تعتمد الميتوكوندريا بشكل كبير على الجينوم النووي، على الرغم من وجود الحمض النووي الخاص بها. وبالتالي، يلزم وجود آلية استيراد عالية التنظيم. تساعد هذه الطريقة في دراسة العملية وكيف يمكن أن تتكيف مع المحفزات الخارجية.
هذه هي التقنية الكيميائية الحيوية الوحيدة المتاحة لتقييم استيراد البروتين كميا إلى المقصورات الفرعية المختلفة للميتوكوندريا. إن قابلية الميتوكوندريا للاستمرار متورطة في حالات مرضية مختلفة ، لذا فإن فهم كيفية تنظيم استيراد البروتين قد يساعد في المساهمة في اتباع نهج علاجية جديدة تستهدف الميتوكوندريا. هناك حاجة إلى عناية إضافية أثناء العزل لضمان بقاء وسلامة الميتوكوندريا.
من الضروري الفرم الشامل للأنسجة وإعادة تعليق جميع الكريات اللاحقة بلطف. سيكون عرض الإجراء هو آشلي أوليفيرا ، طالبة الدكتوراه في مختبري. لبدء عزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية، قم بإزالة الدهون والنسيج الضام من العضلات وفرم الأنسجة على زجاج ساعة مبرد مسبقا حتى يصبح ملاطا متجانسا.
ضع الأنسجة المفرومة في أنبوب طرد مركزي بلاستيكي مبرد مسبقا سعة 50 ملليلتر وسجل الوزن الدقيق. ثم ، قم بتخفيف الأنسجة المفرومة عشرة أضعاف باستخدام المخزن المؤقت 1 الذي يحتوي على ATP. استخدم مجانس ثنائي الشفرة بقطر ثمانية ملليمترات لتجانس عينة العضلات عند خرج طاقة يبلغ 9.8 هرتز لمدة 10 ثوان، مما يضمن عدم بقاء أجزاء مرئية من العضلات.
بعد تدوير العينة عند 9000x G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، أعد تعليق الكريات بعناية في حوالي 95 ميكرولتر من وسط إعادة التعليق. قم بطرد العينة قبل التخلص من المادة الفائقة ، وأعد تعليق الكريات بلطف باستخدام ما يقرب من 180 ميكرولتر من وسط إعادة التعليق باستخدام ماصة P-200. للترجمة في المختبر، قم بإعداد ما يكفي من مزيج تفاعل الترجمة لتوفير 20 ميكرولتر لكل عينة من الميتوكوندريا لاستخدامها في تجربة الاستيراد ولمسار الترجمة.
ضع رد الفعل للحضانة عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 15 دقيقة من بدء تفاعل الترجمة، تم تحويل 90 ميكروغرام من الميتوكوندريا إلى أنابيب معقمة بحجم 1.5 ملليلتر ومرحلة ما قبل الحضانة عند 30 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في مجموعة جديدة من الأنابيب المعقمة سعة 1.5 ملليلتر ، اجمع 75 ميكروغرام من الميتوكوندريا مع 18 ميكرولتر من تفاعل الترجمة ، واحتضن الأنبوب عند 30 درجة مئوية للوقت المطلوب.
احتفظ بالحجم المتبقي من تفاعل الترجمة على الجليد. لإنهاء تفاعل الاستيراد بعد وقت الحضانة المناسب ، قم بإزالة الأنبوب من 30 درجة مئوية لوضعه على الجليد ، ثم انقل تفاعل الاستيراد بعناية أعلى الأنبوب باستخدام وسادة السكروز. جهاز الطرد المركزي للعينات باستخدام وسادة السكروز عند 17000x G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
باستخدام ماصة P-1000 ، قم بإزالة supernatant بعناية دون إزعاج الكريات. للاستيراد إلى الغشاء الخارجي ، قم بإجراء التفاعل باستخدام Tom40 ، وأعد تعليق الكريات في 50 ميكرولتر من كربونات الصوديوم 0.1 مولية طازجة ، واحتضنها على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بطرد العينة عند 14000x G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
بعد ذلك ، قم بإعداد عينات للرحلان الكهربائي SDS-PAGE كما هو موضح في المخطوطة. قم بإعداد ممر ترجمة التحكم عن طريق خلط ثلاثة ميكرولترات من تفاعل الترجمة المتبقي مع 37 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل وخمسة ميكرولترات من صبغة العينة. تغلي العينات لمدة خمس دقائق عند 95 درجة مئوية وتدور بلطف بسرعة منخفضة لتجنب تكوير الميتوكوندريا.
بعد تطبيق العينات على هلام SDS polyacrylamide ، قم بغلي الجل في 5٪ من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك ، أو TCA ، في غطاء الدخان لمدة خمس دقائق مع التحريك المستمر. ثم ضع الجل في ماء مقطر مزدوج على صفيحة دوارة لمدة دقيقة واحدة بمعدل 50 دورة في الدقيقة. اغسل الجل في 10 ملليمولار تريس على لوحة دوارة لمدة خمس دقائق بمعدل 50 دورة في الدقيقة.
لترسيب البروتين ، اغسل الجل بحجم كاف من حمض الساليسيتيك أحادي المول لتغطية الجل على صفيحة دوارة لمدة 30 دقيقة. لتجفيف الجل ، ضع ورقة كبيرة من ورق النشاف على السرير المسامي لمجفف الجل ، وورقة واحدة من منشفة ورقية في المنطقة التي سيتم فيها تطبيق الجل. ثم ، قطع 11 سم × 9 سم قطعة من ورق النشاف ووضع الورقة على منشفة ورقية.
استخدم قطعة ثانية من ورق النشاف 11 سم × 9 سم لإخراج الجل من الحاوية ووضع الجل بشكل مسطح فوق القطعة الأولى. ضع قطعة أكبر قليلا من البلاستيك على الجل ، مع ضمان عدم وجود تجاعيد أو فقاعات تحت الغلاف. ثم ضع الغطاء البلاستيكي لمجفف الجل فوق الجزء العلوي من الغلاف.
قم بتشغيل الفراغ. تأكد من أن الغطاء البلاستيكي قد شكل ختما عن طريق رفع زاوية الغطاء البلاستيكي وانتظار إعادة إغلاق الغطاء. أغلق مجفف الجل ليعمل لمدة 90 دقيقة، بدءا من 30 درجة مئوية ليصل إلى 80 درجة مئوية تدريجيا، ثم عد إلى 30 درجة مئوية في نهاية الجري.
لف الجل في الغلاف البلاستيكي المستخدم في عملية التجفيف. بمجرد الجفاف ، سوف يتصلب الجل ويشعر بنحافة الورق. ضع الجل المجفف في كاسيت مع فيلم فوسفوري في الأعلى.
قم بتعريض الفيلم لمدة 24 ساعة قبل تصور الجل باستخدام التصوير الشعاعي الذاتي مع أي جهاز تصوير مناسب قادر على التصوير الفوسفوري. ويبين التحليل التمثيلي المعدلات الطبيعية لاستيراد نازعة هيدروجيناز مالات، أو MDH، في الميتوكوندريا تحت الساركوليمية وبين المتوسطية، ومنتج الترجمة للسلائف MDH. أدت إضافة فالينومايسين إلى تثبيط استيراد بروتين MDH إلى مصفوفة الميتوكوندريا SS و IMF.
وبالمثل ، فإن المنظف Triton X يمنع استيراد MDH إلى كلا الكسرين الفرعيين بسبب ذوبان الغشاء الداخلي. وقد أجري تقدير استيراد البروتين لفترات زمنية متزايدة، وأوضحت البيانات المترتبة على ذلك أن الاستيراد عملية تعتمد على الوقت، وأن الميتوكوندريا SS و IMF لها معدلات أو قدرات مختلفة للاستيراد. عندما تعرضت الفئران للتحفيز الكهربائي ، كان استيراد توم 40 إلى الغشاء الخارجي أعلى في العضلات من الحيوانات المحفزة بشكل مزمن مقارنة بالضوابط.
تم زيادة Ornithine transcarbamylase ، أو استيراد OCT ، في مصفوفة الميتوكوندريا في كل نقطة زمنية من الحضانة ، مما أدى إلى زيادة 1.4 مرة في الميتوكوندريا من العضلات المحفزة بشكل مزمن. ارتبط استيراد البروتين ارتباطا إيجابيا بمؤشر محتوى الميتوكوندريا وتم تقييمه بواسطة نشاط COX. في التحقيق في موت الخلايا المبرمج بوساطة الميتوكوندريا ، أظهرت باكس وباك الضربة القاضية المزدوجة انخفاض استيراد البروتين في مصفوفة الميتوكوندريا.
أنقذت ستة أسابيع من الجري الطوعي للعجلات عيب الاستيراد في الحيوانات ذات الضربة القاضية المزدوجة. من المهم النظر في متغيرات مثل مدة تفاعل الاستيراد والبروتين الذي سيتم استيراده. يمكن دمج الكسور الخلوية في التفاعل لفهم كيف يمكن للعوامل الخلوية أن تؤثر على معدل الاستيراد.
بدلا من ذلك ، يمكن تعديل البروتينات قبل الحضانة لفهم كيفية استيراد البروتينات بشكل انتقائي. يمكن أن تساعد هذه التقنية في فهم المسببات المعقدة لاعتلالات الميتوكوندريا العضلية التي قد تظهر في حالات مرضية مختلفة.
