . Genel olarak, iyi karakterize edilmiş ve daha oturmuş bir model sistem çünkü biz uzun vadeli bir kültür hipokampal nöronlar. Dahası, neokorteks daha nöronların daha homojen bir nüfus bulunma olasılığı vardır. Ancak, aynı zamanda hayatta kalma ve benzer ayırt (yayınlanmamış veri) neokortikal nöronların bu protokolü kullanarak kültür. Biz kısa vadeli kültürü için rutin neokortikal ve hipokampal nöronlar kullanın. Neokorteks diseksiyonu da Batı Örneğin, blot için malzeme daha iyi bir seçim yapar hipokampal diseksiyon (hippocampi çifti başına 2.5x10 5 nöronlar) göre önemli ölçüde daha fazla nöron (korteks çifti başına 1.5x10 6 nöronlar) sonuçlanır. Herhangi bir birincil kültürü ile gibi, hayvanın ölüm hücreleri kaplama için gereken zamanı en aza indirmek için çok önemlidir. Genellikle, diseksiyon ve kaplama sürekli hızlı olmak için 10-20 diseksiyonları alacaktır. Ayrıca, nucleofection tampon bırakılırsa nöronların canlılığı hızla azalır Lonza Nucleofector çalışırken, elektroporasyon prosedürü sırasında hızlı çalışması için çok önemlidir. Toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) görüntüleme ile yapılır. Mikroskopi Bu tür lamel ötesinde görüntüleme birkaç yüz nanometre sadece yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, sık sık resim, aksonal büyüme konisi ve dendritik dikenler, lamel doğrudan uyulması nöronlar alanlarında ihtiyaç duyduğu. Böylece, uzun vadeli kültür glial besleme gerektiren düşük yoğunluklu kültürleri kullanın. Biz uzun vadeli kültürler için, glial besleyici katmanlar olmadan, (2x10 4 hücre / cm 2) yüksek yoğunluklu kültürler kullanılan ve az beslenme ile birlikte çok iyi hayatta. Geniş alan mikroskobu veya konfokal mikroskobu ile kolaylıkla tespit edilebilir rağmen, bu nöronların dendritik dikenler, kimi zaman çok uzak substrat TIRFM görüntü. Çalışmaların çoğunda kaplama önce nöronların transfect ve kültürde üç ay için floresan etiketli proteinlerin görüntülü var. Bu uzun vadeli bir ifade floresan etiketli proteinlerin DNA (1 2μg) düşük konsantrasyonlarda kullanılarak nöronların aşırı ekspresyonu eserler üreten değil bize güven veriyor. Ancak, bu yordamı da, yüksek miktarda DNA kullanılması halinde (10-20μg) protein aşırı ekspresyonu incelemek için kullanılan olabilir. Biz de DsRed2 ya da tek başına EGFP nöron sitoplazma etiketi rağmen, nöronların transfect için kullandığınız plazmid genellikle EGFP veya mCherry füzyon proteinleri içeren. Bu vektörlerin sayısı elektroporasyon tekniği ile çalışır. Biz CMV geliştirici ve β-globin ile β-aktin organizatörü içeren plazmid tercih poli-ifade nispeten yüksek düzeylerde nedeniyle kuyruk (pCAGGs veya pCAX plazmid) 9, ve nöronlar tarafından iyi tolere olduğu gerçeği hem kısa ve uzun vadeli bir kültür. Genellikle, proteinler, kaplama yaklaşık 4 saat içinde ifade ve 10-24 saat 10 içinde görüntüleme için yeterli düzeyde ulaşmak için başlar . Biz kısa vadeli kültürlerde CMV organizatörü odaklı plazmid başarıyla kullanılır, ama uzun vadeli kültür nöronları öldürmeye aşırı ekspresyonu yüksek düzeyde neden olabilir bulduk. Bununla birlikte, düşük yoğunluklu kültürlerin glial klima, yüksek yoğunluklu (non-glial beslenen) kültürler karşılaştırıldığında, CMV organizatörü tahrik plazmid transfekte nöronların hayatta yardımcı olduğunu bulduk.

* -80 Saklayın ° C -20 ° C&#39;de saklanabilir ki çoğu reaktif. -80 Saklanması ° C, onların raf ömrünü ve biraz daha tutarlı kültürler sonuçlar uzatır.

nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons

Kortikal ve hipokampal nöronlar, merkezi sinir sistemi (MSS) nöronal kutuplaşma, akson / dendrit akıbet ve sinaps oluşumu ve işlevi incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kültür, bu nöronların bir avantajı çok düşük yoğunluklarda iki boyutlu bir substrat üzerinde kolayca, farklı akson ve dendritler oluşturan, kutuplanma. Bu özellik, nöronal gelişimi birçok yönlerini belirlemek için son derece yararlı yaptı. Ayrıca, bu nöronlar glial klima sağlayarak, fonksiyonel sinaptik bağlantıları kurma ve kültür birkaç ay kalan geliştirmeye devam edecektir. Bu protokolde incelemek için teknik, kültür ve transfect embriyonik fare hipokampal ve kortikal nöronların anahat. Transfeksiyon nucleofection yoluyla kaplama önce nöronların içine DNA electroporating tarafından gerçekleştirilir. Bu protokol geliştirme (~ 4-8 saat sonra kaplama) polarizasyon, akson üremeyi ve dallanma sırasında proteinlerin dinamikleri ve fonksiyon çalışma erken floresan etiketli füzyon proteinleri ifade avantajı vardır. Biz de önce bu tek transfeksiyon kaplama nöron (kültür&gt; 2 ay) ömür boyu görüntüleme için uygun seviyelerde floresan etiketli füzyon proteini ifade koruduğunu keşfetti. Böylece, bu metodoloji nöronal fonksiyonu çok az veya hiç kesinti ile merkezi sinir sistemi gelişimi boyunca protein yerelleştirme ve fonksiyon çalışmak için yararlıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons at JoVE.com

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Bu protokol, elektroporasyon ve kültür fare ve kortikal hipokampal nöronlar aracılığıyla transfect incelemek için gerekli adımları özetliyor. Kısa vadeli kültürleri, uzun vadeli kültürler sinaptogenez ve dendritik omurga analiz çalışmaları için kullanılabilir akson akıbet ve rehberlik çalışmaları için kullanılıyor olabilir.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

nucleofection-primary-culture-embryonic-mouse-hippocampal-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.3K Görüntüleme.  University of Wisconsin-Madison. Bu protokol, elektroporasyon ve kültür fare ve kortikal hipokampal nöronlar aracılığıyla transfect incelemek için gerekli adımları özetliyor. Kısa vadeli kültürleri, uzun vadeli kültürler sinaptogenez ve dendritik omurga analiz çalışmaları için kullanılabilir akson akıbet ve rehberlik çalışmaları için kullanılıyor olabilir.

Video: Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

Fare Embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve Kültür

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...