Todos los procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Wisconsin Comité de Cuidado de Animales y estaban en conformidad con las directrices del NIH. Agradecemos a la Dra. Katherine Kalil para el uso generoso de su dispositivo Nucleofector. También queremos agradecer a los miembros del laboratorio de Dent para comentarios sobre el protocolo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01-NS064014, Fundación Dana y la Fundación de Whitehall EWD Christopher Viesselmann, Ballweg Jason y Derek Lumbard contribuyeron igualmente a este trabajo.

1. Preparación de cubreobjetos y Cámaras <ol><li> Preparación de cubreobjetos limpio y las cámaras es esencial para las culturas saludables. Los accesos directos no se debe tomar en cualquiera de estos pasos. </li><li> Lave el cubreobjetos (12 mm o 22 mm redondo, vidrio alemán - Carolina Marca auxiliar) durante la noche en ácido nítrico concentrado (HNO3) en un frasco de vidrio dedicado o un vaso. </li><li> Quitar los cubreobjetos de ácido nítrico y lavar ampliamente (5-7x) en agua destilada. </li><li> Separar el cubreobjetos y seca en una campana de flujo laminar o gabinete de bioseguridad. Una vez seco, esterilizarlos con luz UV durante 30 minutos. Lugar esterilizados cubreobjetos en placas de Petri estéril para su almacenamiento. Si las neuronas chapado en cubreobjetos de 12 mm directamente lugar cubreobjetos en una placa de 35 mm estériles y proceder a la Sección 2. </li><li> Cámaras de imágenes están construidas mediante la perforación de un agujero de 15 mm en la parte inferior de 35 mm placas de Petri (eliminar todas las rebabas) y adjuntar los cubreobjetos de limpiar con una mezcla de 3:1 de parafina y vaselina. </li><li> Derrita la parafina / mezcla de vaselina en un tubo cónico en un baño de agua hirviendo. Utilice un pincel pequeño y cubrir la parte inferior de la placa alrededor del agujero de 15 mm. Asegúrese de seguir revolviendo la parafina / mezcla de vaselina, ya que se separarán. Esto usualmente resulta en cámaras pegadas entre sí con una mayor concentración de la jalea de petróleo, que se convertirá en viscosa cuando los platos se colocan en la incubadora, lo que resulta en el desprendimiento de cubreobjetos. El resto de parafina / vaselina se puede almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Coloque el plato boca abajo sobre una bandeja plana y colocar el cubreobjetos sobre el agujero. Calor en el horno 80 ° C hasta que la mezcla de parafina se funde (~ 10 minutos). Quite los platos sobre una superficie plana y dejar que el conjunto de la mezcla de parafina. </li><li> A su vez los platos una y esterilizar tanto el interior de las tapas y los fondos de las cámaras con luz UV. </li><li> Cubreobjetos de abrigo o regiones de vidrio de las cámaras con 1.0mg/mL poli-D-lisina (30kDa) en tampón de borato (borato de sodio 0.1 M, pH 8,5) durante una hora. Enjuague 3-5 veces con abundante cantidad de agua de grado de cultivo de tejidos desionizada. Asegúrese de eliminar todos los rastros de tampón borato. Seco y utilizar inmediatamente o almacenar cámaras / cubreobjetos para su uso posterior. Por lo general, el uso cubreobjetos limpiar el plazo de un mes de preparación. </li></ol> 2. Preparación de la disección neuronal y medio de cultivo <ol><li> Preparar el medio de la disección (DM) mediante la adición de cantidades adecuadas de HBSS 10x y 100x HEPES al agua de grado de cultivo de tejidos. Almacenar a 4 ° C. Mantener en hielo durante la disección. </li><li> El día antes de la disección de preparar el medio de chapado (PM) y el medio libre de suero (SFM). PM se compone de medio Neurobasal, suplemento de B27, 2 mM de glutamina, un 0,3% de glucosa, 37,5 mM de NaCl y 5% de suero fetal bovino (SFB). SFM se compone de medio Neurobasal, suplemento de B27, 2 mM de glutamina, un 0,3% de glucosa y 37,5 mM NaCl. </li><li> Haz sólo lo suficiente para la disección y guardar en un cultivo de tejido durante la noche con la tapa de la incubadora entreabierta para que la temperatura y el contenido de CO 2 del medio se equilibra. Añadimos la glucosa extra y aumentar la osmolaridad de aproximadamente 310mOsm con NaCl. Nos encontramos con las culturas de hacerlo mejor en una osmolaridad más fisiológica (osmolalidad Neurobasal suele ser de 205 245mOsm). </li></ol> 3. Cortical alimentador gliales Preparación de capas de los cultivos a largo plazo <ol><li> Si a largo plazo, las culturas se han de preparar, realizar esta parte del protocolo de dos a tres semanas antes de continuar con las disecciones cortical o del hipocampo. </li><li> Preparar el medio gliales (GM) con el MEM, el 0,3% de glucosa, penicilina / estreptomicina y 10% suero de caballo. </li><li> Eutanasia P1-P3 crías de ratón de un enfriamiento en hielo durante 5 minutos. Eliminar a las crías en el hielo y gas con 70% de etanol. Rápidamente decapitar con unas tijeras. Quite todo el cerebro a un plato que contiene frío DM (paso 2.1). </li><li> Retire los dos hemisferios cerebrales y las meninges. Impuestos Especiales de la corteza cerebral y trasladarlo a un nuevo plato que no contiene los medios de comunicación. Prepare las cortezas de cuatro cerebros total. </li><li> Picar la corteza con un cuchillo limpio, maquinilla de afeitar estéril tan fina como sea posible y eliminar el tejido picado con una pipeta de plástico a un tubo cónico de 50 ml que contienen 12 ml de frío DM. Añadir la tripsina y DNasa a la concentración final de 0,25% (1,5 ml) y 0,1% (1,5 ml), respectivamente. Incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 10 minutos con agitación intermitente. </li><li> Retire el tubo que contiene el tejido cortical y limpiar a fondo con etanol al 70% antes de la puesta en el capó de cultivo de tejidos. Tejido cortical pipeta de arriba y abajo con una pipeta de 10 ml aproximadamente 10-15 horas, o hasta que la mayoría de los trozos de desaparecer. </li><li> Devuelva el tubo a 37 ° C en un baño de agua durante 10 minutos con intermitentes remolino. </li><li> Limpiar a fondo el tubo con etanol al 70% y traerlo de vuelta a la campana de cultivo de tejidos. Pipeta el tejido cortical de arriba a abajo con un 5 mL pipeta de aproximadamente 10-15 horas, o hasta que los trozos de desaparecer. </li><li> Agregar 15 ml de agua tibia GM y centrifugar a 200xg (1000 rpm) durante 10 minutos. </li><li> Desechar el sobrenadante, resuspender las células sedimentadas en 20 ml de agua dulce GM y contar con un hemocitómetro. Lámina 5-7.5x10 6 células en 15 ml de GM por 75 cm 2 matraz. </li><li> Después de un día y cada 2-3 días posteriores en la cultura, separar las células sueltas, golpeando el frasco contra su mano. Eliminar el medio junto con las células desalojados y reemplazar con 15 ml de agua dulce GM. </li><li> Glía se puede cosechar después de 1-2 semanas de crecimiento en los frascos, cuando están a punto 70-100% confluente. Para preparar cada cubreobjetos recubiertos con células gliales, lugar ácido nítrico 6 limpiar y esterilizar 25 mm cubreobjetos redondo en un plato de 10 cm, y el lugar 3 puntos de la mezcla de 3:1 de parafina / vaselina en cada portaobjetos en un patrón triangular con un pincel pequeño . El tratamiento de platos abiertos con luz UV durante 30 minutos. Cubra el cubreobjetos con 0,1 mg / ml de poli-D-lisina (30kDa) en tampón borato durante una hora, luego lave exhaustivamente (3 a 5 veces) con agua estéril de grado de cultivo de tejidos desionizada y dejar secar. </li><li> Retirar el frasco que contiene la glía de la incubadora, se elimina el medio y enjuague con 5 ml de pre-calentado tripsina / EDTA. Retire la solución de tripsina / EDTA en el matraz y pipeta de 3 ml de agua dulce precalentado tripsina / EDTA en el matraz. Incubar el matraz durante 1 minuto a 37 ° C antes de añadir 5 ml de GM para detener la tripsina. </li><li> Retire la glia del frasco por las reiteradas pipeteado 10-15 veces, y luego transferir los medios de comunicación a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 200xg (1000 rpm) durante 8 minutos. Eliminar el sobrenadante y agregar 10 ml de GM, cuentan las células, y la placa de 5x10 células 5 en 12,5 ml de GM por plato de 10 cm que contiene el cubreobjetos. </li><li> Intercambio con el medio fresco precalentado GM cada 2-3 días. El día antes de la disección de las neuronas, retire la GM y reemplazar con la ordenación forestal sostenible (sección 2.2). Utilice esta SFM gliales acondicionado en el paso 4.12, cuando las inundaciones cultivos corticales o del hipocampo. </li></ol> 4. Disección cortical y / o del hipocampo y la electroporación <ol><li> Eliminar la cantidad adecuada de soluciones nucleofection (Lonza), combinar, y la temperatura ambiente antes de comenzar la disección. Ya que la solución Nucleofection tiene una vida útil limitada cuando se combinan, sólo se combinan la cantidad necesaria para cada preparación (100 l por transfección). </li><li> La eutanasia a un ratón embarazadas en E15.5 con CO 2 (día de enchufe E0.5) y extraer el útero de una placa de Petri de 10 cm. Eliminar los fetos y decapitar al frío DM (sección 2.1). </li><li> Quite todo el cerebro en un plato aparte de frío DM y con una aguja de tungsteno dobladas, eliminar tanto neocortices. Quite la meninges con microforceps y cortezas lugar en nuevo plato frío de DM. Con una tijera pequeña iris o Wecker, quitar la corteza o el hipocampo y el lugar en un tubo Eppendorf de 1,5 ml lleno con 1,0 ml de frío DM. Mantenga este tubo en hielo. </li><li> Después de la disección de todas las cortezas o hipocampos, añadir 110 l de 2,5% de tripsina al tubo Eppendorf que contiene el tubo de tejido y colocarlo en una incubadora a 37 ° C durante 20 minutos. </li><li> Quitar la corteza sobrenadante y lavar o hipocampos con 1,0 mL PM (sección 2.2) suavemente invirtiendo el tubo Eppendorf. Repita el lavado dos veces, dejando 1 ml de la tarde en el tubo. </li><li> Triturar los trozos de 15 veces con una pipeta P1000, y eliminar las células sobrenadante / a un nuevo tubo de 15 mL cónico que contiene 4 ml de la tarde, dejando a los trozos que quedan en el tubo Eppendorf. </li><li> Girar el tubo de 15 ml en 20xg (350rpm) durante 7 minutos con el freno de apagado. Descartar el sobrenadante y añadir 100 ml de premezcla, la solución de sala de nucleofection temperatura (Lonza) para cada uno de transfección. Triturar 5 veces con un suave movimiento hacia arriba y abajo de la pipeta P1000. </li><li> Eliminar 100 L de la solución nucleofection / célula mezcla a cada nuevo tubo Eppendorf y añadir la cantidad apropiada de ADN. A largo plazo las culturas que utilizan generalmente 1-2μg de ADN por la transfección. Sin embargo, esta etiqueta sólo una pequeña proporción &lt;10% de las neuronas en la cultura. Por lo general, el uso de 5-10μg de DNA por transfección si desea una mayor eficiencia de transfección de la cultura a corto plazo. Hemos utilizado hasta un total de 40μg de ADN cuando la transfección con dos plásmidos diferentes. Los plásmidos son almacenados en buffer TE a 1 g / mL. </li><li> Añadir la suspensión de células / ADN a la cubeta (Lonza) y electroporar las células en el Nucleofector (Lonza), mediante el programa S-005 (sistema nervioso central del ratón neuronas). </li><li> Trabajando rápidamente, añadir 500 l de PM pre-calentado y equilibrada a la cubeta y remover la solución / células a un nuevo tubo Eppendorf de 1,5 ml. Añadir PM suficiente para reducir el volumen de cada transfección de 1,0 ml. Contar las células con un hemocitómetro y la placa en 3-5x10 3 células / cm 2 para los cultivos jóvenes, o 5-10x10 3 células / cm 2 para los cultivos a largo plazo. &lt;/ Li&gt; <li> A corto plazo las culturas, las inundaciones las placas de cultivo de 35 mm con 2,0 ml de calentado, CO 2-equilibrio SFM después de una hora de la siembra. Si se utiliza cubreobjetos, se elimina la mitad de la PM y reemplazarla con la ordenación forestal sostenible, y luego repetir dos veces más. Cualquiera de las inundaciones de las cámaras de imagen o el lavado de los resultados cubreobjetos en un contenido muy bajo en suero (&lt;0,5%). A corto plazo las culturas no necesitan ser cultivadas con una capa de alimentación gliales y no necesitan volver a ser alimentado. </li><li> De cultivos a largo plazo, eliminamos las células de un cubreobjetos cubiertos con tres puntos de parafina / vaselina e invertirlo en el agujero de 15 mm en la placa de 35 mm, una hora después de la siembra inicial. Dos mililitros de la ordenación forestal sostenible acondicionado en el plato gliales se añade a la cámara de imágenes. Para alimentar a los cultivos de largo plazo, se elimina un tercio de la ordenación forestal sostenible, cada 2-3 días y sustituirla por nueva, previamente calentada y CO 2-equilibrada ordenación forestal sostenible. </li></ol> 5. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Que viven las neuronas del hipocampo en las sucesivas etapas de desarrollo. Imágenes pareadas de representante vivo las neuronas del hipocampo se muestran tanto como una imagen de contraste de interferencia diferencial y una micrografía fluorescente correspondiente. Cada una de estas células ha sido transfectadas con EGFP-tubulina y DsRed2 en vectores pCAX. Las neuronas fueron estudiados en los próximos días in vitro (DIV): Etapa 1 (1DIV), nivel 2 (1DIV), Etapa 3 (2DIV), Etapa 4 (11DIV) y Etapa 5 (32DIV). Barra de escala es 20μm.

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	<li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.">Chapter 13.</a> Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches.">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li><li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton.">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li><li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation.">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li><li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines.">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li><li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+Ena/VASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1.">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li><li>Meberg, P. J., Miller, M. W., Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7.">Chapter 7.</a> Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , 112-129 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection.">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li></ol>

Este protocolo para el cultivo de neuronas de ratón embrionario del hipocampo y la corteza se desarrolló como una modificación del protocolo de Banker, que utiliza ratas 1,2 neuronas. Hemos utilizado este protocolo para el ratón y el cultivo de neuronas de hámster, así 3,4,5,6,7. Este protocolo funciona igualmente bien para las neuronas del hipocampo y el neocórtex tanto y es similar a un protocolo publicado por Meberg y Miller 8. En general, usamos las neuronas del hipocampo a largo plazo la cultura, ya que están bien caracterizados y un sistema de modelo más establecido. Además, es probable que contienen una población más homogénea de las neuronas de la neocorteza. Sin embargo, las neuronas neocortical cultivadas usando este protocolo también sobreviven y se diferencian de manera similar (datos no publicados). Nosotros usamos las neuronas del hipocampo y el neocórtex para el cultivo a corto plazo. La disección del neocórtex también da lugar a neuronas mucho más (1.5x10 6 neuronas por cada par de cortezas) que la disección del hipocampo (2.5x10 5 neuronas por cada par de hipocampo), que hace que sea una mejor elección de material para el Western Blot, por ejemplo. Como con cualquier otro cultivo primario, es esencial para minimizar el tiempo que se tarda desde la muerte del animal para el revestimiento de las células. Por lo general, se llevará a 20.10 disecciones para convertirse en rápido y consistente en la disección y de las planchas. Además, cuando se trabaja con la Nucleofector Lonza, es fundamental trabajar con rapidez durante el proceso de electroporación, como la viabilidad de las neuronas disminuye rápidamente si se dejan en la memoria nucleofection. Gran parte de nuestra imagen se lleva a cabo con un total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM). Este tipo de microscopio es sólo capaz de obtener imágenes de varios cientos de nanómetros más allá de los cubreobjetos. Por lo tanto, las áreas de las neuronas que con frecuencia la imagen, el cono de crecimiento axonal y las espinas dendríticas, es necesario adherirse directamente a la cubreobjetos. Por lo tanto, utilizar cultivos de baja densidad que requieren alimentación gliales a largo plazo de la cultura. Hemos utilizado la más alta densidad de cultivos (&gt; 2x10 4 células / cm 2), sin capas de alimentación gliales de cultivos a largo plazo y encontró que sobreviven muy bien con la alimentación poco. Sin embargo, las espinas dendríticas de las neuronas son a menudo muy lejos de la imagen en el sustrato de TIRFM, a pesar de que se puede detectar fácilmente con un amplio campo de la microscopia o microscopía confocal. En la mayoría de nuestros estudios nos transfectar neuronas de las placas, y se han fotografiado las proteínas fluorescente marcada con un máximo de tres meses en la cultura. Esta expresión a largo plazo de las proteínas marcadas con fluorescencia nos da confianza en que mediante el uso de bajas concentraciones de ADN (1-2μg) no estamos produciendo artefactos sobreexpresión en las neuronas. Sin embargo, este procedimiento también se puede utilizar para estudiar si la sobreexpresión de las proteínas de grandes cantidades de ADN se utilizan (10-20 microgramos). Los plásmidos que se utiliza para transfectar neuronas suelen contener proteínas EGFP o mCherry de fusión, aunque también marca el citoplasma neuronal con DsRed2 o EGFP solo. Esta técnica de electroporación trabaja bien con un número de vectores. Nosotros preferimos los plásmidos que contienen un promotor β-actina con un potenciador de CMV y β-globina cola poli-A (pCAGGs o plásmidos pCAX) 9, debido a los relativamente altos niveles de expresión, y el hecho de que son bien tolerados por las neuronas tanto en la cultura de corto y largo plazo. En general, las proteínas comienzan a expresarse dentro de unas 4 horas de la siembra y alcanzar niveles suficientes para obtener imágenes de un plazo de 10-24h 10. Hemos utilizado con éxito por CMV impulsada por el promotor de plásmidos en corto plazo, las culturas, pero han encontrado que pueden provocar altos niveles de sobre-expresión que matan a las neuronas en el largo plazo la cultura. Sin embargo, hemos encontrado que el condicionamiento gliales de cultivos de baja densidad ayuda a la supervivencia de las neuronas transfectadas con plásmidos promotor CMV impulsada, en comparación con una mayor densidad (no gliales Fed) culturas.

* La mayoría de los reactivos que se almacenan a -80 ° C se puede almacenar a -20 ° C también. El almacenamiento a -80 ° C se alarga su vida útil y los resultados en las culturas un poco más consistente.

nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons

Las neuronas del hipocampo y la corteza se han utilizado ampliamente para estudiar el sistema nervioso central (SNC) la polarización neuronal, axón / dendrita y la formación de sinapsis y la función. Una de las ventajas del cultivo de estas neuronas es que fácilmente se polarizan, la formación de los axones y las dendritas distintivo, sobre un sustrato de dos dimensiones en densidades muy bajas. Esta propiedad les ha hecho extremadamente útil para la determinación de muchos aspectos del desarrollo neuronal. Además, al proporcionar acondicionado gliales de estas neuronas van a seguir para desarrollar, formar conexiones sinápticas funcionales y sobrevivir durante varios meses en la cultura. En este protocolo se plantean una técnica de disecar, la cultura y transfectar neuronas embrionarias de ratón del hipocampo y la corteza. Transfección se lleva a cabo electroporating ADN en las neuronas de las placas, a través de nucleofection. Este protocolo tiene la ventaja de expresar la fluorescencia de etiquetado proteínas de fusión en el desarrollo temprano (~ 4 8 horas después de la siembra) para estudiar la dinámica y función de las proteínas durante el axón de polarización, y la ramificación. También hemos descubierto que la transfección de las placas, solo mantiene la expresión fluorescente marcada con la proteína de fusión en los niveles apropiados para la imagen durante toda la vida de la neurona (&gt; 2 meses en la cultura). Por lo tanto, esta metodología es útil para el estudio de la localización y función de proteínas durante el desarrollo del SNC, con poco o ningún trastorno de la función neuronal.

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Este protocolo describe los pasos necesarios para analizar, a través de la electroporación y transfectar neuronas del hipocampo del ratón y la cultura cortical. Corto plazo, las culturas pueden ser utilizados para los estudios del axón y la orientación, mientras que a largo plazo las culturas pueden ser utilizados para estudios de la sinaptogénesis y el análisis espina dendrítica.

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

nucleofection-primary-culture-embryonic-mouse-hippocampal-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.3K vistas.  University of Wisconsin-Madison. Este protocolo describe los pasos necesarios para analizar, a través de la electroporación y transfectar neuronas del hipocampo del ratón y la cultura cortical. Corto plazo, las culturas pueden ser utilizados para los estudios del axón y la orientación, mientras que a largo plazo las culturas pueden ser utilizados para estudios de la sinaptogénesis y el análisis espina dendrítica.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

Lectina basado en Aislamiento y cultivo de motoneuronas embrionarias de ratón

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar Co-cultivo de neuronas de rata primaria cortical y la glía

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Fosfato de Calcio La transfección de Primaria neuronas del hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Baja densidad primaria del hipocampo Neurona Cultura

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...