تسمح هذه الطريقة التجريبية بالتخزين طويل الأجل للخلايا المفردة القابلة لإعادة الاستخدام للاختبار فوق الجينومي. كما يسمح بتحليل العديد من العلامات اللاجينية وعوامل النسخ في نفس الخلية الواحدة. في الطرق الحالية لتحليل epigenome أحادي الخلية ، لا يمكن إعادة تحليل نفس الخلايا المفردة.
ومع ذلك ، مع الخلايا المفردة القابلة لإعادة الاستخدام ، يمكن إعادة تحليل نفس الخلايا المفردة عدة مرات. هذه التقنية مفيدة لتشخيص وتصميم العلاج اللاجيني ، خاصة عندما تكون خلايا المريض محدودة العدد. هذه الطريقة هي الأنسب لدراسة epigenome ، وتنظيم التعبير الجيني ، والأنظمة الأخرى طالما تتوفر أجسام مضادة محددة للعلامات اللاجينية.
عند تجربة هذه التقنية لأول مرة ، نوصيك بالتدرب على عينات ليست ثمينة للغاية ، والتحقق من صحة التجربة باستخدام التسلسل الضحل مثل MiSeq أو iSeq 100. للبدء ، في غطاء تدفق رقائقي نظيف ، امزج ملليلترا واحدا من معلق الخلية و 199 ملليلترا من واحد EDTA PBS يحتوي على صبغة إقحام للحمض النووي. بعد الخلط ، انقل 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة القاع المسطح 96 بئرا.
ضع الغطاء على اللوحة المكونة من 96 بئرا وامسح اللوحة ضوئيا باستخدام مجهر المسح. بعد ذلك ، قم بإمالة اللوحة وانتظر بضع دقائق حتى تغرق الخلية المفردة إلى الحافة السفلية للبئر. ثم ضع طرف الماصة في الزاوية السفلية وانقل الخلية المفردة والمخزن المؤقت إلى أنبوب PCR.
افحص البئر باستخدام مجهر مضان لتأكيد النقل. إذا كانت خلية واحدة لا تزال في البئر ، أضف 200 ميكرولتر لكل بئر من مليمول واحد EDTA PBS يحتوي على صبغة مقحم للحمض النووي وكرر النقل. بعد النقل ، ضع غطاء على لوحة PCR المكونة من 96 بئرا وقم بطرد اللوحة باستخدام دوار متأرجح دون انقطاع.
بعد الطرد المركزي ، ضع اللوحة على سطح روبوت معالجة السوائل التلقائي. بعد ذلك ، اسحب وأفلت الرمز التكميلي الأول في نافذة البرنامج الخاصة بروبوت معالجة السوائل وقم بتشغيل البرنامج لإزالة 195 ميكرولترا من المادة الطافية بسرعة سحب بطيئة للغاية. أضف 50 ميكرولترا من 4٪ TEMED أو الزيت المعدني واحتضن اللوحة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
في اليوم التالي ، قم بإزالة الزيت المعدني عن طريق سحب وغسل الخلايا خمس مرات باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت السلبي للمغنيسيوم TP. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتلدين ، واحتضانها على الجليد لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، ضع أنابيب PCR على جهاز تدوير حراري وقم بتسخينه عند 94 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.
ثم انقل الأنابيب إلى كتلة معدنية مبردة بالجليد واحتضانها لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، أضف أربعة ميكرولترات من كلوريد كبريتات المغنيسيوم والصوديوم ، ومزيج DNTP واخلطه عن طريق الدوامة بأقصى سرعة. ثم أضف ميكرولتر واحد من جزء كبير من البلمرة BST ، واخلطه عن طريق الدوامة ، واحتضنه لمدة أربع ساعات على شاكر.
بعد الحضانة ، ضع أنبوب PCR على دورة حرارية وقم بتشغيل برنامج لمدة أربع ساعات أو بين عشية وضحاها كما هو موضح في النص. لربط الأجسام المضادة ، أضف 1.625 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم EDTA BSA إلى الأنبوب. تخلط عن طريق دوامة بسرعة منخفضة واحتضان الأنبوب على الجليد لمدة ساعة واحدة.
ثم أضف 0.1 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأجسام المضادة والتحكم في IgG المترافق مع مسبار الأجسام المضادة. بعد إضافة الأجسام المضادة ، احتضان الأنابيب على الجليد مع هز لطيف. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت TPM-T على الجليد.
ثم قم بإزالة المادة الطافية واغسلها مرة واحدة باستخدام المخزن المؤقت T4 DNA ligase. بعد ذلك ، أضف 19 ميكرولترا من محلول محول الربط واحتضانه لمدة ساعة عند 25 درجة مئوية. ثم ، أضف ميكرولتر واحد T4 DNA ligase واخلط الأنبوب عن طريق الدوامة بسرعة متوسطة.
ضع الأنبوب على جهاز تدوير حراري وقم بتشغيل برنامج ربط القرب. بعد الجري ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الإيجابي ل BST المغنيسيوم السلبي EDTA وقم بتخزين الخلايا طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا مرتين ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت السلبي EDTA السلبي للمغنيسيوم BST ، وأضف 20 ميكرولترا من خليط يحتوي على BST و DNTPs وكبريتات المغنيسيوم.
ثم تخلط مع خلاط دوامة واحتضان الأنبوب لمدة أربع ساعات على شاكر المداري. بعد الحضانة ، ضع الأنبوب على دورة حرارية وقم بتشغيل برنامج التمديد الكامل كما هو موضح في مخطوطة النص. بعد ذلك ، لتضخيم الإزاحة المتعددة ، أضف 0.4 ميكرولتر من 100 ميكرومولار التمهيدي العشوائي الثاني ، واخلطه بالدوامة.
بعد ذلك ، احتضن الأنبوب لمدة ساعتين على شاكر مداري قبل وضع الأنبوب على دورة حرارية للتسخين عند 94 درجة مئوية. بعد ثلاث دقائق ، ضع الأنابيب في كتلة معدنية مبردة بالثلج وأضف ميكرولتر واحد من بوليميراز الحمض النووي BST. دوامة الأنابيب بسرعة بطيئة.
ثم ضع الأنابيب على جهاز تدوير حراري لتشغيل برنامج تضخيم الإزاحة المتعددة. بعد البرنامج ، انقل ما يقرب من 20 ميكرولترا من المادة الطافية إلى أنبوب PCR ، وقم بتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت 0.05٪ TWEEN 20 و 0.1X TE إلى أنبوب PCR يحتوي على خلية مفردة قابلة لإعادة الاستخدام ، واحتضان الأنبوب طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي ، اجمع المادة الطافية وادمجها مع المادة الطافية التي تم جمعها مسبقا. بعد ذلك ، انقع الخلية المفردة القابلة لإعادة الاستخدام والمخزن المؤقت TBS الذي يحتوي على 50٪ من الجلسرين ، وخمسة ملليمولار EDTA ، و 0.5٪ BSA ، و 0.05٪ TWEEN 20 ، ثم احتضانه لمدة 30 دقيقة على شاكر مداري. بعد الحضانة ، قم بتخزين الخلية المفردة القابلة لإعادة الاستخدام عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى.
أخيرا ، أضف 40 ميكرولترا من مزيج Exo الرئيسي السلبي ، وضع الأنبوب على دورة حرارية لتشغيل البرنامج كما هو موضح في مخطوطة النص. تم إنشاء خلايا مفردة قابلة لإعادة الاستخدام K562 باستخدام هذا البروتوكول. تم تضمين الخلايا المفردة في الطبقة الخارجية من حبة بولي أكريلاميد وتصورها باستخدام صبغة مقحم لتلطيخ الحمض النووي.
يتم عرض منتجات الحمض النووي (DNA) قبل وبعد عملية الهضم BciVI هنا. ولد هضم إنزيم التقييد 19 إلى 20 المتوقع ، و 31 إلى 32 ، و 49 ، وأكثر من 49 شظية زوج القاعدة. علاوة على ذلك ، تم تحليل مكتبة الحمض النووي التي تم إنشاؤها عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري للمنتجات المطلوبة.
أشارت نتائج التسلسل إلى أن القراءات الفريدة المعينة من ليسين 27 الأسيتيل المضاد للهيستون H3 والليسين ثلاثي الميثيل 27 المضاد للهيستون H3 كانت أكثر عددا بكثير من IgG الضابط. تم تقييم إشارات تسلسل REpi من خلال مقارنة بيانات تسلسل REpi مع بيانات تسلسل ChIP المجمعة. في المتوسط ، تداخل ما يقرب من 91٪ من إشارات هيستون H3 ليسين 27 من تسلسل REpi مع قمم هيستون H-3 أسيتيل ليسين 27 في تسلسل ChIP السائب.
كانت دقة تسلسل REpi لعلامة الهستون غير النشطة ، هيستون H3 ثلاثي الميثيل ليسين 27 52٪ تم تحليل حساسية تسلسل REpi لقياس عدد قمم تسلسل ChIP السائبة التي تم اكتشافها بواسطة قراءات تسلسل REpi المستنسخة. كانت حساسية تسلسل REpi 55.30٪ في هيستون H3 أسيتيل ليسين 27 و 50.94٪ في هيستون H3 ثلاثي الميثيل ليسين 27. يرجى التأكد من استخدام الكواشف الخالية من DNS.
أيضا ، يجب إجراء جميع العمليات التي تنطوي على أسلاك أنبوب الفتح أو أسلاك الكاشف في غطاء نظيف. يتم تسلسل نواتج الحمض النووي لهذا الإجراء ثم تعيينها إلى الجينوم للكشف عن تعديلات الهستون الموجودة ، وفي أي مناطق من الجينوم في الخلايا المفردة. جعلت هذه التقنية من الممكن تحليل علامات جينية متعددة في نفس الخلية المفردة ومهدت الطريق لتحليل multiomics في أي خلية واحدة.
