Wir wollen unseren vielen Kollegen, die Hilfe, Ratschläge und kritischen Input in verschiedenen Phasen des Projekts bedanken. Die Produktion dieses Video Artikel wurde mit Mitteln des deutschen Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF), um das Deutsche Zentrum für Diabetes-Forschung (DZD, unterstützt <a href="http://www.dzd-ev.de">http://www.dzd-ev.de</a> ), IMIDIA ( <a href="http://www.imidia.org">http://www . imidia.org</a> ) und des Universitätsklinikums Carl Gustav Carus an der Technischen Universität Dresden. Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen hat eine Finanzierung von der Europäischen Gemeinschaft Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) für das Innovative Medicine Initiative unter Finanzhilfevereinbarung n ° 115005.

1. Pankreasgewebe Sammlung im OP <ol><li> Der Chirurg führt eine Teilresektion des Pankreas. </li><li> Nach dem Aufsetzen des Pankreas Probe in einem Kasten auf dem Eis, liefern sie sofort an den Pathologen. </li></ol> 2. Tissue Auswahl für Inselzellen isoliert <ol><li> Der Pathologe wählt Gewebe, das weich und gesund erscheint, halten das geschädigte Gewebe zu diagnostischen Zwecken. Fibrotische Gewebe und Proben mit weniger als 2 g verwertbarem Gewebematerial aus Inselzellen isoliert ausgeschlossen. </li><li> Tauchen Sie das Pankreasgewebe in Euro Collins-Lösung und liefern auf Eis ins Labor. </li></ol> 3. Isolation von menschlichen Inseln <ol><li> Wiegen Sie das Pankreasgewebe, dann legen Sie sie in eine 10 cm Schüssel. </li><li> Legen Sie 150 ml RPMI-Medium in einem 500 ml-Flasche. </li><li> In einem 250 ml Kolben, bereiten Sie das Verdauungsenzym-Lösung durch die Kombination von 130 ml RPMI-Medium mit 100 mg / ml DNase und 20 ml 5mg/ml Liberase RI. Draw 10 ml dieser Lösung in eine Spritze mit dem Pankreasgewebe zu injizieren. </li><li> Spritzen Sie das Verdauungsenzym-Lösung in das Pankreasgewebe mit dem Ziel, sie homogen zu dehnen. Wenn dies durch Fibrose verhindert ist, wird der Verdauungsprozess wahrscheinlich fehlschlagen. Als nächstes Blatt vor den Mund des Gewebes in ca. 4 mm 3 Stück auf Eis. </li></ol> 4. Menschlichen Pankreas Verdauung Schaltung <ol><li> Montieren Sie die Verdauung Schaltung wie in Abbildung 1 dargestellt. Die Strömungsrichtung im Ricordi Kammer ist in an der Unterseite und bei der Spitze der Kammer. </li><li> Fügen Sie die restlichen Verdauungsenzym Lösung für die 500 ml Flasche bis zu einem Gesamtvolumen von 300 ml und legen Sie ein Thermometer. </li><li> Übertragen Sie die Pankreasgewebe in die Kammer, legen Sie die Maschen (Porendurchmesser: 600 pm) und drei Siliziumnitrid Marbles (Durchmesser: 15 mm), in der Nähe der Kammer und die Pumpe mit der Strömung bei 140 ml / min eingestellt. </li><li> Wenn die Temperatur der Schaltung 37 ° C erreicht, Startzeitpunkt und in regelmäßigen Abständen Proben zu nehmen, um zu bestimmen, wenn die Verdauung zu stoppen. Die Färbung mit Dithizon (2 mg / ml) ermöglicht mikroskopische Visualisierung der Inseln innerhalb der verdauten Gewebe 4. </li><li> Sobald die kleinen Inseln aus den umliegenden acinäres Gewebe getrennt sind, stoppen Sie schnell die Verdauung, indem sie die Heizspirale auf Eis und Zugabe von 200 ml kaltes Waschen Medien (900 ml RPMI 1640 mit 5,5 mM Glukose und 10% FBS), um den Stromkreis. </li><li> Sammeln Sie die Insel-Lösung in 250 ml konische Röhrchen, wie es kommt aus dem Probenröhrchen. Fahren Sie bis zur Schaltung ist leer. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2962/2962fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die menschliche Bauchspeicheldrüse Verdauung Schaltung der menschlichen Bauchspeicheldrüse Verdauung Schaltung umfasst einen Ricordi Kammer mit mesh (Porendurchmesser: 600 pm) und drei Siliziumnitrid Kugeln (Durchmesser: 15 mm). Mittelabfluss aus der Kammer ist es, das Gewebe Auffangkolben durch die Schlauchpumpe (140 ml / min) angetrieben. Die Pfeile zeigen die Fließrichtung. Eine optimale Temperatur für enzymatische Verdauung wird durch Eintauchen der Heizspirale in einem 37 ° C Wasserbad gehalten. 5. Washing post-Verdauung <ol><li> Zentrifugieren Sie die 250 ml konische Röhrchen mit der Insel-Lösung bei 1000 rpm, 4 ° C für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen, resuspendieren der Insel Pellet in Waschmedium (900 ml RPMI 1640 mit 5,5 mM Glucose und 10% FBS) und verteilen sie in gleiche Anteile auf 50 ml konische Röhrchen. (Optional:. Verteilen in zusätzliche konische Röhrchen zu verbessern Waschen) bei 1000 rpm, 4 ° C für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen und sanft lösen Pellets durch manuelles Schütteln. </li></ol> 6. Reinigung über einen Ficoll-Gradienten <ol><li> Das Pellet mit Ficoll Medien mit einer Dichte von 1,125 g / ml, pH 7,4 und langsam Overlay 10 ml Aliquots von Ficoll Medien mit einer Dichte von 1.080, 1,060 und 1,037 g / ml. </li><li> Zentrifugieren Sie die Ficoll Gradienten bei 2400 rpm, 4 ° C für 20 min. </li></ol> 7. Islet Sammlung und Kultur <ol><li> Nach der Zentrifugation können unterschiedliche Gewebe-Komponenten durch ihre Aufteilung in der Steigung unterscheiden. </li><li> Entsorgen Sie die obere Schicht, bestehend aus Fett-und Bindegewebe. </li><li> Sorgfältig Ernte die erste Schicht der Insel Aggregate an der 1,037-1,060 g / ml Interphase. Diese Schicht enthält die reinste isolierten Inseln. Sammeln Fraktionen getrennt für effiziente Isolierung. </li><li> Sammeln Sie die zweite, weniger reine Fraktion von Inselzellen Aggregate an der 1,060-1,080 g / ml Interphase. </li><li> Verdünnen Sie die Ficoll-Gradienten, indem waschen Medien (900 ml RPMI 1640 mit 5,5 mM Glukose und 10% FBS) zu jedem konischen Rohr bis zu einem Gesamtvolumen von 50 ml. Zentrifuge bei 1000 rpm, 4 ° C für 5 min. </li><li> Verwerfen Sie den Überstand durch Absaugen. Seien Sie vorsichtig, wie das Pellet kann locker sein aufgrund der Ficoll-Gradienten. </li><li> Waschen Sie die Pellets with waschen Medien (900ml RPMI 1640 mit 5,5 mM Glucose und 10% FBS) und zentrifugieren bei 1000 rpm, 4 ° C für 5 min. Wiederholen Sie mit Inselchen Kulturmedien </li><li> Resuspendieren Inselchen in Kulturmedien und legen Sie sie in den Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C für 24-48 Stunden vor der weiteren Verarbeitung. </li></ol>

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	<li>Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+cell+lesion+in+type+2+diabetes:+there+has+to+be+a+primary+functional+abnormality.">The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality.</a> Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).</li><li>Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+abnormalities+in+the+islets+isolated+from+type+2+diabetic+subjects.">Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects.</a> Diabetes. 53, 624-632 (2004).</li><li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+isolation+of+human+pancreatic+islets.">Automated method for isolation of human pancreatic islets.</a> Diabetes. 37, 413-420 (1988).</li><li>Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets.">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45, 827-830 (1988).</li><li>Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., J&#228;ger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin+turnover+in+islets+from+type+2+diabetic+patients.">Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients.</a> Islets. 2, 30-36 (2010).</li><li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pancreatic+diabetes+(type+3c+diabetes)+underdiagnosed+and+misdiagnosed?.">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed?.</a> Diabetes Care. 31, S165-S169 (2008).</li><li>Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+disorders+and+diabetes+mellitus.">Pancreatic disorders and diabetes mellitus.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, S7-S12 (2008).</li><li>Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+type+I+diabetes+in+first-degree+relatives+using+a+combination+of+insulin,+GAD,+and+ICA512bdc/IA-2+autoantibodies.">Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies.</a> Diabetes. 45, 926-933 (1996).</li><li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition,+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1:+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation.">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li><li>Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+of+Purified+{beta}-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection.">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mit unserem Protokoll, kann das menschliche Inseln aus Pankreasgewebe von einer partiellen Pankreatektomie gesammelt isoliert werden. Der Erfolg dieses Protokoll stützt sich auf die Betreuung während ein paar kritische Punkte genommen. Zur Wahrung Beta-Zell-Lebensfähigkeit, ist es unerlässlich, dass die Probe schnell auf Eis ins Labor transportiert werden. Darüber hinaus muss die Dauer des Gewebes Verdauung empirisch nach dem Grad der Gewebe Fibrose und die enzymatische Aktivität der Medien optimiert werden. Dies gilt auch für den Grad der mechanischen Kraft manuell auf die Ricordi Kammer aufgetragen wahr. So eine gute Insel Ausbeute zu erhalten, ist das Protokoll am besten durch eine engagierte Wissenschaftler oder technische Assistentin durchgeführt. Initial Scheitern ist die Regel, es sei denn das Team ist bereits in Insel Isolation erlebt. Es gibt wesentliche Unterschiede zwischen unseren kleinen Insel Isolation Protokoll und die Standard-menschlichen Inselzellen isoliert Methode: 1) Obwohl wir Pankreasgewebe unterzogen zu mehreren Stunden der Ischämie während des chirurgischen Eingriffs zu verwenden, ist es sofort vor Ort verarbeitet. Dies steht im Gegensatz zu Bauchspeicheldrüsen explantierten von hirntoten Spendern für Pankreas / Inseltransplantation, die ischämischen bleiben für mehrere Stunden während der Zuteilung und Lieferung der Insel absperrbar. 2) Wir spritzen Kollagenase direkt in das Pankreasgewebe, während das Standard-Protokoll ist es in den Pankreasgang ziehen lassen. 3) Wir trennen die Inseln mit einem diskontinuierlichen Ficoll-Gradienten statt der Erhebung der Inseln aus einem kontinuierlichen Ficollgradienten mit einem COBE Cell-Prozessor. In Fällen, in denen die chirurgische Probe ist zu fibrotischen oder knappen zur Isolierung einer ausreichenden Zahl von Inselchen, kann Gewebe noch durch Laser Capture Mikrodissektion (LCM) 10 abgerufen werden. Dies ermöglicht Genexpression Daten aus praktisch jeder Probe gewonnen werden, auch wenn die Insel Isolierung fehlschlägt oder die Ausbeute ist sehr gering. Leider hat LCM nicht produzieren lebende Zellen für funktionelle Studien und ihre Menge ist in der Regel nicht ausreichend für Proteomanalyse. So kann die Verwendung von LCM in parallel mit unseren Kollagenaseverdau Protokoll, um die Inseln Abrufen der effektivste Weg, um chirurgische Proben zu verarbeiten. Beim Sammeln von Gewebe für Inselzellen isoliert von partiellen pancreatectomies, ist es wichtig, sorgfältig zu prüfen, die Krankengeschichte des Patienten und metabolischen Zustand. Ein teilweise Pankreatektomierten Patient konnte nach Typ 3c-Diabetes, dh Diabetes sekundäre Erkrankung der Bauchspeicheldrüse, die zu der Operation 6 beeinflusst werden. Unter den 43 teilnehmenden Patienten, die diese Operation in unserer Abteilung erfuhr im Jahr 2010, 32 Nicht-Diabetikern wurden, 5 wurden von Diabetes Typ 2 und 6 betroffen war 3c-Diabetes. Diese Daten stimmen mit früheren Studien zeigte auf gestörten Glukose-Stoffwechsel und Diabetes in ein beträchtlicher Anteil von Patienten mit Pankreaskarzinom oder chronischer Pankreatitis 6. Wir haben überlegt, Diabetes zu primären Ursprungs, wenn sie diagnostiziert wurde mindestens ein Jahr vor dem Beginn der Symptome führt zu Pankreasoperation 7. Die Konzentrationen von Antikörpern gegen Inselzellen Autoantigene sollte auch gemessen werden, um eine mögliche autoimmune Entstehung der Zuckerkrankheit 8 zu bewerten. Da ein Patient, Pankreatektomie nicht diagnostizierter Diabetes leiden konnte oder Glukose intolerant, sollten alle nicht-diabetischen Patienten eine orale Glukosetoleranztest vor der Pankreatektomie 9 angegeben werden.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><th> Ausstattung </th><th></th><th></th></tr><tr><td> 1 ml serologischen Pipette (CELLSTAR) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 604181 </td></tr><tr><td> 10 ml serologischen Pipette (CELLSTAR) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 607180 </td></tr><tr><td> 25 ml serologischen Pipette (CELLSTAR) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 760180 </td></tr><tr><td> 10 ml Spritze </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 300912 </td></tr><tr><td> 50 ml Spritze </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> 5 ml Spritze </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 309050 </td></tr><tr><td> 18 G 1,1 / 2 Needle Microlance 3 </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 304622 </td></tr><tr><td> 27 GX1 / 2 Nadel </td><td> Braun </td><td> 4658300 </td></tr><tr><td> 27 GX3 / 4 Needle Microlance 3 </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 302200 </td></tr><tr><td> 3 cm Zellkulturschale 2x2 mm Raster </td><td> Nunc </td><td> 174926 </td></tr><tr><td> 20 cm Tissue Kulturschale </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 6 cm Easy Grip Petrischale </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 351016 </td></tr><tr><td> 150 ml Vorratsflasche </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431175 </td></tr><tr><td> 250 ml Erlenmeyerkolben </td><td> Schott Duran </td><td> 21 217 36 </td></tr><tr><td> 500 ml Erlenmeyerkolben </td><td> Schott Duran </td><td> 21 217 44 </td></tr><tr><td> 250 ml Schraubverschluss konischem Boden Zentrifugenröhrchen </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> 50 ml Falcon konischen Rohr </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> 260 ml Easyflask Non-behandelten </td><td> Nunc </td><td> 156800 </td></tr><tr><td> Millex GV Filtereinheit Duropore (0,22 um) </td><td> Millipore </td><td> SLGV033RB </td></tr><tr><td> Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Durchmesser Membran, 0,22 um Porengröße, 45 mm Größe des Halses, 500 ml Volumen) </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431118 </td></tr><tr><td> Densitometer (Densito 30PX) LWE37463 </td><td> Mettler Toledo </td><td> 51324450 </td></tr><tr><td> Schnelle PES Filtereinheit 0,2 &amp;mgr; </td><td> Nalgene </td><td> 569-0020 </td></tr><tr><td> Heizwendel </td><td> Biorep Technologies Inc </td><td> HC-02 </td></tr><tr><td> Multifuge 4 KS-R </td><td> Heraeus </td><td> 75015680 </td></tr><tr><td> Pump Typ PD5206 </td><td> Heidolph </td><td> 523-52060-00-2 </td></tr><tr><td> Ricordi Kammer (Metallgewebe mit 600 pm Porendurchmesser) </td><td> Biorep Technologies Inc. </td><td> Modell 50-U-01, Serial 0503-001 </td></tr><tr><td> Vorbereitung Stehen </td><td> Biorep Technologies Inc. </td><td> 50-PS-01 </td></tr><tr><td> O-Ringe </td><td> Biorep Technologies Inc. </td><td> OR-50-U-01 </td></tr><tr><td> Siliziumnitrid Marbles (15 mm Satz von 9) </td><td> Biorep Technologies Inc. </td><td> SN-01 </td></tr><tr><td> Silicon Tubing </td><td> Tygon </td><td> R 3603 8,0 x4, 0 mm </td></tr><tr><td> Chirurgische Pinzette </td><td> Braun </td><td> BD168R </td></tr><tr><td> Chirurgische Schere (Aesculap) </td><td> Braun </td><td> BC273R </td></tr><tr><td> OLS 200 </td><td> Zuschuss </td><td> OLS 200 </td></tr><tr><th> Reagenzien </th><th></th><th></th></tr><tr><td> Collagenase -&gt; Liberase RI (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 11815032001 </td></tr><tr><td> D (+)-Glucose </td><td> Merck </td><td> 1.08337.1000 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Merck </td><td> 1.16743.1000 </td></tr><tr><td> Diphenylthiocarbazon (DTZ) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5130 </td></tr><tr><td> DNase I (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Dulbeccos 1xPBS </td><td> PAA Laboratories </td><td> H15-002 </td></tr><tr><td> Electrolytsolution E154 </td><td> Serumwerk </td><td> 00509 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (FBS) </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> Ficoll 400 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F9378 </td></tr><tr><td> Fetale Bovine Serum (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td></tr><tr><td> 2 - (4 - (2-Hydroxyethyl) - 1-Piperazinyl)-ethansulfons ‰ ure (HEPES) </td><td> Roth </td><td> 9105,3 </td></tr><tr><td> NaOH, 5 M </td><td> klinische Apotheke, Krankenhaus </td><td> - </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin (100x) </td><td> PAA Laboratories </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> Pipettaid (EXPRESS) </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 357591 </td></tr><tr><td> Potassiumchlorid </td><td> Fluka </td><td> 60132 </td></tr><tr><td> Potassiumdihydrogenphospate wasserfrei </td><td> JT Baker </td><td> 0241 </td></tr><tr><td> Potassiummonohydrogenphosphate </td><td> JT Baker </td><td> 3246-01 </td></tr><tr><td> RPMI Medium 1640 [-] D-Glucose [+] L-Glutamin </td><td> Gibco </td><td> 11879-020 </td></tr><tr><td> RPMI Medium 1640 [+] L-Glutamin </td><td> PAA Laboratories </td><td> E15-840 </td></tr><tr><td> Sodiumhydrogencarbonat </td><td> Merck </td><td> 1.06329.0500 </td></tr></tbody></table> Medien und Lösungen Dithizonlösung <ul><li> 100 mg DTZ in 10 ml DMSO und verdünnen in 40 ml PBS </li><li> Sterilfilter die Lösung (0,22 um) </li></ul> Enzymlösung <ul><li> 100 mg Liberase RI in 20 ml RPMI 1640 Medium (ohne Zusätze) </li><li> 100 mg DNase in 1 ml RPMI 1640 Medium (ohne Zusätze) </li><li> Sterilfilter die Lösung (0,22 um) und halten das Enzym auf Eis </li></ul> Wash Medien (1000ml/5.5mM Glucose) <ul><li> Lösen Sie 100 ml FBS (Hitze inaktiviert) </li><li> Add 450 ml RPMI 1640 (ohne Glukose) </li><li> Add 450 ml RPMI 1640 (11 mM Glukose) </li><li> Sterilfilter die Lösung (0,22 um) </li></ul> Islet Kulturmedien (500ml / 5,5 mM Glucose) <ul><li> Lösen Sie 10 ml 1M HEPES (pH 7,4) </li><li> 50 ml FBS </li><li> 5 ml Penicillin / Streptomycin (100x) </li><li> Add 2,75 ml 1 M Glucose-Lösung </li><li> Add 432,25 ml RPMI 1640 (ohne Glukose) </li><li> Sterilfilter die Lösung (0,22 um) </li></ul> Euro Collins-Lösung <ul><li> 4.083 g Kaliumhydrogenphosphat </li><li> 70,0 g Glukose </li><li> 2.237 g Kaliumchlorid </li><li> 14,80 g Kalium Monohydrogenphosphat </li><li> 1.680 g Natriumhydrogencarbonat </li><li> 40 ml Elektrolyt-Lösung (E 154) </li><li> pH-Wert 7,4 </li><li> Destilliertem Wasser bis zu 2000 ml </li><li> Sterilfilter die Lösung (0,22 um) </li></ul> Ficoll-Stammlösung <ul><li> Add 1000 ml Euro Collins-Lösung bis 500 g Ficoll </li><li> Add 8,94 g HEPES </li><li> Über Nacht rühren, bis Ficoll ist gelöst </li><li> pH-Wert 7,4 </li><li> Messen Sie die Dichte </li></ul> Ficoll Gradienten <ul><li> Berechnen Sie die Höhe der FBS, Euro Collins-Lösung und Ficoll Stammlösung nach der Dichte </li><li> Kombinieren Sie die 3-Lösungen und die Dichte mit einem Densitometer </li><li> Add Euro Collins-Lösung oder Ficoll-Stammlösung, bis die Dichte eingestellt </li><li> Sterilfilter die Lösung (0,22 um) und lagern bei 4 ° C </li></ul>

isolation of human islets from partially pancreatectomized patients

Untersuchungen zur Pathogenese des Typ 2 Diabetes und der Langerhans-Inseln Fehlfunktion 1 wurden durch die begrenzte Verfügbarkeit von Typ 2 Diabetes Inselchen von Organspendern 2 wurde behindert. Hier teilen wir unser Protokoll zur Isolierung von Inseln aus menschlichen Pankreasgewebe von Typ-2-Diabetikern und Nicht-Diabetikern, die partielle Pankreatektomie aufgrund unterschiedlicher Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse (gutartige oder bösartige Tumoren der Bauchspeicheldrüse, chronische Pankreatitis und Choledochus-oder Zwölffingerdarm-Tumoren) unterzogen haben gewonnen . Alle Patienten beteiligt gaben ihre Zustimmung zu dieser Studie, die auch von der lokalen Ethikkommission genehmigt worden waren. Die chirurgische Proben wurden sofort in die Pathologen, weich und wirkt gesund Pankreasgewebe für Insel Isolierung gewählt und behielt das geschädigte Gewebe zu diagnostischen Zwecken geliefert. Wir fanden, dass mehr als 1.000 Inseln zu isolieren, mussten wir mit mindestens 2 g Pankreasgewebe beginnen. Auch wichtig, um unser Protokoll war sichtlich dehnen das Gewebe bei der Injektion des Enzym-haltigen Medien und anschließend zerkleinern sie die Verdauung durch Vergrößerung der Oberfläche zu unterstützen. Zur Verlängerung der Anwendbarkeit unserer Protokoll zum gelegentlichen Fall, in dem eine große Menge (&gt; 15g) der menschlichen Pankreasgewebe ist verfügbar sind, verwendeten wir eine Ricordi Kammer (50 ml), um das Gewebe zu verdauen. Während der Verdauung, wir manuell schüttelte den Ricordi Kammer 3 mit einer Intensität, die von Probe nach seinem Niveau Gewebefibrose vielfältig. Eine diskontinuierliche Ficoll Gradient wurde dann verwendet, um die Inseln aus acinärem Gewebe zu trennen. Wir haben festgestellt, dass das Gewebe Pellet sollte klein genug sein, um homogen in Ficoll Medium mit einer Dichte von 1,125 g / ml resuspendiert. Nach der Isolierung wir die Inseln unter stressfreien Bedingungen (kein Schütteln oder Drehen) mit 5% CO 2 bei 37 ° C kultiviert für mindestens 48 h, um ihre funktionelle Wiederherstellung zu ermöglichen. Die weit verbreitete Anwendung von unserem Protokoll und seine Zukunft verbessern könnte damit die rechtzeitige Ernte von großen Mengen von menschlichen Inseln von diabetischen und klinisch abgestimmt nicht-diabetischen Patienten, stark fortschreitenden Typ-2-Diabetes-Forschung.

Unser Protokoll ergab einen Durchschnitt von ca. 500 Inseln pro Gramm Pankreasgewebe, obwohl diese sehr stark zwischen Präparate in erster Linie auf Unterschiede in der Fibrose und Kollagenase-Aktivität unterschiedlich. Wir erreichten&gt; 90% Reinheit Insel durch erste Färbung mit Dithizon während Gewebe Verarbeitung, dann Handlese sie 24 Stunden nach der Isolierung. Zur Bestimmung der Qualität des gereinigten Inseln, testeten wir für 25 mM Glukose-stimulierte Insulinsekretion unter statischen Bedingungen für 2 Stunden. Wir fanden Insulinsekretion vergleichbar mit der von Inseln aus ECIT Insel Isolation und Transplantationszentren erhalten. Wie kleine Inseln aus teilweise Pankreatektomierten Bauchspeicheldrüsen isoliert sind nicht für die Insel-Transplantation, Prüfung der gesamten IEQ wurde nicht als ein kritischer Faktor sein soll. Wichtig ist, aktiviert unsere Methode uns Inselchen für funktionelle Untersuchungen zu isolieren von 25 partiellen Pankreatektomierten zwischen 2005 und 2008 5. Diese Inseln wurden für die Glukose-stimulierte Insulinsekretion und spezifische Protein-Expression mittels Western Blot und Immunhistochemie analysiert. Inseln aus teilweise pancreatecomized Bauchspeicheldrüsen isoliert könnte auch genutzt werden, um Gen-und Proteinexpression Profile, ultrastrukturelle Erscheinungsbild und funktionellen Antworten von nicht-diabetischen und diabetischen Inseln zu vergleichen. Da es mehr Patienten partielle Pankreatektomie als es Organspender sind, könnte unser Protokoll erlauben genug Proben und Daten für zuverlässige statistische Analysen gesammelt werden.

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Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Die Versorgung von Typ-2-Diabetes Inseln für die Forschung ist nicht ausreichend. Hier teilen wir unser Protokoll zur Isolierung von Inseln aus Patienten partielle Pankreatektomie. Dieser Ansatz stellt einen einzigartigen Ort für den Erhalt von kleinen Inseln von Typ 2 Diabetes und klinisch abgestimmt nicht-diabetischen Patienten in ausreichender Zahl für die Grundlagenforschung und klinische Studien.

Isolierung humaner Inselzellen aus teilweise Pankreatektomierten

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

isolation-of-human-islets-from-partially-pancreatectomized-patients

Research

JoVE Journal

Medicine

15.9K Aufrufe.  University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden. Die Versorgung von Typ-2-Diabetes Inseln für die Forschung ist nicht ausreichend. Hier teilen wir unser Protokoll zur Isolierung von Inseln aus Patienten partielle Pankreatektomie. Dieser Ansatz stellt einen einzigartigen Ort für den Erhalt von kleinen Inseln von Typ 2 Diabetes und klinisch abgestimmt nicht-diabetischen Patienten in ausreichender Zahl für die Grundlagenforschung und klinische Studien.

Serie: Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

Färbeprotokollen for Human Pankreasinseln

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Forschung

Medizin

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Dynamic Visual Tests to Identify and Quantify Visual Damage and Repair Following Demyelination in Optic Neuritis Patients

In order to follow optic neuritis patients and evaluate the effectiveness of their treatment, a handy, accurate and quantifiable tool is required to assess changes in myelination at the central nervous system (CNS). However, standard measurements, including routine visual tests and MRI scans, are not sensitive enough for this purpose. We present two visual tests addressing dynamic monocular and binocular functions which may closely associate with the extent of myelination along visual pathways. These include Object From Motion (OFM) extraction and Time-constrained stereo protocols. In the OFM test, an array of dots compose an object, by moving the dots within the image rightward while moving the dots outside the image leftward or vice versa. The dot pattern generates a camouflaged object that cannot be detected when the dots are stationary or moving as a whole. Importantly, object recognition is critically dependent on motion perception. In the Time-constrained Stereo protocol, spatially disparate images are presented for a limited length of time, challenging binocular 3-dimensional integration in time. Both tests are appropriate for clinical usage and provide a simple, yet powerful, way to identify and quantify processes of demyelination and remyelination along visual pathways. These protocols may be efficient to diagnose and follow optic neuritis and multiple sclerosis patients.
In the diagnostic process, these protocols may reveal visual deficits that cannot be identified via current standard visual measurements. Moreover, these protocols sensitively identify the basis of the currently unexplained continued visual complaints of patients following recovery of visual acuity. In the longitudinal follow up course, the protocols can be used as a sensitive marker of demyelinating and remyelinating processes along time. These protocols may therefore be used to evaluate the efficacy of current and evolving therapeutic strategies, targeting myelination of the CNS.

Object From Motion (OFM) and Time-constrained stereo protocols are sensitive tools to identify monocular and binocular dynamic visual function deficits, which are uniquely affected in optic neuritis patients. Furthermore, these tests may be used as quantitative noninvasive tools to assess the extent of myelination along visual pathways.

Dynamische Visuelle Tests zur Identifizierung und Quantifizierung von Visual Schäden und Reparaturen Nach Demyelinisierung in Optikusneuritis Patienten

In order to follow optic neuritis patients and evaluate the effectiveness of their treatment, a handy, accurate and quantifiable tool is required to ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolierung von Krebs Stammzellen aus menschlichen Prostatakrebs-Proben

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Full-root Aortic Valve Replacement by Stentless Aortic Xenografts in Patients with Small Aortic Roots

In patients with small aortic roots who need an aortic valve replacement with biological valve substitutes, the implantation of the stented pericardial valve might not meet the functional needs. The implantation of a too-small stented pericardial valve, leading to an effective orifice area indexed to a body surface area less than 0.85 cm2/m2, is regarded as prosthesis-patient mismatch (PPM). A PPM negatively affects the regression of left ventricular hypertrophy and thus the normalization of left ventricular function and the alleviation of symptoms. Persistent left ventricular hypertrophy is associated with an increased risk of arrhythmias and sudden cardiac death. In the case of predictable PPM, there are three options: 1) accept the PPM resulting from the implantation of a stented pericardial valve when comorbidities of the patient forbid the more technically demanding operative technique of implanting a larger prosthesis, 2) enlarge the aortic root to accommodate a larger stented valve substitute, or 3) implant a stentless biological valve or a homograft. Compared to classical aortic valve replacement with stented pericardial valves, the full-root implantation of stentless aortic xenografts offers the possibility of implanting a 3-4 mm larger valve in a given patient, thus allowing significant reduction in transvalvular gradients. However, a number of cardiac surgeons are reluctant to transform a classical aortic valve replacement with stented pericardial valves into the more technically challenging full-root implantation of stentless aortic xenografts. Given the potential hemodynamic advantages of stentless aortic xenografts, we have adopted full-root implantation to avoid PPM in patients with small aortic roots necessitating an aortic valve replacement. Here, we describe in detail a technique for the full-root implantation of stentless aortic xenografts, with emphasis on the management of the proximal suture line and coronary anastomoses. Limitations of this technique and alternative options are discussed.

Full-root aortic valve replacement by stentless aortic xenograft is a viable option in patients with small aortic roots. We describe, a technique for the full-root implantation of stentless aortic xenografts, with emphasis on the management of the proximal suture line and coronary anastomoses, and discuss its limitations and alternative options.

Vollwurzel Aortenklappenaustausch durch stentless Aortic Xenotransplantate bei Patienten mit kleinen Aortenwurzeln

In patients with small aortic roots who need an aortic valve replacement with biological valve substitutes, the implantation of the stented pericardial ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraportal Transplantation der Bauchspeicheldrüse Inselchen im Mausmodell

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...