تم تحسين بروتوكول لدينا لنموذج الماوس ويستخدم المواد التي تتوفر بسهولة لجميع المحققين. يمكن تطبيق هذه التقنية على نماذج الماوس الصحية أو المرضية أو المعدلة وراثياً. بروتوكولنا سيمكن المحققين من الإجابة على أي أسئلة حول بيولوجية القلب من أي نموذج فأر للمرض أو الاختلاف الوراثي.
هذا الإجراء سوف توفر نظرة ثاقبة في بيولوجيا بيريسيت القلب ويساعدنا على فهم مساهمتها في تحلل القلب والديناميكا الدموية في كل من الصحة والمرض. ضع الماوس المُهدَّد في موضع الوَبَيّ، وشرّط إلى أسفل مُدبّبه. فتح بعناية تجويف الصدر، و cannulate الشريان الأورطي التنازلي باستخدام إبرة فراشة 25 قياس.
جعل في الأذين الأيمن. ثم، نفخ القلب مع ما لا يقل عن 20 ملليلتر من 250 وحدة لكل ملليلتر heparinized، الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من الفوسفات Dulbecco في المخزنة المالحة في اثنين من milliliters في الدقيقة مع مضخة التمليك متغير التدفق. Perfusion اكتمال عندما برنامج تلفزيوني نظيفة يخرج من الأذين الأيمن.
قطع القلب في الشريان الأورطي، ووضعها في الجليد الباردة الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من DPBS. ثم، نقل القلب إلى طبق بيتري 15 في 15 سنتيمترا. قطع القلب إلى قطع صغيرة باستخدام مقص الربيع والملقط غرامة نقطة مع محلول انزيم كافية لتغطية القطع.
الآن، نقل القطع والحل إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، وختم مع فيلم من البلاستيك البارافين. احتضان في 37 درجة مئوية على شاكر المدارية في 120 دورة في الدقيقة لمدة 75 دقيقة. بعد هضم الكولاجين مع محلول الإنزيم ، قم بفك السائل من خلال مصفاة خلايا 100 ميكرون إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر ، مما يترك حلًا كافيًا بحيث لا تجف القطع.
باستخدام ملقط النقطة الدقيقة، واتخاذ الأنسجة من الأنبوب ووضع بضع قطع على شريحة المجهر. ثم طحن الأنسجة بين اثنين من شرائح المجهر لتفريق الأنسجة. شطف الشرائح مع وسائل الإعلام ثقافة خالية من الانزيم في أنبوب جديد مخروطي 50 ملليلتر.
كرر هذه الخطوة حتى يتم فصل جميع قطع الأنسجة. الجمع بين محلول توتر والأنسجة من الألف إلى أجل أعلى في أنبوب واحد. سلالة التعليق الناتجة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون في أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر.
الطرد المركزي العينة في 220 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. التعرق قبالة الحل السابق، وبلطف resuspend بيليه الخلية في الباردة FACS تلطيخ العازلة التي تحتوي على DPBS والبومين مصل البقر. عد الخلايا، وتحقق من الجدوى باستخدام عداد خلية.
تمييع الخلايا إلى مليون خلية لكل ملليلتر مع FACS الباردة تلطيخ العازلة التي تحتوي على DPBS والبومين المصل البقري. الخلايا الآن جاهزة لتكون ملطخة وفرزها. إعداد وتسمية أنابيب FACS خمسة ملليلتر لجميع عناصر التحكم وعينات الخلايا.
Aliquot ميليلتر واحد من الخلايا لكل أنبوب لعينة غير ملوثة، وفلوريسنس ناقص عناصر تحكم واحدة، وعناصر تحكم متطابقة مع الأيزوتايب. استخدم الخلايا المتبقية للفرز. يمكن إعداد جميع الضوابط والعينات والملطخة في نفس الوقت.
أيضا، إعداد وتسمية أنابيب FACS خمسة ملليلتر لما مجموعه تسعة ضوابط التعويض، نوعين من الخرز غير المطوع بالإضافة إلى سبعة فلورية مختلفة من لوحة علامة. لتحسين ضوابط التعويض fluorescence، إضافة قطرة واحدة من الخرز التعويض من قارورة الضغط إلى كل أنبوب. ثم، إضافة ميكرولتر واحد من الأجسام المضادة إلى الخرز.
كرر كل جسم مضاد من لوحة العلامة. استخدام ضوابط FMO لتحسين تلطيخ الخلفية بسبب التداخل الطيفي. إلى الخلايا في أنابيب التحكم FMO، أضف جميع الأجسام المضادة من لوحة العلامة في تخفيف واحد إلى 100، ولكن استبعاد جسم مضاد واحد.
كرر لكل جسم مضاد لما مجموعه سبعة عناصر تحكم. استخدام الأجسام المضادة التحكم المتطابقة isotype لالطين غير محددة. إلى الخلايا في الأنابيب ذات التسمية المطابقة للأيزوتايب، أضف الأجسام المضادة المُطابقة للisotype في تخفيف واحد إلى 100.
بعد ذلك، قم بإعداد الخلايا ليتم فرزها. إلى الخلايا المعزولة حديثًا، أضف كوكتيل الأجسام المضادة في تخفيف واحد إلى 100. أيضا، إضافة صبغة قابلية البقاء الخلية في واحد إلى 1، 000 تخفيف.
مزج بقوة ضوابط التعويض عن طريق نبض دوامة. احتضان لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية، محمية من الضوء، باستثناء الخرز قابلية الخلية، والتي يمكن أن تترك في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. خلط عناصر تحكم FMO، عناصر التحكم المتطابقة مع الأيزوتيبي، والخلايا التي سيتم فرزها حسب نبضات الدوامة.
احتضان لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية، محمية من الضوء. إضافة ثلاثة ملليلترات من FACS تلطيخ المخزن المؤقت لكل عنصر تحكم التعويض، FMO التحكم، و isotype التحكم. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
التعرق قبالة الحل، و resuspend كل بيليه في 400 ميكرولترات من FACS وصمة عار العازلة. عناصر التحكم في التعويض و عناصر تحكم FMO و عناصر التحكم isotype جاهزة للاستخدام الآن. بعد تلطيخ، وغسل الخلايا مع FACS تلطيخ العازلة عن طريق الطرد المركزي في 300 مرات ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
التعرق من الحل، وإعادة تعليق بيليه الخلية في FACS تلطيخ العازلة إلى 0.5 مليون خلية لكل ملليلتر. باستخدام أنابيب FACS الجديدة التي تحتوي على قمم فلتر 35 ميكرون، ماصة عينات الخلية الملون على الأغطية وتصفية الجاذبية للحصول على تعليق خلية واحدة. حافظ على الثلج.
استخدم فارز الخلية لتنقية الخلايا. تشغيل الخلايا غير المطية على فارز الخلية لتعيين الفولتية وتصحيح للإشارة الخلفية. تشغيل كل واحد لون تعويض عينة حبة واحد في وقت واحد لضبط الفولتية لكل قناة وضبط البوابات للإشارة الإيجابية.
جمع البيانات. استخدم البرنامج لحساب التداخل الطيفي عن طريق حساب مصفوفة التعويض. جميع الفولتية جاهزة وتعيين.
تشغيل كل عنصر تحكم isotype واحد في كل مرة. يمكن استخدام هذه البيانات لضبط البوابات للربط غير محدد إذا كان هناك أي. تشغيل كل عينة FMO واحد في الوقت.
ضبط الفولتية لكل قناة لتصحيح النزف الطيفي من خلال نظرا للوحة متعددة الألوان. تشغيل عينات الخلية الملطخة في فارز الخلية. جمع الخلايا في 10 ملليلتر وسائل الإعلام ثقافة خالية من الانزيم في أنبوب جمع مخروطي 15 ملليلتر.
استخدم استراتيجية البوابات التالية. أولاً، بوابة لخلايا واحدة. ثم، بوابة للخلايا الحية.
المقبل، بوابة لCD45-السلبية الخلايا. بوابة لCD34 وCD31-السلبية الخلايا. ثم، بوابة للخلايا إيجابية NG2.
وأخيرا، بوابة لCD146 وCD140b الخلايا الإيجابية. إلى pericytes الثقافة، بذور الخلايا التي تم الحصول عليها حديثا في وسائل الإعلام ثقافة خالية من الانزيم على لوحة مغلفة 24 جيدا. ثقافة الخلايا في حاضنة الخلايا تعيين في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، و 95٪ الأكسجين.
بعد الهضم الأنزيمي وتفكك القلب كله وقبل تنقية FACS للخلايا ، والخلايا هي خليط الخام التي تحتوي على العديد من أنواع الخلايا المختلفة من القلب. بعد تنقية FACS واستزراعها، تكون الخلايا متجانسة. فهي أحادية النوى ، مسطحة تماما ، ولها مورفولوجيا الرومبويد pericyte نموذجية.
وباستخدام FACS، يتم تنقية الخلايا إلى متجانس. أولاً، تم اًسور الحطام والمزدوجة على أساس توزيعات التشتت الأمامية والجانبية. ثم، تم بوابات الخلايا الميتة بسبب رد فعل أمين مع الصبغة، والتي تنتج إشارة أكبر وأكثر كثافة من الخلايا الحية.
من الخلايا الحية، تم بوابات الخلايا المواد الدموية من قبل كونها CD45 إيجابية. لإزالة المزيد من الخلايا الدموية و البطانية، تم بوابات الخلايا CD34 إيجابية وD31-positive خارج. وأخيراً، تم اختيار الخلايا الإيجابية NG2 و CD140b/CD146-positive لخلاياها الـ perivascular مع التعبير عن علامات pericyte النموذجية.
بالمقارنة مع pericytes الدماغ البشري، كان الخلايا مورفولوجيا مماثلة. بالمقارنة مع الماوس وخلايا العضلات الملساء البشرية ، كان لدى الخلايا توصيف مختلف للمورفولوجيا الظاهرية للخلايا عند مرور سبعة عن طريق الكيمياء المناعية لعلامات البيريست لم تظهر أي تغييرات ملحوظة في التعبير المورفولوجي أو العلامة. وبالمثل، أكد التحليل حسب قياس الخلايا المتدفقة للتحلل عند مرور سبعة أن السكان ظلوا متجانسين.
قابلية الخلية للحياة أمر بالغ الأهمية للحصول على عائد جيد. الحفاظ على برودة الأنسجة أثناء الشراء، والحفاظ على برودة الخلايا أثناء تلطيخ الخلايا. أيضا، تأكد من أن يتم إعداد الحل الأنزيمية الطازجة في كل مرة.
لضمان عزل الخلايا الصحيحة بعد زراعة، تميز لهم مع تدفق الخلايا المصبية وتلطيخ مناعي. ويمكن استخدام هذه الخلايا في تجارب الاستزراع المشترك مع الخلايا البطانية لدراسات الحاجز الوظيفي، وكذلك الأقوال لدراسة وظيفتها وخصائصها البيولوجية والفسيولوجية. تلعب الاضطرابات القلبية دورًا أساسيًا في سلامة الأوعية الدموية واستقرارها، ويترتب على اختلالها الوظيفي وظيفة القلب العالمية.
مع تقنيتنا، يمكن للباحثين استكشاف الإمكانات العلاجية للبيريكس القلبية.
