Vogliamo ringraziare i nostri tanti colleghi che hanno fornito aiuto, pareri e contributi critici nelle varie fasi del progetto. La produzione di questo articolo il video è stato sostenuto con i fondi del ministero tedesco dell&#39;Istruzione e della ricerca (BMBF) al Centro tedesco per Diabetes Research (DZD, <a href="http://www.dzd-ev.de">http://www.dzd-ev.de</a> ), IMIDIA ( <a href="http://www.imidia.org">http://www . imidia.org</a> ) e l&#39;Ospedale Universitario Carl Gustav Carus a Dresda University of Technology. La ricerca ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7/2007-2013) per l&#39;iniziativa medicina innovativa nell&#39;ambito della convenzione di sovvenzione n ° 115005.

1. Collezione di tessuti del pancreas in sala operatoria <ol><li> Il chirurgo esegue una resezione parziale del pancreas. </li><li> Dopo aver posizionato il campione del pancreas in una scatola su ghiaccio, lo consegnerà immediatamente al patologo. </li></ol> 2. Selezione dei tessuti per l&#39;isolamento delle isole <ol><li> Il patologo seleziona tessuto che appare morbida e sana, mantenendo il tessuto danneggiato per scopi diagnostici. Campioni di tessuto fibrotico e offrendo meno di 2 g di tessuto utilizzabile sono esclusi dalla isolamento delle isole. </li><li> Immergere il tessuto pancreatico in soluzione di Euro Collins e fornire sul ghiaccio al laboratorio. </li></ol> 3. Isolamento di isole umane <ol><li> Pesare il tessuto pancreatico, poi metterlo in un piatto da 10 cm. </li><li> Mettere 150 ml RPMI dei media in un pallone da 500 ml. </li><li> In un pallone da 250 ml, preparare la soluzione enzima digestivo, combinando 130 ml RPMI media con 100 mg / ml di DNasi e 20 ml di RI Liberase 5mg/ml. Disegna 10 ml di questa soluzione in una siringa per iniettare il tessuto pancreatico. </li><li> Iniettare la soluzione di enzima digestivo nel tessuto pancreatico, al fine di distendere la omogeneo. Se questo è impedito da fibrosi, la digestione probabilmente fallire. Poi, tritare il tessuto in ~ 4 mm 3 pezzi su ghiaccio. </li></ol> 4. Pancreas umano circuito digestione <ol><li> Montare il circuito digestione, come mostrato nella Figura 1. La direzione del flusso nella camera di Ricordi è in basso e fuori nella parte alta della camera. </li><li> Aggiungere la restante soluzione enzima digestivo al pallone da 500 ml fino ad un volume totale di 300 ml e inserire un termometro. </li><li> Trasferire il tessuto pancreatico nella camera, inserire le maglie (pori di diametro: 600 micron) e tre Marmi nitruro di silicio (diametro: 15 mm), chiudere la camera e avviare la pompa con il flusso fissato a 140 ml / min. </li><li> Quando la temperatura del circuito raggiunge i 37 ° C, inizio i tempi e periodicamente prelevare campioni per determinare quando interrompere la digestione. Colorazione con ditizone (2 mg / ml) permette la visualizzazione di isolette microscopiche all&#39;interno del tessuto digerito 4. </li><li> Una volta le isole sono separate dal tessuto acinare circostante, in modo rapido fermare la digestione ponendo la batteria di riscaldamento sul ghiaccio e aggiungendo 200 ml di supporti lavaggio a freddo (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) al circuito. </li><li> Raccogliere la soluzione isolotto in 250 ml provette coniche come si esce dalla provetta. Continuare fino a quando il circuito è vuoto. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2962/2962fig1.jpg" /> Figura 1. L&#39;uomo circuito digestione pancreas Il pancreas umano circuito digestione comprende una camera di Ricordi che contiene mesh (pori di diametro: 600 micron) e tre palline di nitruro di silicio (diametro: 15 mm). Uscita dalla camera è spinto al pallone raccolta tessuto dalla pompa peristaltica (140 ml / min). Le frecce indicano la direzione del flusso. Una temperatura ottimale per la digestione enzimatica viene mantenuta immergendo la bobina di riscaldamento in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. 5. Lavaggio post-digestione <ol><li> Centrifuga da 250 ml provette coniche contenente la soluzione isolotto a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante, risospendere il pellet isolotto a lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) e distribuirlo in frazioni pari a 50 ml provette coniche. (Opzionale:. Distribuire in tubi conici aggiuntive per migliorare il lavaggio) Centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. </li><li> Gettare il surnatante e delicatamente allentare pellet agitando manuale. </li></ol> 6. Purificazione su un gradiente di Ficoll <ol><li> Risospendere il pellet con Ficoll i media ad una densità di 1,125 g / ml, pH 7.4 e lentamente sovrapposizione di 10 ml di Ficoll mezzi con densità di 1,080, 1,060 e 1,037 g / ml. </li><li> Centrifugare i gradienti di Ficoll a 2400 rpm, 4 ° C per 20 min. </li></ol> 7. Isolotto Raccolta e Cultura <ol><li> Dopo la centrifugazione, componenti del tessuto differenti si distinguono per la loro scomposizione del gradiente. </li><li> Eliminare lo strato superiore costituito da grassi e tessuto connettivo. </li><li> Accuratamente raccolto il primo strato di inerti isolotto alla g / ml 1,037-1,060 interfase. Questo strato contiene le isole più puro isolato. Raccogliere separatamente le frazioni per l&#39;isolamento efficiente. </li><li> Raccogliere la seconda frazione meno puro di aggregati isolotto alla g / ml 1,060-1,080 interfase. </li><li> Diluire il gradiente di Ficoll con l&#39;aggiunta di lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) a ciascuna provetta conica fino ad un volume totale di 50 ml. Centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante tramite aspirazione. Usare la stessa attenzione il pellet potrebbe essere sciolto a causa del gradiente di Ficoll. </li><li> Lavare il wi pellet° lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) e centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. Ripetere utilizzando terreni di coltura isolotto </li><li> Risospendere le isolette in terreni di coltura e metterli in incubatore al 5% di CO 2 a 37 ° C per 24-48 ore prima di ulteriori elaborazioni. </li></ol>

<ol>
	<li>Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+cell+lesion+in+type+2+diabetes:+there+has+to+be+a+primary+functional+abnormality.">The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality.</a> Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).</li><li>Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+abnormalities+in+the+islets+isolated+from+type+2+diabetic+subjects.">Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects.</a> Diabetes. 53, 624-632 (2004).</li><li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+isolation+of+human+pancreatic+islets.">Automated method for isolation of human pancreatic islets.</a> Diabetes. 37, 413-420 (1988).</li><li>Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets.">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45, 827-830 (1988).</li><li>Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., J&#228;ger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin+turnover+in+islets+from+type+2+diabetic+patients.">Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients.</a> Islets. 2, 30-36 (2010).</li><li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pancreatic+diabetes+(type+3c+diabetes)+underdiagnosed+and+misdiagnosed?.">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed?.</a> Diabetes Care. 31, S165-S169 (2008).</li><li>Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+disorders+and+diabetes+mellitus.">Pancreatic disorders and diabetes mellitus.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, S7-S12 (2008).</li><li>Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+type+I+diabetes+in+first-degree+relatives+using+a+combination+of+insulin,+GAD,+and+ICA512bdc/IA-2+autoantibodies.">Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies.</a> Diabetes. 45, 926-933 (1996).</li><li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition,+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1:+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation.">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li><li>Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+of+Purified+{beta}-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection.">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Utilizzando il nostro protocollo, isole umane può essere isolato dal tessuto pancreatico prelevato da un pancreatectomia parziale. Il successo di questo protocollo si basa sulla cura posta nella alcuni punti critici. Per preservare la vitalità delle cellule beta, è essenziale che il campione da trasportare rapidamente sul ghiaccio al laboratorio. Inoltre, la durata della digestione dei tessuti deve essere ottimizzata empiricamente a seconda del grado di fibrosi dei tessuti e l&#39;attività enzimatica dei media. Questo vale anche per il grado di forza meccanica applicata manualmente alla camera di Ricordi. In tal modo di ottenere un buon rendimento isolotto, il protocollo è meglio eseguita da uno scienziato dedicato o assistente tecnico. Errore iniziale è la norma a meno che la squadra è già sperimentato in isolamento isole. Ci sono differenze fondamentali tra il nostro protocollo isolotto isolamento e lo standard umano metodo di isolamento delle isole: 1) Anche se usiamo tessuto pancreatico sottoposto a diverse ore di ischemia durante la procedura chirurgica, viene immediatamente trasformato in loco. Questo è in contrasto con pancreas espiantati da donatori in morte cerebrale per il pancreas / trapianto di isole, che rimangono ischemico per diverse ore durante l&#39;assegnazione e la consegna alla struttura isolamento delle isole. 2) Noi collagenasi iniettare direttamente nel tessuto pancreatico, mentre il protocollo standard è quello di infondere in dotto pancreatico. 3) Abbiamo separato le isole con un gradiente discontinuo Ficoll invece di raccogliere le isolette da un gradiente Ficoll continuo utilizzando un processore COBE cellula. Nei casi in cui il campione chirurgico è troppo fibrotica o scarsa per isolare un numero adeguato di isolotti, il tessuto può essere ancora recuperato la cattura microdissezione laser (LCM) 10. Questo permette ai dati di espressione genica da recuperare praticamente ogni esemplare, anche se l&#39;isolamento delle isole non riesce o la resa è molto bassa. Purtroppo, LCM non produce le cellule viventi per gli studi funzionali e il loro ammontare è di solito insufficiente per l&#39;analisi proteomica. Così, con LCM in parallelo con il nostro protocollo collagenasi digestione per recuperare le isole possono essere il modo più efficace al processo di campioni chirurgici. Quando si raccolgono i tessuti per l&#39;isolamento delle isole da pancreatectomies parziale, è importante esaminare attentamente la storia clinica del paziente e stato metabolico. Un paziente parzialmente pancreatectomized potrebbero essere interessati dal tipo 3c diabete, il diabete secondario cioè al disordine del pancreas porta alla chirurgia 6. Tra i 43 pazienti partecipanti che hanno subito questo intervento nel nostro reparto nel 2010, 32 erano non-diabetici, 5 erano affetti da diabete di tipo 2 e 6 avevano il diabete di tipo 3c. Questi dati concordano con gli studi precedenti che punta al metabolismo del glucosio e diabete in una frazione considerevole di pazienti affetti da cancro al pancreas o pancreatite cronica 6. Abbiamo considerato il diabete sia di origine primaria, se è stato diagnosticato da almeno un anno prima della comparsa dei sintomi principali della chirurgia pancreatica 7. I livelli di anticorpi contro l&#39;isolotto autoantigeni deve essere misurato per valutare un potenziale origine autoimmune del diabete 8. Perché un paziente sottoposto ad pancreatectomia potrebbe soffrire di diabete non diagnosticato o essere intolleranti al glucosio, tutti i pazienti non diabetici devono assumere un test orale di tolleranza al glucosio prima della pancreatectomia 9.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><th> Attrezzatura </th><th></th><th></th></tr><tr><td> 1 ml pipetta sierologica (Cellstar) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 604181 </td></tr><tr><td> 10 ml pipetta sierologica (Cellstar) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 607180 </td></tr><tr><td> 25 ml pipetta sierologica (Cellstar) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 760180 </td></tr><tr><td> Siringa da 10 ml </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 300912 </td></tr><tr><td> Siringa da 50 ml </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Siringa da 5 ml </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 309050 </td></tr><tr><td> 18 G 1,1 / 2 Ago Microlance 3 </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 304622 </td></tr><tr><td> 27 GX1 / 2 aghi </td><td> Braun </td><td> 4658300 </td></tr><tr><td> 27 GX3 / 4 Microlance dell&#39;ago 3 </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 302200 </td></tr><tr><td> 3 centimetri coltura cellulare piatto 2x2 mm griglia </td><td> Nunc </td><td> 174926 </td></tr><tr><td> 20 centimetri tessuto piatto cultura </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 6 centimetri piatto facile presa petri </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 351016 </td></tr><tr><td> 150 ml di stoccaggio bottiglia </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431175 </td></tr><tr><td> 250 ml beute </td><td> Schott Duran </td><td> 217 21 36 </td></tr><tr><td> 500 ml beute </td><td> Schott Duran </td><td> 217 21 44 </td></tr><tr><td> 250 ml Tappo a vite conica inferiore provetta </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> 50 ml Falcon conica del tubo </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> 260 ml Easyflask non trattati </td><td> Nunc </td><td> 156800 </td></tr><tr><td> Millex GV Filtro Unità Duropore (0,22 micron) </td><td> Millipore </td><td> SLGV033RB </td></tr><tr><td> Bottiglia vuoto Top filtro (PES 70 millimetri Diametro Membran, 0,22 micron dimensione dei pori, 45 collo di dimensione mm, 500 ml) </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431118 </td></tr><tr><td> Densitometro (Densito 30PX) LWE37463 </td><td> Mettler Toledo </td><td> 51324450 </td></tr><tr><td> Veloce Unità PES filtro 0,2 micron </td><td> Nalgene </td><td> 569-0020 </td></tr><tr><td> Riscaldamento Coil </td><td> BioRep Technologies Inc </td><td> HC-02 </td></tr><tr><td> Multifuge 4 KS-R </td><td> Heraeus </td><td> 75015680 </td></tr><tr><td> Pompa Tipo PD5206 </td><td> Heidolph </td><td> 523-52060-00-2 </td></tr><tr><td> Ricordi camera (rete metallica con 600 micron di diametro dei pori) </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> Modello 50-U-01, Serial 0503-001 </td></tr><tr><td> Preparazione stand </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> 50-PS-01 </td></tr><tr><td> O-Ring </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> O-50-U-01 </td></tr><tr><td> Marmi nitruro di silicio (15 mm di serie 9) </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> SN-01 </td></tr><tr><td> Tubi in silicone </td><td> Tygon </td><td> R 3603 8,0 X4, 0 mm </td></tr><tr><td> Pinze chirurgiche </td><td> Braun </td><td> BD168R </td></tr><tr><td> Forbici chirurgiche (Aesculap) </td><td> Braun </td><td> BC273R </td></tr><tr><td> Bagnomaria OLS 200 </td><td> Concedere </td><td> OLS 200 </td></tr><tr><th> Reagenti </th><th></th><th></th></tr><tr><td> Collagenasi -&gt; RI Liberase (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 11815032001 </td></tr><tr><td> D (+)-glucosio </td><td> Merck </td><td> 1.08337.1000 </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td> Merck </td><td> 1.16743.1000 </td></tr><tr><td> Diphenylthiocarbazone (DTZ) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5130 </td></tr><tr><td> DNasi I (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Dulbeccos 1xPBS </td><td> PAA Laboratori </td><td> H15-002 </td></tr><tr><td> Electrolytsolution E154 </td><td> Serumwerk </td><td> 00509 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FBS) </td><td> PAA Laboratori </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> Ficoll 400 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F9378 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td></tr><tr><td> 2 - (4 - (2-idrossietil) - 1-piperazinyl)-ethansulfons ‰ URE (HEPES) </td><td> Roth </td><td> 9105,3 </td></tr><tr><td> NaOH, 5 M </td><td> farmacia clinica, ospedale </td><td> - </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina (100x) </td><td> PAA Laboratori </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> Pipettaid (EXPRESS) </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 357591 </td></tr><tr><td> Potassiumchlorid </td><td> Fluka </td><td> 60132 </td></tr><tr><td> Potassiumdihydrogenphospate anidro </td><td> JT Baker </td><td> 0241 </td></tr><tr><td> Potassiummonohydrogenphosphate </td><td> JT Baker </td><td> 3246-01 </td></tr><tr><td> RPMI Media 1640 [-] D-glucosio [+] L-Glutammina </td><td> Gibco </td><td> 11879-020 </td></tr><tr><td> RPMI Media 1640 [+] L-Glutammina </td><td> PAA Laboratori </td><td> E15-840 </td></tr><tr><td> Sodiumhydrogencarbonat </td><td> Merck </td><td> 1.06329.0500 </td></tr></tbody></table> Mezzi di comunicazione e soluzioni Ditizone Soluzione <ul><li> DTZ Sciogliere 100 mg in 10 ml di DMSO e diluire in 40 ml di PBS </li><li> Filtro sterile la soluzione (0,22 micron) </li></ul> Soluzione enzima <ul><li> Sciogliere 100 RI Liberase mg in 20 ml di RPMI mezzi di comunicazione 1640 (senza supplementi) </li><li> Sciogliere 100 mg in 1 ml DNasi RPMI 1640 i media (senza supplementi) </li><li> Filtro sterile la soluzione (0,22 micron) e mantenere l&#39;enzima su ghiaccio </li></ul> Lavare i media (1000ml/5.5mM glucosio) <ul><li> Sciogliere 100 ml di FBS (inattivato con il calore) </li><li> Aggiungere 450 ml di RPMI 1640 (senza glucosio) </li><li> Aggiungere 450 ml di RPMI 1640 (11 mM glucosio) </li><li> Filtro sterile la soluzione (0,22 micron) </li></ul> Isolotto cultura dei media (500ml / 5,5 mM glucosio) <ul><li> Si sciolgono 10 HEPES ml 1M (pH 7,4) </li><li> Aggiungere 50 ml di FBS </li><li> Aggiungere 5 ml di penicillina / streptomicina (100x) </li><li> Aggiungere 2,75 ml 1 di soluzione glucosata al M </li><li> Aggiungi 432,25 ml RPMI 1640 (senza glucosio) </li><li> Filtro sterile la soluzione (0,22 micron) </li></ul> Euro Collins Soluzione <ul><li> 4.083 g di potassio hydrogenphosphate </li><li> 70,0 g di glucosio </li><li> 2.237 g di cloruro di potassio </li><li> 14,80 g di potassio monohydrogenphosphate </li><li> 1.680 g di sodio bicarbonato </li><li> 40 ml di soluzione elettrolitica (E 154) </li><li> pH 7,4 </li><li> Aggiungere acqua distillata fino a 2000 ml </li><li> Filtro sterile la soluzione (0,22 micron) </li></ul> Ficoll Soluzione <ul><li> Aggiungere 1000 ml di soluzione di Euro Collins a 500 g Ficoll </li><li> Aggiungere 8,94 g HEPES </li><li> Mescolare fino a quando una notte Ficoll è risolto </li><li> pH 7,4 </li><li> Misurare la densità </li></ul> Ficoll gradienti <ul><li> Calcolare la quantità di FBS, Euro Solution Collins e soluzione stock Ficoll in base alla densità </li><li> Combina le 3 soluzioni e misurare la densità con un densitometro </li><li> Aggiungi Euro Collins soluzione o soluzione stock Ficoll prima che la densità viene regolata </li><li> Filtro sterile la soluzione (0,22 micron) e conservare a 4 ° C </li></ul>

isolation of human islets from partially pancreatectomized patients

Indagini sulla patogenesi del diabete di tipo 2 e le isole di Langerhans malfunzionamento 1 sono stati ostacolati dalla limitata disponibilità di isolette con diabete di tipo 2 da donatori di organi 2. Qui condividiamo il nostro protocollo per isolare dal tessuto isole pancreatiche umane ottenute da diabete di tipo 2 e pazienti non diabetici che hanno subito pancreatectomia parziale a causa di diverse malattie del pancreas (tumori benigni o maligni del pancreas, pancreatite cronica, e del dotto biliare comune o tumori duodenali) . Tutti i pazienti coinvolti hanno dato il loro consenso a questo studio, che era stato approvato dal comitato etico locale. I campioni chirurgici sono stati immediatamente consegnati al patologo che hanno selezionato morbido e sano tessuto pancreatico che appaiono per l&#39;isolamento delle isole, mantenendo il tessuto danneggiato per scopi diagnostici. Abbiamo scoperto che per isolare più di 1.000 isole, abbiamo dovuto iniziare con almeno 2 g di tessuto pancreatico. Anche essenziale per il nostro protocollo è stato quello di distendere visibilmente il tessuto quando si somministra l&#39;enzima contenente i media e successivamente macinata per aiutare la digestione, aumentando la superficie. Per estendere l&#39;applicabilità del nostro protocollo di includere il caso in cui occasionalmente una quantità di grandi dimensioni (&gt; 15 g) di tessuto pancreatico umano è disponibile, abbiamo usato una camera di Ricordi (50 ml) per digerire il tessuto. Durante la digestione, si scosse manualmente la camera di Ricordi 3 a un&#39;intensità che varia da campione in base al suo livello di fibrosi tissutale. Un gradiente discontinuo Ficoll è stato poi utilizzato per separare le isolette dal tessuto acinare. Abbiamo notato che il precipitato di tessuto dovrebbe essere abbastanza piccolo da essere omogeneamente risospeso in medium Ficoll con una densità di 1,125 g / ml. Dopo l&#39;isolamento, abbiamo colto gli isolotti in condizioni di stress (senza agitazione o rotazione) con il 5% CO 2 a 37 ° C per almeno 48 ore al fine di facilitare il loro recupero funzionale. Applicazione diffusa del nostro protocollo e il suo miglioramento futuro potrebbe consentire la raccolta puntuale di grandi quantità di isole umane da diabetici e clinicamente abbinati soggetti non diabetici, notevolmente avanzando la ricerca sul diabete di tipo 2.

Il nostro protocollo ha dato una media di circa 500 isolotti per grammo di tessuto pancreatico, anche se questo varia notevolmente tra i preparati in gran parte dovuta a differenze di fibrosi e di attività collagenasi. Abbiamo raggiunto la purezza isolotto&gt; 90% dalla colorazione prima con ditizone durante la lavorazione dei tessuti, poi 24 ore dopo la raccolta manuale isolamento. Per determinare la qualità delle isole purificate, abbiamo testato per 25 mM glucosio-stimolata la secrezione di insulina in condizioni statiche per 2 ore. Abbiamo trovato la secrezione di insulina paragonabile a quella di isolotti ottenuto dall&#39;isolamento ECIT isole e centri di trapianto. Come isolette isolate dal pancreas parzialmente pancreatectomized non sono stati pensati per il trapianto di isole, la valutazione della IEQ totale non è stato considerato un fattore critico. È importante sottolineare che il nostro metodo ci ha permesso di isolare isolotti per gli studi funzionali da 25 pazienti parziale pancreatectomized tra il 2005 e 2008 5. Queste isole sono stati analizzati per il glucosio-stimolata la secrezione di insulina e di espressione delle proteine ​​specifiche da western blotting ed immunoistochimica. Isolette isolate da parte pancreatecomized pancreas potrebbe anche essere utilizzato per confrontare profili di espressione genica e proteica, l&#39;aspetto ultrastrutturale e le risposte funzionali di isole non-diabetici e diabetici. Perché ci sono più pazienti sottoposti a pancreatectomia parziali che ci sono donatori di organi, il nostro protocollo potrebbe consentire abbastanza campioni e dati da raccogliere per una ben fondata analisi statistica.

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Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

La fornitura di diabete di tipo 2 isolotti per la ricerca è insufficiente. Qui condividiamo il nostro protocollo per isolare isolotti da pazienti sottoposti a pancreatectomia parziale. Questo approccio rappresenta un luogo unico per l&#39;ottenimento di isolotti da diabete di tipo 2 e clinicamente abbinati soggetti non diabetici ed in numero sufficiente per gli studi di base e clinica.

Isolamento di isole umane da pazienti parzialmente Pancreatectomized

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

isolation-of-human-islets-from-partially-pancreatectomized-patients

Research

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15.9K Views.  University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden. La fornitura di diabete di tipo 2 isolotti per la ricerca è insufficiente. Qui condividiamo il nostro protocollo per isolare isolotti da pazienti sottoposti a pancreatectomia parziale. Questo approccio rappresenta un luogo unico per l'ottenimento di isolotti da diabete di tipo 2 e clinicamente abbinati soggetti non diabetici ed in numero sufficiente per gli studi di base e clinica.

Video: Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

Protocolli di colorazione di isole pancreatiche umane

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

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Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Dynamic Visual Tests to Identify and Quantify Visual Damage and Repair Following Demyelination in Optic Neuritis Patients

In order to follow optic neuritis patients and evaluate the effectiveness of their treatment, a handy, accurate and quantifiable tool is required to assess changes in myelination at the central nervous system (CNS). However, standard measurements, including routine visual tests and MRI scans, are not sensitive enough for this purpose. We present two visual tests addressing dynamic monocular and binocular functions which may closely associate with the extent of myelination along visual pathways. These include Object From Motion (OFM) extraction and Time-constrained stereo protocols. In the OFM test, an array of dots compose an object, by moving the dots within the image rightward while moving the dots outside the image leftward or vice versa. The dot pattern generates a camouflaged object that cannot be detected when the dots are stationary or moving as a whole. Importantly, object recognition is critically dependent on motion perception. In the Time-constrained Stereo protocol, spatially disparate images are presented for a limited length of time, challenging binocular 3-dimensional integration in time. Both tests are appropriate for clinical usage and provide a simple, yet powerful, way to identify and quantify processes of demyelination and remyelination along visual pathways. These protocols may be efficient to diagnose and follow optic neuritis and multiple sclerosis patients.
In the diagnostic process, these protocols may reveal visual deficits that cannot be identified via current standard visual measurements. Moreover, these protocols sensitively identify the basis of the currently unexplained continued visual complaints of patients following recovery of visual acuity. In the longitudinal follow up course, the protocols can be used as a sensitive marker of demyelinating and remyelinating processes along time. These protocols may therefore be used to evaluate the efficacy of current and evolving therapeutic strategies, targeting myelination of the CNS.

Object From Motion (OFM) and Time-constrained stereo protocols are sensitive tools to identify monocular and binocular dynamic visual function deficits, which are uniquely affected in optic neuritis patients. Furthermore, these tests may be used as quantitative noninvasive tools to assess the extent of myelination along visual pathways.

I test visivi dinamici per identificare e quantificare eventuali danni visivi e riparazione seguito demielinizzazione nella neurite ottica pazienti

In order to follow optic neuritis patients and evaluate the effectiveness of their treatment, a handy, accurate and quantifiable tool is required to ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolamento di cancro cellule staminali da campioni umani di cancro alla prostata

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to extravasate and form a secondary niche.&#160;The extravasation of tumor cells from the blood vascular system can be studied using endothelial cells (ECs) and tumor cells obtained from different cell lines.&#160;Initial studies were conducted using static conditions but it has been well documented that ECs behave differently under physiological flow conditions.&#160;Therefore, different flow chamber assemblies are currently being used to studying cancer cell interactions with ECs.&#160;Current flow chamber assemblies offer reproducible results using either different cell lines or fluid at different shear stress conditions.&#160;However, to observe and study interactions with rare cells such as circulating tumor cells (CTCs), certain changes are required to be made to the conventional flow chamber assembly.&#160;CTCs are a rare cell population among millions of blood cells. Consequently, it is difficult to obtain a pure population of CTCs.&#160;Contamination of CTCs with different types of cells normally found in the circulation is inevitable using present enrichment or depletion techniques.&#160;In the present report, we describe a unique method to fluorescently label circulating prostate cancer cells and study their interactions with ECs in a self-assembled flow chamber system.&#160;This technique can be further applied to observe interactions between prostate CTCs and any protein of interest.

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Our report describes a unique method to visualize and analyze CTC/EC interactions in prostate cancer under physiological flow conditions.

Nel metodo in vitro per osservare le interazioni E-selectina-mediata Tra prostata cellule tumorali circolanti derivate da pazienti e Cellule endoteliali umane

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Full-root Aortic Valve Replacement by Stentless Aortic Xenografts in Patients with Small Aortic Roots

In patients with small aortic roots who need an aortic valve replacement with biological valve substitutes, the implantation of the stented pericardial valve might not meet the functional needs. The implantation of a too-small stented pericardial valve, leading to an effective orifice area indexed to a body surface area less than 0.85 cm2/m2, is regarded as prosthesis-patient mismatch (PPM). A PPM negatively affects the regression of left ventricular hypertrophy and thus the normalization of left ventricular function and the alleviation of symptoms. Persistent left ventricular hypertrophy is associated with an increased risk of arrhythmias and sudden cardiac death. In the case of predictable PPM, there are three options: 1) accept the PPM resulting from the implantation of a stented pericardial valve when comorbidities of the patient forbid the more technically demanding operative technique of implanting a larger prosthesis, 2) enlarge the aortic root to accommodate a larger stented valve substitute, or 3) implant a stentless biological valve or a homograft. Compared to classical aortic valve replacement with stented pericardial valves, the full-root implantation of stentless aortic xenografts offers the possibility of implanting a 3-4 mm larger valve in a given patient, thus allowing significant reduction in transvalvular gradients. However, a number of cardiac surgeons are reluctant to transform a classical aortic valve replacement with stented pericardial valves into the more technically challenging full-root implantation of stentless aortic xenografts. Given the potential hemodynamic advantages of stentless aortic xenografts, we have adopted full-root implantation to avoid PPM in patients with small aortic roots necessitating an aortic valve replacement. Here, we describe in detail a technique for the full-root implantation of stentless aortic xenografts, with emphasis on the management of the proximal suture line and coronary anastomoses. Limitations of this technique and alternative options are discussed.

Full-root aortic valve replacement by stentless aortic xenograft is a viable option in patients with small aortic roots. We describe, a technique for the full-root implantation of stentless aortic xenografts, with emphasis on the management of the proximal suture line and coronary anastomoses, and discuss its limitations and alternative options.

Sostituzione della valvola aortica a radice completa da Xenografts aortica senza stentless nei pazienti con radici piccole aortiche

In patients with small aortic roots who need an aortic valve replacement with biological valve substitutes, the implantation of the stented pericardial ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Isolamento di cellule deciduali umane primarie dalle membrane fetali del termine intempestivo della placenta

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...