نريد ان نشكر العديد من زملائنا الذين قدموا المساعدة والمشورة والمدخلات الحاسمة في مختلف مراحل المشروع. وأيد الإنتاج من هذه المادة الفيديو مع أموال من وزارة البيئة الألمانية للتعليم والبحوث (BMBF) إلى المركز الألماني لأبحاث السكري (DZD ، <a href="http://www.dzd-ev.de">http://www.dzd-ev.de</a> ) ، IMIDIA ( <a href="http://www.imidia.org">http://www . imidia.org</a> ) ومستشفى جامعة كارل غوستاف كاروس في جامعة دريسدن التقنية. تلقى البحوث المؤدية إلى هذه النتائج على تمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) للمبادرة مبتكرة في إطار منحة الطب الاتفاق رقم 115005.

1. نسيج البنكرياس جمع في غرفة العمليات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجراح بإجراء استئصال جزئي للبنكرياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وضع العينة في البنكرياس مربع على الجليد ، وتسليمها على الفور إلى الطبيب الشرعي. </li></ol> 2. اختيار الأنسجة لجزيرة العزلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يختار الطبيب الشرعي الذي يظهر نسيج ناعم وصحي ، والإبقاء على الأنسجة التالفة لأغراض التشخيص. يتم استبعاد الأنسجة تليفي وتقديم العينات أقل من 2 غرام من الأنسجة يمكن استخدامها من عزلة الجزيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج في نسيج البنكرياس الحل كولينز وتسليم اليورو على الجليد إلى المختبر. </li></ol> 3. عزلة الجزر الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن النسيج البنكرياس ، ثم ضع عليه في صحن 10 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 150 مل RPMI وسائل الاعلام في قارورة 500 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في قارورة 250 مل ، وإعداد الحل الانزيم الهضمي من خلال الجمع بين 130 مل مع وسائل الاعلام RPMI الدناز ملغ / 100 مل و 20 مل من RI Liberase 5mg/ml. تعادل 10 مل من هذا المحلول إلى حقنة لحقن الأنسجة البنكرياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن محلول الإنزيم الهضمي في أنسجة البنكرياس ، وتهدف إلى أن يتمدد متجانس. إذا تم ذلك عن طريق منع تليف ، سوف تفشل عملية الهضم احتمالا. المقبل ، في نسيج اللحم المفروم 4 ملم ~ 3 قطع على الجليد. </li></ol> 4. الإنسان الدائرة البنكرياس الهضم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الدوائر الهضم كما هو مبين في الشكل 1. اتجاه تدفق في الغرفة Ricordi في أسفل والخروج في الجزء العلوي من القاعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الانزيم الهضمي المتبقية حل للقارورة 500 مل تصل إلى إجمالي حجم 300 مل وإدراج مقياس الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أنسجة البنكرياس في الغرفة ، تضاف شبكة (قطر المسام : 600 ميكرون) وثلاثة من الرخام نتريد السيليكون (القطر : 15 ملم) ، على مقربة من القاعة وبدء ضخ مع تدفق وضعت في 140 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند درجة حرارة تصل إلى الدائرة 37 درجة مئوية ، وبدء التوقيت واتخاذ عينات دورية لتحديد متى توقف عملية الهضم. تلطيخ مع dithizone (2 ملغ / مل) تسمح برؤية مجهرية من الجزر داخل النسيج هضمها 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم فصل الجزر من الأنسجة المحيطة عنيبية ، سرعان ما توقف عملية الهضم عن طريق وضع ملف التسخين على الجليد ، وإضافة 200 مل من وسائل الإعلام يغسل الباردة (900 مل RPMI 1640 مع الجلوكوز ملي 5.5 و FBS 10 ٪) إلى الحلبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الحل جزيرة في أنابيب مخروطية 250 مل لأنه يخرج من أنبوب العينة. تستمر حتى حلبة فارغة. </li></ol><img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/2962/2962fig1.jpg" /> الشكل 1. عملية الهضم والبنكرياس الإنسان الدائرة هضم البنكرياس الإنسان الدائرة تضم غرفة تحتوي على شبكة Ricordi (قطر المسام : 600 ميكرون) ، وثلاث قطع الرخام نيتريد السيليكون (القطر : 15 ملم). والدافع تدفق من غرفة إلى الأنسجة قارورة جمع بواسطة مضخة تمعجية (140 مل / دقيقة). الأسهم تشير إلى اتجاه التدفق. المحافظة على درجة الحرارة المثلى لعملية الهضم الأنزيمي بغمر ملف التسخين في حمام ماء C ° 37. 5. الغسيل بعد الهضم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي ال 250 مل تحتوي على أنابيب مخروطية الحل جزيرة في 1000 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ، resuspend الكرية الجزيرة في وسائل الإعلام يغسل (900 مل RPMI 1640 مع الجلوكوز ملي 5.5 و FBS 10 ٪) وتوزيعه في أجزاء متساوية للأنابيب مخروطية 50 مل. (اختياري : توزيع في أنابيب مخروطية إضافية لتحسين الغسيل) جهاز طرد مركزي في 1000 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف وتخفيف بلطف الكريات التي تهز اليدوي. </li></ol> 6. تنقية على التدرج Ficoll <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية مع وسائل الاعلام Ficoll في كثافة 1.125 غ / مل ، ودرجة الحموضة 7.4 و تراكب ببطء aliquots 10 مل من وسائل الاعلام Ficoll مع كثافة 1.060 ، 1.080 و 1.037 غرام / مليلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي التدرجات Ficoll في 2400 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. </li></ol> 7. جزيرة جمع والثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي ، يمكن التمييز بين مكونات النسيج مختلفة عن طريق التقسيم في التدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الطبقة العليا التي تتألف من النسيج الضام والدهون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد بعناية الطبقة الأولى من المجاميع جزيرة في الطور البيني غ / مل 1،037-1،060. هذه الطبقة تحتوي على معظم الجزر المعزولة نقية. جمع الكسور بشكل منفصل عن العزلة الفعالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الثانية ، كسر أقل نقية من المجاميع جزيرة في الطور البيني غ / مل 1،060-1،080. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع التدرج Ficoll بإضافة وسائل الإعلام يغسل (900 مل RPMI 1640 مع الجلوكوز ملي 5.5 و FBS 10 ٪) لكل أنبوب مخروطي يصل إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 مل. الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف عن طريق الشفط. استخدام الرعاية مثل بيليه قد يكون راجعا إلى فضفاضة التدرج Ficoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل واي الكرياتال يغسل وسائل الإعلام (900ml RPMI 1640 مع الجلوكوز ملي 5.5 و FBS 10 ٪) ، وأجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تكرار استخدام وسائط الثقافة الجزيرة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الجزر في وسائل الإعلام والثقافة ، ووضعها في الحاضنة مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2 في 37 ل24-48 ساعة قبل مواصلة تجهيز درجة مئوية. </li></ol>

<ol>
	<li>Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+cell+lesion+in+type+2+diabetes:+there+has+to+be+a+primary+functional+abnormality.">The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality.</a> Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).</li><li>Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+abnormalities+in+the+islets+isolated+from+type+2+diabetic+subjects.">Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects.</a> Diabetes. 53, 624-632 (2004).</li><li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+isolation+of+human+pancreatic+islets.">Automated method for isolation of human pancreatic islets.</a> Diabetes. 37, 413-420 (1988).</li><li>Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets.">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45, 827-830 (1988).</li><li>Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., J&#228;ger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin+turnover+in+islets+from+type+2+diabetic+patients.">Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients.</a> Islets. 2, 30-36 (2010).</li><li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pancreatic+diabetes+(type+3c+diabetes)+underdiagnosed+and+misdiagnosed?.">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed?.</a> Diabetes Care. 31, S165-S169 (2008).</li><li>Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+disorders+and+diabetes+mellitus.">Pancreatic disorders and diabetes mellitus.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, S7-S12 (2008).</li><li>Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+type+I+diabetes+in+first-degree+relatives+using+a+combination+of+insulin,+GAD,+and+ICA512bdc/IA-2+autoantibodies.">Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies.</a> Diabetes. 45, 926-933 (1996).</li><li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition,+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1:+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation.">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li><li>Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+of+Purified+{beta}-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection.">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

باستخدام بروتوكول لدينا ، ويمكن الإنسان من الجزر المعزولة أنسجة البنكرياس التي جمعت من استئصال البنكرياس الجزئي. نجاح هذا البروتوكول يعتمد على الرعاية التي اتخذت خلال نقطة حرجة قليلة. للحفاظ على سلامة خلايا بيتا ، فمن الضروري أن يتم نقل العينات بسرعة على الجليد إلى المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون الأمثل مدة الهضم الأنسجة تجريبيا وفقا لدرجة تليف الأنسجة والنشاط الأنزيمي من وسائل الإعلام. هذا ينطبق أيضا على درجة من القوة الميكانيكية المطبقة يدويا إلى غرفة Ricordi. وبالتالي الحصول على محصول جيد جزيرة ، يتم تنفيذ بروتوكول أفضل من قبل عالم مخصصة أو مساعد تقني. الفشل الأولي هو القاعدة ما لم يتم بالفعل فريق من ذوي الخبرة في عزلة الجزيرة. هناك اختلافات رئيسية بين جزيرة لدينا بروتوكول العزلة والعزلة مستوى جزيرة البشرية الأسلوب : 1) على الرغم من أننا استخدام أنسجة البنكرياس تعرض لعدة ساعات من نقص التروية أثناء إجراء الجراحة ، ويتم معالجتها على الفور في الموقع. هذا هو على النقيض من بنكرياسات explanted من الدماغ ميت المانحين لالبنكرياس / جزيرة الزرع الدماغية التي تبقى لعدة ساعات خلال تخصيص وتسليمها للمنشأة جزيرة العزلة. 2) نحن كولاجيناز حقن مباشرة في أنسجة البنكرياس ، في حين أن البروتوكول هو معيار لضخه في القناة البنكرياسية. 3) ونحن منفصلة الجزر باستخدام التدرج Ficoll متقطع بدلا من جمع الجزر من الانحدار المستمر Ficoll باستخدام معالج الخلية كوبي. في الحالات التي تكون فيها عينة جراحية نادرة جدا أو تليفي لعزل عدد كاف من الجزر ، لا يزال الأنسجة التي يمكن استرجاع microdissection التقاط الليزر (LCM) 10. هذا يسمح استرداد البيانات من عينة التعبير الجيني تقريبا ، حتى إذا فشل أو العزلة جزيرة العائد منخفض جدا. للأسف ، LCM لا تنتج الخلايا الحية للدراسات الفنية وقيمتها غير كافية عادة لتحليل البروتين. وبالتالي ، قد تستخدم LCM بالتوازي مع شركائنا كولاجيناز بروتوكول الهضم لاسترداد الجزر تكون الطريقة الأكثر فعالية لمعالجة العينات الجراحية. عند جمع الأنسجة لعزلة الجزيرة من pancreatectomies جزئية ، من المهم أن تدرس بعناية التاريخ المريض السريرية والأيض الدولة. وقد يتأثر المريض مستأصل البنكرياس جزئيا حسب نوع 3C السكري ، أي مرض السكري الثانوي إلى اضطراب البنكرياس مما يؤدي إلى عملية جراحية 6. وكان من بين المرضى الذين خضعوا ل43 المشاركة في هذه الجراحة ادارتنا في عام 2010 ، 32 منهم كانوا غير مصابين بالبول السكري ، تتأثر 5 من مرض السكري من النوع 2 و 6 من النوع 3C السكري. هذه البيانات تتفق مع دراسات سابقة تشير إلى اختلال عملية التمثيل الغذائي ومرض السكري الجلوكوز في جزء كبير من المرضى الذين يعانون من سرطان البنكرياس أو التهاب البنكرياس المزمن 6. اعتبرنا أن مرض السكري المنشأ الأساسي إذا تم تشخيص ما لا يقل عن عام واحد قبل ظهور الأعراض التي تؤدي إلى جراحة البنكرياس 7. وينبغي أيضا على مستويات الأجسام المضادة ضد autoantigens جزيرة تقاس لتقييم الأصل الذاتية المحتملة للمرض السكري 8. لأن المريض يمكن أن يمر استئصال البنكرياس يعانون من مرض السكري دون تشخيص أو أن يكون الجلوكوز التعصب ، ينبغي إعطاء جميع المرضى غير المصابين بالبول السكري an تحمل الغلوكوز الفموي اختبار مسبق لاستئصال البنكرياس 9.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><th> معدات </th><th></th><th></th></tr><tr><td> 1 مل المصلية ماصة (CELLSTAR) </td><td> غرينر الحيوي واحد </td><td> 604181 </td></tr><tr><td> 10 مل المصلية ماصة (CELLSTAR) </td><td> غرينر الحيوي واحد </td><td> 607180 </td></tr><tr><td> 25 مل المصلية ماصة (CELLSTAR) </td><td> غرينر الحيوي واحد </td><td> 760180 </td></tr><tr><td> الحقنة 10 مل </td><td> دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) </td><td> 300912 </td></tr><tr><td> الحقنة 50 مل </td><td> دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> 5 مل الحقنة </td><td> دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) </td><td> 309050 </td></tr><tr><td> 18 G 1،1 / 2 إبرة Microlance 3 </td><td> دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) </td><td> 304622 </td></tr><tr><td> GX1 27 / 2 إبرة </td><td> براون </td><td> 4658300 </td></tr><tr><td> Gx3 27 / 4 Microlance الإبرة 3 </td><td> دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) </td><td> 302200 </td></tr><tr><td> 3 خلية ثقافة الطول طبق 2X2 ملم الشبكة </td><td> نونك </td><td> 174926 </td></tr><tr><td> 20 سم صحن زراعة الأنسجة </td><td> دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 6 سم سهلة طبق بتري قبضة </td><td> دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) </td><td> 351016 </td></tr><tr><td> 150 مل زجاجة التخزين </td><td> كورننغ إنكوربوريتد </td><td> 431175 </td></tr><tr><td> 250 مل مخروطي قوارير </td><td> شوت دوران </td><td> 21 217 36 </td></tr><tr><td> 500 مل مخروطي قوارير </td><td> شوت دوران </td><td> 21 217 44 </td></tr><tr><td> 250 مل مخروطية كاب برغي أسفل أنبوب جهاز طرد مركزي </td><td> كورننغ إنكوربوريتد </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> 50 مل أنبوب فالكون المخروطية </td><td> دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> 260 مل Easyflask غير المعالجة </td><td> نونك </td><td> 156800 </td></tr><tr><td> Millex GV Duropore تصفية وحدة (0،22 ميكرون) </td><td> ميليبور </td><td> SLGV033RB </td></tr><tr><td> فراغ زجاجة الأعلى تصفية (PES القطر 70 ملم Membran ، 0،22 ميكرون حجم المسام ، و 45 مم حجم الرقبة ، و 500 مل حجم) </td><td> كورننغ إنكوربوريتد </td><td> 431118 </td></tr><tr><td> مقياس الكثافة (Densito 30PX) LWE37463 </td><td> Mettler توليدو </td><td> 51324450 </td></tr><tr><td> سريع وحدة تصفية PES 0،2 ميكرون </td><td> Nalgene </td><td> 569-0020 </td></tr><tr><td> لفائف التدفئة </td><td> BioRep تكنولوجيز شركة </td><td> HC - 02 </td></tr><tr><td> 4 Multifuge KS - R </td><td> هيراوس </td><td> 75015680 </td></tr><tr><td> مضخة الطباع PD5206 </td><td> Heidolph </td><td> 523-52060-00-2 </td></tr><tr><td> Ricordi الغرفة (شبكة معدنية بقطر 600 ميكرومتر مسام) </td><td> BioRep تكنولوجيز </td><td> نموذج 50 - U - 01 ، 0503-001 التسلسلي </td></tr><tr><td> إعداد الجناح </td><td> BioRep تكنولوجيز </td><td> 50 - PS - 01 </td></tr><tr><td> O - خواتم </td><td> BioRep تكنولوجيز </td><td> OR - 50 - U - 01 </td></tr><tr><td> الرخام نتريد السيليكون (15 مم مجموعة من 9) </td><td> BioRep تكنولوجيز </td><td> SN - 01 </td></tr><tr><td> أنابيب السيليكون </td><td> Tygon </td><td> R 3603 8،0 X4 ، 0 ملم </td></tr><tr><td> ملقط جراحي </td><td> براون </td><td> BD168R </td></tr><tr><td> مقص جراحي (Aesculap) </td><td> براون </td><td> BC273R </td></tr><tr><td> حمام الماء شريان الحياة للسودان 200 </td><td> منح </td><td> 200 عملية شريان الحياة </td></tr><tr><th> الكواشف </th><th></th><th></th></tr><tr><td> كولاجيناز -- RI Liberase&gt; (100 ملغ) </td><td> روش </td><td> 11815032001 </td></tr><tr><td> D (+) - الجلوكوز </td><td> ميرك </td><td> 1.08337.1000 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide (DMSO) </td><td> ميرك </td><td> 1.16743.1000 </td></tr><tr><td> Diphenylthiocarbazone (DTZ) </td><td> سيغما الدريتش </td><td> D5130 </td></tr><tr><td> الدناز I (100 ملغ) </td><td> روش </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Dulbeccos 1xPBS </td><td> PAA مختبرات </td><td> H15 - 002 </td></tr><tr><td> Electrolytsolution E154 </td><td> Serumwerk </td><td> 00509 </td></tr><tr><td> الجنين مصل البقر (FBS) </td><td> PAA مختبرات </td><td> A15 - 101 </td></tr><tr><td> Ficoll 400 </td><td> سيغما الدريتش </td><td> F9378 </td></tr><tr><td> Foetal المصل البقري (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td></tr><tr><td> 2 -- (4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) -- 1 - piperazinyl) - ethansulfons ‰ لدى عودتهم (HEPES) </td><td> روث </td><td> 9105.3 </td></tr><tr><td> هيدروكسيد الصوديوم ، 5 م </td><td> قسم الصيدلة السريرية ، والمستشفيات </td><td> -- </td></tr><tr><td> البنسلين / الستبرتوميسين (100X) </td><td> PAA مختبرات </td><td> P11 - 010 </td></tr><tr><td> Pipettaid (EXPRESS) </td><td> دينار بحريني (بيكتون ، ديكنسون ، والشركة) </td><td> 357591 </td></tr><tr><td> Potassiumchlorid </td><td> Fluka </td><td> 60132 </td></tr><tr><td> Potassiumdihydrogenphospate اللامائية </td><td> JT بيكر </td><td> 0241 </td></tr><tr><td> Potassiummonohydrogenphosphate </td><td> JT بيكر </td><td> 3246-01 </td></tr><tr><td> RPMI متوسطة 1640 [--] مد الجلوكوز [+] L - الجلوتامين </td><td> Gibco </td><td> 11879-020 </td></tr><tr><td> RPMI متوسطة 1640 [+] L - الجلوتامين </td><td> PAA مختبرات </td><td> E15 - 840 </td></tr><tr><td> Sodiumhydrogencarbonat </td><td> ميرك </td><td> 1.06329.0500 </td></tr></tbody></table> وسائل الإعلام وحلول Dithizone الحل <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل شركة دي تي زد 100 ملغ في 10 مل DMSO وتمييع في برنامج تلفزيوني 40 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية العقيمة الحل (0.22 ميكرون) </li></ul> انزيم الحل <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب 100 RI Liberase ملغ في 20 مل الإعلام RPMI 1640 (دون الملاحق) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل الدناز 100 ملغ في 1 مل الإعلام RPMI 1640 (دون الملاحق) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية العقيمة الحل (0.22 ميكرون) والحفاظ على انزيم على الجليد </li></ul> غسل وسائل الإعلام (1000ml/5.5mM الجلوكوز) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب 100 مل FBS (الحرارة المعطل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 450 مل RPMI 1640 (أي السكر) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 450 مل RPMI 1640 (11 ملي الجلوكوز) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية العقيمة الحل (0.22 ميكرون) </li></ul> جزيرة الثقافة وسائل الإعلام (500ml / 5،5 ملي مول جلوكوز) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 10 مل HEPES 1M (الرقم الهيدروجيني 7.4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 مل FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة البنسلين 5 مل / الستربتوميسين (100X) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.75 مل محلول الجلوكوز M 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 432.25 مل RPMI 1640 (أي السكر) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية العقيمة الحل (0.22 ميكرون) </li></ul> اليورو كولينز الحل <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4083 hydrogenphosphate ز البوتاسيوم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70،0 ز الجلوكوز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كلوريد البوتاسيوم 2237 ز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 14،80 monohydrogenphosphate ز البوتاسيوم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1680 hydrogencarbonate ز الصوديوم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 مل من محلول الإلكتروليت (E 154) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرقم الهيدروجيني 7،4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الماء المقطر حتى 2000 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية العقيمة الحل (0.22 ميكرون) </li></ul> Ficoll ألبوم الحل <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1000 مل من محلول كولينز Ficoll اليورو إلى 500 غ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 8.94 HEPES ز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضجة بين عشية وضحاها حتى يتم حلها Ficoll </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرقم الهيدروجيني 7،4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الكثافة </li></ul> Ficoll التدرجات <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب كمية FBS ، اليورو الحل كولينز وFicoll محلول المخزون وفقا لكثافة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين الحلول (3) وقياس كثافة مع مقياس الكثافة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة اليورو كولينز الحل أو الحلول Ficoll الأسهم حتى يتم ضبط كثافة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية العقيمة الحل (0.22 ميكرون) وتخزين في 4 درجات مئوية </li></ul>

isolation of human islets from partially pancreatectomized patients

وقد أعاق التحقيقات في إمراض السكري من النوع 2 والجزر من خلل انجرهانز 1 من محدودية الجزر السكري نوع 2 من 2 المتبرعين بالأعضاء. هنا نحن لدينا حصة بروتوكول لعزل الجزر من نسيج البنكرياس الإنسان الحصول عليها من مرضى السكري من النوع 2 السكري وغير المرضى الذين خضعوا لاستئصال البنكرياس جزئيا بسبب أمراض مختلفة البنكرياس (أورام حميدة أو خبيثة البنكرياس ، التهاب البنكرياس المزمن ، والقناة الصفراوية المشتركة أو الأورام الاثني عشر) . أعطى جميع المرضى المشاركين موافقتهم على هذه الدراسة ، التي لديها أيضا تمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاق المحلية. على الفور تم تسليم العينات الجراحية إلى الطبيب الشرعي الذي اختار ناعمة وصحية أنسجة البنكرياس تظهر للعزلة الجزيرة ، الإبقاء على الأنسجة التالفة لأغراض التشخيص. كنا قد وجدنا أن لعزل أكثر من 1000 جزيرة ، لتبدأ على الأقل 2 غرام من نسيج البنكرياس. من الضروري أيضا أن بروتوكول جهدنا ليتمدد بشكل ملحوظ عند حقن الأنسجة وسائل الإعلام التي تحتوي على انزيم واللحم المفروم لاحقا للمساعدة على الهضم من خلال زيادة مساحة السطح. لتوسيع نطاق تطبيق بروتوكول لتشمل حالة عرضية فيه كمية كبيرة (&gt; 15G) من نسيج البنكرياس البشرية المتاحة ، واستخدمنا غرفة Ricordi (50 مل) لهضم الأنسجة. خلال عملية الهضم ، ونحن هزت يدويا غرفة Ricordi 3 في شدة أن تتفاوت من العينة وفقا لمستواها من تليف الأنسجة. واستخدمت بعد ذلك التدرج Ficoll discontinous لفصل الأنسجة من الجزر عنيبية. لاحظنا أن بيليه الأنسجة يجب أن تكون صغيرة بما يكفي لتكون معلق في وسط متجانس Ficoll مع كثافة 1.125 غرام / مليلتر. بعد عزلة ، ونحن المثقفين الجزر في ظل ظروف خالية من الإجهاد (لم تهتز أو التناوب) مع 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة على الأقل من أجل تسهيل تعافيهم وظيفية. ويمكن تطبيق البروتوكول على نطاق واسع لدينا وتحسينها في المستقبل تمكين الحصاد في الوقت المناسب لكميات كبيرة من الجزر البشرية من مرض السكري والمتطابقة سريريا الموضوعات غير مصاب بالسكري ، والمضي قدما إلى حد كبير البحوث داء السكري من النوع 2.

أسفرت بروتوكول لدينا في المتوسط ​​من الجزر 500 ~ لكل غرام من النسيج البنكرياس ، على الرغم من تفاوت كبير بين هذه الاستعدادات إلى حد كبير بسبب الاختلافات في والنشاط كولاجيناز التليف. حققنا&gt; جزيرة نقاء 90 ٪ بحلول الأول مع تلوين Dithizone أثناء معالجة الأنسجة ، ثم انتقاء منها بعد 24 ساعة من العزلة. لتحديد نوعية الجزر منقى ، نحن اختبار لمدة 25 ملي الجلوكوز حفز افراز الانسولين في ظل ظروف ثابتة لمدة 2 ساعة. تم العثور على افراز الانسولين يمكن أن تقارن من الجزر التي تم الحصول عليها من العزلة جزيرة ECIT ومراكز الزرع. لأنه ليس المقصود من الجزر المعزولة بنكرياسات مستأصل البنكرياس جزئيا عن زرع جزيرة ، وتقييم مجموع IEQ لا يعتبر عاملا حاسما. الأهم من ذلك ، تمكين لدينا وسيلة لنا لعزل الجزر للدراسات الفنية من المرضى 25 مستأصل البنكرياس الجزئي بين عامي 2005 و 5 عام 2008. وقد تم تحليل هذه الجزر لالجلوكوز حفز افراز الانسولين ومحددة بروتين تعبير بواسطة النشاف الغربية والمناعية. ويمكن أيضا الجزر المعزولة من بنكرياسات pancreatecomized جزئيا استخدامها للمقارنة بين الجينات والبروتينات ملامح التعبير ، والمظهر التركيبية الوظيفية والاستجابات من الجزر غير المصابين بالبول السكري ومرض السكري. لأن هناك المزيد من المرضى الذين يخضعون لاستئصال البنكرياس جزئيا من هناك المتبرعين ، ويمكن لدينا بروتوكول يسمح جمع عينات كافية والبيانات للتحليل الإحصائي قوية.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients at JoVE.com

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

المعروض من الجزر من النوع 2 السكري للبحوث غير كافية. هنا نحن لدينا حصة بروتوكول لعزل الجزر من المرضى الذين يخضعون لاستئصال البنكرياس جزئيا. هذا النهج يمثل فرصة فريدة للحصول على الجزر من السكري من النوع 2 وغير المتطابقة سريريا السكري الموضوعات بأعداد كافية للدراسات الأساسية والسريرية.

عزلة الإنسان الفشوت من المرضى مستأصل البنكرياس جزئيا

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

isolation-of-human-islets-from-partially-pancreatectomized-patients

Research

JoVE Journal

Medicine

15.8K Views.  University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden. المعروض من الجزر من النوع 2 السكري للبحوث غير كافية. هنا نحن لدينا حصة بروتوكول لعزل الجزر من المرضى الذين يخضعون لاستئصال البنكرياس جزئيا. هذا النهج يمثل فرصة فريدة للحصول على الجزر من السكري من النوع 2 وغير المتطابقة سريريا السكري الموضوعات بأعداد كافية للدراس...

Video: Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

تلطيخ بروتوكولات لجزر البنكرياس الإنسان

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

تحسين بروتوكول للتسليخ مجهري ليزر من الجزر البنكرياسية الإنسان من عينات جراحية

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Dynamic Visual Tests to Identify and Quantify Visual Damage and Repair Following Demyelination in Optic Neuritis Patients

In order to follow optic neuritis patients and evaluate the effectiveness of their treatment, a handy, accurate and quantifiable tool is required to assess changes in myelination at the central nervous system (CNS). However, standard measurements, including routine visual tests and MRI scans, are not sensitive enough for this purpose. We present two visual tests addressing dynamic monocular and binocular functions which may closely associate with the extent of myelination along visual pathways. These include Object From Motion (OFM) extraction and Time-constrained stereo protocols. In the OFM test, an array of dots compose an object, by moving the dots within the image rightward while moving the dots outside the image leftward or vice versa. The dot pattern generates a camouflaged object that cannot be detected when the dots are stationary or moving as a whole. Importantly, object recognition is critically dependent on motion perception. In the Time-constrained Stereo protocol, spatially disparate images are presented for a limited length of time, challenging binocular 3-dimensional integration in time. Both tests are appropriate for clinical usage and provide a simple, yet powerful, way to identify and quantify processes of demyelination and remyelination along visual pathways. These protocols may be efficient to diagnose and follow optic neuritis and multiple sclerosis patients.
In the diagnostic process, these protocols may reveal visual deficits that cannot be identified via current standard visual measurements. Moreover, these protocols sensitively identify the basis of the currently unexplained continued visual complaints of patients following recovery of visual acuity. In the longitudinal follow up course, the protocols can be used as a sensitive marker of demyelinating and remyelinating processes along time. These protocols may therefore be used to evaluate the efficacy of current and evolving therapeutic strategies, targeting myelination of the CNS.

Object From Motion (OFM) and Time-constrained stereo protocols are sensitive tools to identify monocular and binocular dynamic visual function deficits, which are uniquely affected in optic neuritis patients. Furthermore, these tests may be used as quantitative noninvasive tools to assess the extent of myelination along visual pathways.

الاختبارات البصرية الديناميكية لتحديد وقياس الأضرار البصرية والتصليح وبعد إزالة الميالين في التهاب العصب البصري المرضى

In order to follow optic neuritis patients and evaluate the effectiveness of their treatment, a handy, accurate and quantifiable tool is required to ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

عزل وتوصيف وظيفي من الإنسان البطيني العضلية من العينات الجراحية الطازجة

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

عزل الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البشرية سرطان البروستاتا

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; ديسيبل</sup&gt; نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Full-root Aortic Valve Replacement by Stentless Aortic Xenografts in Patients with Small Aortic Roots

In patients with small aortic roots who need an aortic valve replacement with biological valve substitutes, the implantation of the stented pericardial valve might not meet the functional needs. The implantation of a too-small stented pericardial valve, leading to an effective orifice area indexed to a body surface area less than 0.85 cm2/m2, is regarded as prosthesis-patient mismatch (PPM). A PPM negatively affects the regression of left ventricular hypertrophy and thus the normalization of left ventricular function and the alleviation of symptoms. Persistent left ventricular hypertrophy is associated with an increased risk of arrhythmias and sudden cardiac death. In the case of predictable PPM, there are three options: 1) accept the PPM resulting from the implantation of a stented pericardial valve when comorbidities of the patient forbid the more technically demanding operative technique of implanting a larger prosthesis, 2) enlarge the aortic root to accommodate a larger stented valve substitute, or 3) implant a stentless biological valve or a homograft. Compared to classical aortic valve replacement with stented pericardial valves, the full-root implantation of stentless aortic xenografts offers the possibility of implanting a 3-4 mm larger valve in a given patient, thus allowing significant reduction in transvalvular gradients. However, a number of cardiac surgeons are reluctant to transform a classical aortic valve replacement with stented pericardial valves into the more technically challenging full-root implantation of stentless aortic xenografts. Given the potential hemodynamic advantages of stentless aortic xenografts, we have adopted full-root implantation to avoid PPM in patients with small aortic roots necessitating an aortic valve replacement. Here, we describe in detail a technique for the full-root implantation of stentless aortic xenografts, with emphasis on the management of the proximal suture line and coronary anastomoses. Limitations of this technique and alternative options are discussed.

Full-root aortic valve replacement by stentless aortic xenograft is a viable option in patients with small aortic roots. We describe, a technique for the full-root implantation of stentless aortic xenografts, with emphasis on the management of the proximal suture line and coronary anastomoses, and discuss its limitations and alternative options.

كامل الجذر استبدال الصمام الأبهري من قبل ستنتليس الأبهر زينوغرافتس في المرضى الذين يعانون من الجذور الأورطي الصغيرة

In patients with small aortic roots who need an aortic valve replacement with biological valve substitutes, the implantation of the stented pericardial ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

عزل خلايا Decidual البشرية الأولية من الأغشية الجنينية لمصطلح مترافق

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

إينترابورتال زرع جزيرات البنكرياس في طراز الماوس

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...