كان تحلل الأنسجة الدهنية في الأنواع الفرعية تحديا لأن الطبيعة الهشة من adipocyte. وقد تم تطوير هذا البروتوكول للتغلب على ذلك عن طريق العزل الفعال للنيات واحدة. ويوفر هذا العمل نوى واحدة عالية النقاء مع المجاميع النووية إلى أدنى حد والحطام الخلوي.
هذا مفيد لـ نسخ الخلية المفردة من آلاف الخلايا. يمكن تطبيق هذا البروتوكول البسيط والقوي لدراسة تنظيم على مستوى الأنسجة من الخلايا الدهنية في الخلايا المقيمة. وعلى وجه الخصوص ، إلى phenotyping التنمية ، بالضربة القاضية الدهنية والفئران المعدلة وراثيا.
المرئية مظاهرة من هذا البروتوكول أمر بالغ الأهمية بحيث يمكن للأشخاص الذين ليس لديهم خبرة كبيرة في التعامل مع adipocyte تكرار والبصيرة في التجانس الدهني. بعد جمع الأنسجة الدهنية من الفئران ، بات يجف بمنشفة ورقية ، وضعه في طبق نظيف. إضافة كلوريد الكالسيوم إلى العازلة الهضم إلى تركيز النهائي من 10 mM.
ثم، إضافة حجم صغير إلى الأنسجة و mince بدقة. إضافة حوالي نصف كمية معدة من عازلة الهضم إلى الأنسجة المفروم. واستخدام ماصة المصلية لنقل العينة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 50 مل.
غسل الطبق مع المخزن المؤقت المتبقية وإضافته إلى أنبوب 50 مل. الماصات العينة صعودا وهبوطا عدة مرات. ثم، احتضانه لمدة 12 إلى 15 دقيقة في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 200 إلى 210 دورة في الدقيقة.
بعد الحضانة، إضافة 0.5٪ BSA إلى العينة في نسبة حجم 1 إلى 1 وخلط جيدا عن طريق الأنابيب. الطرد المركزي العينة في 300 xg لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتدور أسفل الكسر ستروموفاسوكل ترك الكسر adipocyte على القمة. تصفية الكسر العلوي على الرغم من مرشح الخلية 400 م في أنبوب 50 مل.
ثم، الوجه مرشح رأسا على عقب على الأنبوب ونقل adipocytes إلى أنبوب جديد باستخدام 0.5٪ BSA لعكس غسل مرشح. جلب الحجم الإجمالي لBSA إلى 10 إلى 15 مل والماصات العينة صعودا وهبوطا مع ماصة المصلية. ثم، الطرد المركزي مرة أخرى في 300 XG لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد الطرد المركزي، استخدم طرف ماصات كبير لنقل الطبقة العليا من العينة بعناية إلى مرشح خلية 100 متر فوق أنبوب جديد متجمد على الجليد. شطف مرشح مع كمية كافية من احتياطي إعداد النوى، ثم تجاهل ذلك. من هذه الخطوة إلى الأمام، والحفاظ على عينة على الجليد والعمل بسرعة.
اترك العينة على الجليد لمدة تصل إلى دقيقتين معكوس الأنبوب بشكل متقطع لخلطه. ثم، الطرد المركزي في 1000 XG و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة فائقة و resuspend بيليه في 1 مل من العازلة إعداد النوى.
نقل العينة إلى أنبوبrifuge الدقيقة النظيفة مع الحرص على تجنب لمس جدران الأنبوب القديم. إضافة 0.6 وحدة لكل مثبط RNase L ومزجها. ثم، الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقائق أخرى.
إزالة فائقة و resuspend بيليه و 1 مل من العازلة غسل النوى. مضاعفة تصفية العينة في أنبوب نظيفة باستخدام مرشحات مكدس 30 م. ثم، وغسل المرشحات مع حوالي 300 لتر من نوى غسل العازلة.
لتأكيد العزلة الناجحة للنيات الصحية، وصمة عار aliquot صغيرة من العينة مع trypan واستخدام عداد الخلايا الآلي لتقييم متوسط حجم الميت في المئة من الخلايا الميتة. وصمة عار في aliquot صغيرة من العينة مع DAPI وفحصها تحت المجهر مع هدف 20X أو أعلى. وينبغي أن تكون النوى مستديرة ولها غشاء نووي سليم.
الأسهم البيضاء تشير إلى النوى دون غشاء سليمة. بعد تنظيف النوى مع FACS، تركز هذه العينة عن طريق الطرد المركزي في 500 xg لمدة خمس دقائق في 4 درجات مئوية. ثم، إعادة تشكيلها في حجم مناسب من العازلة غسل النوى.
لتحقيق 50 إلى 1500 نواة لكل تركيز L والمضي قدما مع الخلية الواحدة النوى الحمض النووي الريبي مقبب. لإزالة الحطام الخلوي والمزدوجة، يتم فرز النوى الدهنية للحجم و حبيبي لاستبعاد المجاميع النووية والمضاعفات. وأخيرا للأحداث الإيجابية DAPI.
هذه الاستراتيجية الدرجات يؤدي إلى تنقية عالية أحادية النوى مع الحد الأدنى من المجاميع والحطام. عند فحصها عن طريق المجهر، يجب أن تكون النواة فرزها جولة ولها غشاء سليمة. ويمكن أيضاً إجراء تنقية ناجحة للنوّية باستخدام qRT-PCR في الوقت الحقيقي باستخدام الشعَب لـ Ucp1 mRNA الوليدة، وهي جينة علامة للدُيّايبِاتِ البنيِة.
حددت منصة الكروم نسخة من 7500 نوية من الأنسجة الدهنية البنية بين المورين. تم الكشف عن سبعة أنواع مختلفة من الخلايا مع t-SNE الحد من الأبعاد وk- يعني التجمع. وأعربت جميع المجموعات عن Fabp4، وهو جين عموم adipocyte ومجموعة فرعية أعرب عن مستوى عال من Ucp1 مرنا.
نوكلي معزولة ثم أكد على الرغم من أن هذا البروتوكول يمكن أن تخضع لأي خلية واحدة تقريبا مستوى منصة التعبير الجيني بما في ذلك الكروم من الجينوم 10x.
