يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل خلايا القلب على شكل قضيب من أي أنسجة قلبية ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لقياس حالة ploidy والنيوية لهذه الخلايا القلبية دون تحليل يدوي. بالمقارنة مع التقنيات الأخرى، يوفر لدينا بروتوكول أكثر اتساقا غلة الخلية ومورفولوجيا الخلية، وعلى العكس من تدفق القياس الخلوي، ونحن قادرون على التحقق بصريا nucleation والوضع ploidy من cardiomyocytes. إن العرض المرئي لهذه الطريقة مهم لأن تقسيم أنسجة القلب والارتباط أسهل في التقدير.
تبدأ عن طريق وضع الفأر القتل الرحيم في موقف supine، والضغط على الأطراف الموسعة. استخدام مقص حادة الرأس لقطع من خلال الصدر لفضح القلب. ثم قطع الشريان الأورطي التنازلي وفينا cava الاستدلالية.
استخدام مضخة ال peristaltic تعلق على ضخ مجموعة مع إبرة فراشة قياس 23 لضخ القلب عن طريق حقن ثلاثة ملليلترات من محلول PBS كلوريد البوتاسيوم من خلال البطين الأيسر. تأكد من عدم اختراق الحاجز. ثم حقن 10 ملليلتر من 4٪ محلول PFA لمدة 10 دقائق بمعدل ملليلتر واحد في الدقيقة.
استخدم المقص لإزالة القلب بأكمله. وإذا رغبت في ذلك، عزل منطقة معينة. ضع الأنسجة في أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من محلول PFA بنسبة 4٪.
احتضانه على الروك لمدة ساعة واحدة. ضع القلب في طبق بتري مع حل PBS. اضغط عليه للتخلص من أي PFA المتبقية في البطينين وغسلها في برنامج تلفزيوني.
وضع القلب الثابت في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر تحتوي على حل collagenate. ثم احتضان القلب على الروك في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وضع القلب في طبق بيتري 35 ملليمتر يحتوي على محلول الكولاجين، وفكه إلى قطعة ملليمتر واحد مع ملقط أو مقص.
ثم استخدام ماصة نقل إلى مزيد من triturate الأنسجة المنفصلة لمدة دقيقتين. إذا كانت جزيئات الأنسجة لا تزال قائمة، استخدم ماصة مع طرف أضيق وتستمر في التثاخر حتى يتم تقسيم غالبية الأنسجة. ضع شبكة نايلون من 200 إلى 600 ميكرومتر فوق أنبوب طرد مركزي 15 ملليمتر.
إضافة خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني إلى الخلايا المنفصلة وتصفية لهم من خلال شبكة النايلون. غسل شبكة النايلون عن طريق تمرير أربعة ملليلتر إضافية من برنامج تلفزيوني. ثم الطرد المركزي الحل المصفاة في 10 إلى 100 مرة G لمدة دقيقة واحدة.
تجاهل الماثرة وإعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني قبل تلطيخ. بعد تنزيل توزيع فيجي للصورة J ، افتح فيجي وانقر على تعليمات وتحديث وإدارة مواقع التحديث. تحقق من مجموعة biomed والإضافات IFPB.
لتحميل الملحقات التبعيات الإضافات، تقسيم القطع الناقص و morpho lib J.Then انقر فوق إغلاق وتطبيق التغييرات. بعد ذلك، قم بتنزيل RStudio وافتحه. انسخ الرمز من مخطوطة النص إلى سطر أوامر RConsole واضغط على enter.
ثم اكتب Y استجابة لكافة المطالبات لتثبيت جميع تبعياتنا. لإجراء تحديد كمي للصورة، افتح فيجي واسحب تحليل النوى. py في شريط المعلومات.
عند فتح نافذة تحرير البرنامج النصي، انقر فوق تشغيل في الزاوية السفلية اليسرى. مربع حوار يطفو على المنبثقة يسأل عن موقع دليل بيانات الإخراج. حدد المجلد الذي سيتم فيه تخزين كافة بيانات التحليل، والأرقام، والبيانات الأخرى المستخدمة من قبل البرنامج.
في معلمات التحليل، حدد موقع الصور التي سيتم تحليلها وأدخل تنسيق اسم ملف الصورة باستخدام التعبيرات العادية. بعد تحديد الإعدادات المطلوبة، انقر فوق موافق. كما تظهر الصور من مراحل مختلفة من خط أنابيب التحليل على الشاشة، افحصها للتأكد من أن العتبة والتجزئة تحدث بشكل صحيح. فتح محللاتمولتينوسيرف.
r في Rstudio. بعد ذلك، إلى اسم المجلد المسمى المتغير، اكتب مسار الملف إلى مجلد بيانات الإخراج المحدد في الخطوة الأخيرة دون الشرطة المائلة النهائية. انقر فوق تشغيل التطبيق في الزاوية اليسرى العليا من نافذة تحرير البرنامج النصي.
استخدم أشرطة التمرير لتعيين عتبات للحد الأدنى لعتبة شدة الوسط النووي الصالحة، والحد الأدنى لعتبة المنطقة النووية الصالحة، والحد الأقصى لقطر النمس الدنيا الصالحة لـ cardiomyocytes. مرر لأسفل وانقر فوق تطبيق العتبات المحددة ثم انقر فوق توزيع كثافة الرسم ، والذي سيجعل رسم توزيع كثافة النواة للعينة بأكملها بالإضافة إلى مجموعات فرعية منفصلة لكل متغير تجميع. لحساب التباين داخل العينة، انتقل لأسفل وتحقق من تطبيع بشكل منفصل حسب المجموعة ثم انقر فوق حساب ploidy والمؤامرة يقدر توزيع ploidy.
بمجرد ظهور الرسم البياني الكامل الذي تم تطبيعه، يجب أن تكون أنماط الذروة اثنين مرئية. استخدم المنزلقات وحدد العتبات لعزل القمم diploid و tetraploid من بعضها البعض و خارج القيم. ثم انتقل لأسفل وانقر فوق حساب ploidy و nucleation.
وأخيرا ، انقر فوق رسم زر وحفظ في مجلد النتائج. يمكن استخدام هذه الطريقة لعزل عضلة القلب المتفردة بشكل موحد التي هي نقية نسبيا دون تلويث الخلايا. فمن السهل لتنفيذ ويوفر نتائج cardiomyocyte متسقة والجودة من العزل المختلفة.
يمكن أن تكون ملطخة Cardiomyocytes معزولة مع هذا البروتوكول باستخدام الأجسام المضادة وفلوروكروم مترافق azides. لإظهار نمط تلطيخ خط Z المميز من الساركوميريات ، كانت الخلايا ملطخة باجسام مضادة تعترف بـ alpha actinin. في تجربة منفصلة، تم إعطاء EdU للفئران قبل عزل الخلايا القلبية الثابتة.
بعد العزل، تم الكشف عن الخلايا القلبية أحادية النوى، وbinucleated، وثلاثة نوات التي خضعت للمرحلة S. لتحديد النوى الفردية، تم عتبة الصورة الأصلية الملطخة بالحمض النووي بناءً على الكثافة. كانت الحذف الناقصة مناسبة للأقنعة النووية، مما جزء النوى الفردية.
وبعد ذلك، تم تقسيم بيكسل الصورة إلى أقاليم استنادا إلى القطع الناقص الذي هي أقرب من غيرها، واستخدمت حدود هذه الأراضي لرسم خطوط من خلال المجموعات النووية. واستخدمت عملية تجزئة مماثلة للكشف عن أمراض القلب. وأظهرت هذه الاستراتيجية تجزئة أن غالبية cardiomyocytes من الفئران حديثي الولادة هي أحادية النوى.
وتيرة القلب أحادية النواة هو أقل بكثير في الفئران عمرها أسبوعين، حيث أنها تشكل حوالي 25٪ من مجموع سكان القلب. عندما تم قياس الحالة ploidy من النوى الفردية داخل cardiomyocytes، تم الكشف عن تردد أعلى من النوى رباعية في الفئران الأحداث. عند عزل عضلة القلب، من المهم التحقق من أن جميع كتل الخلايا قد انفصلت عن التثابت.
