أدى الاهتمام المتزايد في دراسة الهياكل الكبيرة متعددة الخلايا إلى تطوير تقنية المقاصة البصرية هذه التي تسمح بالتصور ثلاثي الأبعاد والتخصيص الكمي للهياكل الكبيرة داخل الأجهزة الشفافة. يوفر هذا البروتوكول أداة بسيطة ورخيصة وسهلة الإعداد وشاملة للتحقيق في الأنسجة في ثلاثة أبعاد. لا يمكن دائماً محاكاة الطبيعة المتعددة الطبقات للمرض بواسطة التقنيات التقليدية الثنائية الأبعاد.
تحليل ثلاثي الأبعاد للأنسجة يمكن أن يساعد على تشخيص أفضل ورصد المرض. لا تقتصر هذه الطريقة على أنسجة الكلى ويمكن تطبيقها على أي أنسجة طبيعية ومامراضة. هذا البروتوكول البسيط سهل المتابعة لأي عالم يتمتع ببعض الخبرة في التعامل مع الحيوانات.
من المهم اختبار الأجسام المضادة المختلفة في حالة وضع علامات الأجسام المضادة الفقيرة ، وإجراء ضوابط الأجسام المضادة الثانوية فقط. ابدأ بإعداد الهيبارين الذي يحتوي على PBS و3.0٪ شبه شكلي في 1X PBS وفقًا لاتجاهات المخطوطة ونقل الحلول إلى محاقن بلاستيكية منفصلة 50 مل. Paraformaldehyde هو سام وينبغي أن تكون مستعدة في غطاء محرك الدخان.
جمع وافر في الكلية وفقا لتوجيهات المخطوطة. ثم، إزالة الكبسولة وقطع الكلى إلى شرائح إكليلية سميكة واحدة مم. غمر شرائح الكلى مع محلول شبه الأشكال المعد في أنبوب مخروطي 15 مل.
بعد التثبيت، وغسل شريحة الكلى مرتين مع 1X غسل العازلة لمدة ساعة واحدة على الروك الأفقي ومن ثم المضي قدما مع استرجاع المستضد. تسخين 300 مل من 1X مستضد محلول كشف في 500 مل من القارض. ثم، أرفق شريحة الكلى في شريط مضمن نفاذية إلى المخزن المؤقت الساخن وحركه لمدة ساعة واحدة عند 92 إلى 98 درجة مئوية.
من المهم الحفاظ على درجة الحرارة مستقرة بين 92 و 98 درجة مئوية لهذه الخطوة استرجاع المستضد. ثم نقل شريحة إلى 10 مل من 1X غسل العازلة مع 0.1٪ تريتون X-100 والصخور بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، اغسل الشريحة مرتين بـ 10 مل من 1X الطازجة غسيل العازلة لمدة ساعة واحدة.
تخفيف الجسم المضاد الأساسي في 500 ميكرولترات من ذوبان الأجسام المضادة الطبيعية. صخرة بلطف شريحة الكلى في الجسم المضاد الأولية المخففة لمدة أربعة أيام في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، وغسل شريحة الكلى في 10 مل من 1X غسل العازلة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، وتغيير العازلة مرة واحدة بعد ثماني ساعات.
تمييع الأجسام المضادة الثانوية في 500 ميكرولترات من الجسم المضاد الطبيعي diluent واحتضان مع شريحة الكلى لمدة أربعة أيام في 37 درجة مئوية. يرجى ملاحظة أنه من هذه الخطوة إلى الأمام، يجب حماية شريحة الكلى من الضوء. بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية، وغسل شريحة الكلى في 10 مل من 1X غسل العازلة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
لتجفيف شريحة الكلى، ونقلها إلى خمسة مل من درجة عالية 100٪ الإيثانول والصخر لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، ومنعش الإيثانول بعد ساعة واحدة. تزج شريحة الكلى في اثنين من مل من cinnamate الإيثيل والصخور بلطف بين عشية وضحاها. عندما تكون جاهزة لتصوير الأنسجة، إضافة 600 إلى 1000 ميكرولتر من cinnamate الإيثيل في طبق الزجاج القاع ونقل شريحة الكلى في الطبق.
وضع زلة غلاف مستديرة على شريحة الكلى وختم الطبق مع فيلم البارافين. ضع الطبق على منصة التصوير المجهرية وصور الأنسجة وفقًا لاتجاهات المخطوطة. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لإجراء تحليل 3D على أنسجة الكلى وتقييم وظائف الخلية والتفاعلات.
قد تسبب هذه الطريقة في إخماد مراسل الفلورسنت ولكن البروتينات الفلورية القوية الأخرى قد تقاوم إخماد الإشارة. يمكن أن يحسن الإسراف الأبهري في البطن انتشار الأجسام المضادة. في بعض الحالات، يؤدي ضعف اختراق الأجسام المضادة إلى إشارة سطحية.
ويمكن تصحيح هذا مع تركيزات أعلى أو تجديد الأجسام المضادة. وينبغي النظر في التسليم داخل الأوعية الدموية إذا تم التعبير عن المستضد من الفائدة في الأوعية الدموية في الكلى. ومع ذلك، الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات في الغشاء apical من الخلايا الظهارية tubule لا تعبر حاجز الترشيح الكبيبي وتسبب إشارات غير محددة.
يمكن أن تكون تسمية الأنسجة مع الأجسام المضادة للكشف عن مجموعة خلايا محددة أو لتصور شرائح الأنبوب كله. وعلاوة على ذلك، يمكن تحقيق التكلس من البروتينات في 3D عن طريق الجمع بين الأجسام المضادة متعددة. من المهم أن نتذكر أن وضع العلامات على الأجسام المضادة يمكن تحسينه مع وفرة جيدة في الكلى ، واستخدام خطوة استرجاع المستضد ، وتركيز الأجسام المضادة العالية.
قد تقاوم بعض البروتينات المراسل قوية إخماد إشارة الفلورسنت بعد هذا البروتوكول. لاختبار هذا، تخطي استرداد المستضد وخطوات وضع العلامات المضادة. هذه التقنية تحترم طبيعة ثلاثية الأبعاد من الهياكل ويفتح مجالات جديدة كثيرة للبحث.
وهو يلغي الافتراضات والتداخلات المطلوبة المرتبطة بالتحليل التقليدي ثنائي الأبعاد.
