نشكر لورنا رينشو (ادنبرة وحدة الثدي) لمساعدتها في الحصول على قيمة العينات السريرية. وقد وافق استخدام المواد الورم عن طريق لجنة أخلاقيات البحث لوثيان (08/S1101/41) ويتم الحصول عليها تحت رعاية مركز الطب التجريبي للسرطان برنامج (ادنبرة). ويؤيد هذا العمل من قبل مجلس التمويل الاسكتلندي. ADL هي مارغريت ملكة جمال ترست زبد زميل Reekie السريرية.

1. استخراج الكولاجين من ذيول الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذيول الفئران مكان المجمدة الطازجة في الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجلد المغطي Deglove مع الأوتار تعريض مشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريط الأوتار بعيدا عن الذيل ومكان في الإيثانول 70 ٪ لتعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن الأوتار التي تم جمعها ونقلها إلى حمض الخليك (1G وتر لحمض الخليك 250ml 0.5M). مزيج ل48hr في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي مزيج حمض وتر / ز 10000 في الخل ل30min وتجاهل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من 10 ٪ (W / V) كلوريد الصوديوم لطاف والسماح للخليط إلى الوقوف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الكولاجين الغنية ، غير قابلة للذوبان الطبقة السفلية وينبذ ل30min أخرى في 10000 ز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكولاجين المواد الغنية في حمض الخليك 0.25M في 4 درجات مئوية وdialyse ضد 1:1000 حمض الخليك في 4 درجة مئوية لمدة 3 أيام ، وتغيير العازلة غسيل الكلى مرتين يوميا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم كذلك حل الكولاجين بواسطة الطرد المركزي (20،000 ل2hr ز) وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الكولاجين على النحو المطلوب ، مع إضافة حامض الخليك العقيمة 1:1000 إلى تركيز المخزون من 1mg/ml. </li></ol> 2. 3D الفحص الخلق نشرت يستند مقايسة 3D على خلية مقايسة الخط ، سابقا 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم حصاد الأساسية خزعات متعددة من المرضى بالتراضي في وقت استئصال الجراحي العلاجية لسرطان الثدي الغازية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالعين ، تقسيم النوى باستخدام مشرط إلى شظايا 1MM 3. تقليم والتخلص من الدهون متميزة ظاهريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غمر أجزاء كاملة في وسائل الإعلام MEGM. يمكن تخزينها في الأنسجة في هذه الولاية لمدة تصل إلى 1hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء الكولاجين هلام ، في مزيج الكولاجين الفئران الجليد 1mg/ml الذيل ، 1:1000 حامض الخليك تصفيتها ، DMEM/F12 10x وهيدروكسيد الصوديوم 0.22M في نسبة 3:5:1:1 لإنشاء تركيز الكولاجين النهائية 0.3 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الكولاجين 1.2ml من الخليط في الآبار الفردية 24 لوحة في مكان جيد وحاضنة عند 37 درجة مئوية ل10min الشروع في التبلور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10min ، إزالة 24 لوحة جيدا من الحاضنة. مكان القطع الورم إلى الكولاجين التبلور ، ودفع لهم في بلطف إلى مركز الجل باستخدام تلميح 10μl ماصة. عودة 24 لوحة بالإضافة إلى حاضنة لل1hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للأورام + ER ، الملحق مع وسائل الإعلام كاملة MEGM oestradiol - β إلى تركيز M. 3.2x10 -10 مرة واحدة في المقايسات جل وتبلور ل1hr ، وإدخال بعناية 1.2ml من وسائل الإعلام في كل تستكمل جيدا. وستقام المباراة النهائية β - oestradiol تركيز داخل مقايسة equilibriate إلى M 1.6x10 -10 أن ألخص مستويات هرمون الاستروجين الفسيولوجية موجودة في نسيج الثدي 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل غيض ماصة 10μl حول الحافة الداخلية من كل جانب ، والإفراج عن كل circumferentially هلام ، وبالتالي السماح بتعويم كل هلام بحرية داخل وسائل الإعلام. عودة 24 لوحة جيدا للحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استكمال تبادل وسائل الإعلام مرتين أسبوعيا حتى انتهاء التجربة. إنهاء التجربة وسائل الاعلام عن طريق إزالة وإضافة تثبيتي الفورمالين. </li></ol> 3. يلطخ الضد من الفحص المقطعي استعدادا لإسقاط ضوئي اعتمدنا طريقة تنطبق كلها على عينة 4 تلطيخ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات ثابتة في الفورمالين ل30min برنامج تلفزيوني. يذوى المواد الهلامية متدرج في الميثانول مخففة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.05 ٪ توين 20 (0.05 ٪ PBST) : 33 ٪ ، 66 ٪ و 100 ٪ لل≥ 15min في كل خطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن النسيج في MeOH الطازجة : DMSO : 30 ٪ H 2 O 2 في نسبة 02:01:03 (15 ٪ V / V H 2 O 2) في درجة حرارة الغرفة ل24hr إخماد تألق ذاتي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات مرتين ل30min في الميثانول. تجميد العينات إلى -80 درجة مئوية يتم تقديم خمس مرات على الأقل في كل مرة 1hr والعودة إلى درجة حرارة الغرفة (RT) لضمان أن المستضدات في أعمق أجزاء من الأنسجة للوصول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب الأنسجة العودة إلى PBST 0.05 ٪ مع الميثانول ومادة التخفيف (33 ٪ و 66 ٪ و 100 ٪ لل15min في كل خطوة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة النسيج في عرقلة الحل (10 ٪ في مصل PBST 0.05 ٪) ل24hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان النسيج مع الأجسام المضادة الأولية لتحديد محتوى الظهارية ، وذلك باستخدام أرنب المضادة للcytokeratin بتركيز 1:500 مخففة في 1.5ml من عرقلة الحل DMSO تحتوي على 5 ٪ ل48hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات أربع مرات مع PBST 0.05 ٪ عن كل 30min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان النسيج مع الفلورسنت الضد الثانوية (1:100 الماعز المضادة للأرنب Alexa555) ، مخففة في عرقلة الحل 1.5ml DMSO تحتوي على 5 ٪ ل48hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات مرة أخرى مع 0.05 ٪ لأربع مرات PBST 30min لكل منهما. </li></ol> 4. الإسقاط الضوئية التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية التصوير المقطعي هو أسلوب المجهري التي سبق وضعها لانتاج صور عالية الدقة 3D من العينات البيولوجية الفلورسنت بسماكة تصل إلى 15 ملليمتر 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل لياليويمكن الحصول في هلام 1 ٪ انخفاض ذوبان agarose نقطة ويذوى في الميثانول 100 ٪ لل24hr. مسح العينة في حل BABB (1:2 البنزيل الكحول ، البنزيل بنزوات) ل48hr والمسح الضوئي باستخدام ماسحة 3001M الأراضي الفلسطينية المحتلة (Bioptonics). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم التقاط كل من الهدف وتألق ذاتي باستخدام مجموعة Cy3 تصفية (منبه 545nm/30 نانومتر ، باعث 610/75 نانومتر) وGFP1 تصفية مجموعة (منبه 425nm/40 نانومتر ، باعث LP475 نانومتر) على التوالي. </li></ol> 5. التعمير والكمي 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن بناؤها على مجموعة من الاسقاطات التي حصل عليها الزاوي الأراضي الفلسطينية المحتلة NRecon باستخدام البرمجيات (SkyScan) لإنشاء سلسلة من شرائح المقطع العرضي من خلال فحص الغزو. هذا البرنامج متاح للتحميل مجانا في <a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات باستخدام برنامج إعادة Volocity (PerkinElmer). مظاهرة البرمجيات الحرة متاحة للتحميل في <a href="http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/">http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين كثافة فوكسل عتبة الحد الأدنى للحد من التدخل مضان الخلفية في القناة المستهدفة من أجل تقدير حجم الظهارية التي تلطيخ cytokeratin. حددنا هذه العتبة تجريبيا في الاتحاد الافريقي 9000 باستخدام قائمة المعلمات المتوفرة في تطبيق القياس ، ونحن كميا حجم ظهارة في الاستمرارية مع جوهر الأصلي (ترسيمها في القناة autofluorescent) ، وهذا سمح لنا لتحديد حجم ثمرة الظهارية بين مختلف ورم عينات. </li></ol> 6. ممثل النتائج : خلال تطوير فحص ما مجموعه 52 خزعة سرطان الثدي استخدمت عينات مع طائفة واسعة من الأنسجة. هذه &lt;10 ٪ (5 / 52) فشلت في تقديم واحدة على الأقل مقايسة غزو قابلة للحياة. وكان فشل تجربة إما بسبب العدوى البكتيرية فوق أو عدم كفاية المواد خزعة الورم. ولذلك لا يقتصر تطبيق مقايسة لسلالة معينة من سرطان الثدي. المقايسات نموذجي (الشكل 1) بعد 20 يوما ثابتة في الثقافة الكولاجين والملون لاحقا cytokeratin. برنامج Volocity قادرة على التعرف على حد سواء بالجملة الظهارية المستمر مع الجماعات الأصلية والأساسية متجردا من غزو الخلايا وتحديد حجم كل على حدة. <img src="/files/ftp_upload/3085/3085fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> المقايسات الغزو الرقم 1. التالي للتثبيت وتقدير. وفحص العينات التي تم الحصول عليها من يدعم العديد من أنواع فرعية من سرطان الثدي : أ) ER + ب) HER2 + ج) ER.

<ol>
	<li>Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+precursors+revisited:+molecular+features+and+progression+pathways.+Histopathology.">Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.</a> 57, 171-192 (2010).</li><li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs:+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited.">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).</li><li>Dabrosin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+extracellular+local+levels+of+estradiol+in+normal+breast+in+vivo+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle.">Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).</li><li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs.">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li><li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies.">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li><li>Hidalgo-Carcedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+requires+suppression+of+actomyosin+at+cell-cell+contacts+mediated+by+DDR1+and+the+cell+polarity+regulators+Par3+and+Par6.">Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6.</a> Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).</li><li>Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+on+the+HER2+amplicon,+C35,+is+an+oncogene+in+breast+cancer+whose+actions+are+prevented+by+inhibition+of+Syk.">A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk.</a> Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).</li><li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53.">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li></ol>

SEW ويعملون بواسطة تكنولوجيا JF MRC ، الذي هو تسويق Bioptonics الماسحات الأراضي الفلسطينية المحتلة. مؤلفين آخرين تعلن أي تضارب في المصالح.

الكولاجين هي الآن على أساس المقايسات لدراسة سلوك خطوط الخلايا السرطانية تستخدم على نطاق واسع 6،7،8. ومع ذلك ، فإن هذه المقايسات لم تنعكس في التعقيد الكامل للورم وبيئتها. في هذه الدراسة ، وتبين لنا أنه يمكن استخدام مواد سرطان الثدي البشرية بطريقة مماثلة ، خارج الحي. علاوة على ذلك ، الأراضي الفلسطينية المحتلة هو أداة مفيدة لتوصيف التوسع 3D من سرطان الثدي. وجدنا أن القيد الرئيسي لهذا الأسلوب هو توافر المواد الورم (خزعة واحدة أساسية هي كافية لمدة 4-6 المقايسات). عامل آخر هو أن يحد من الغزو الهيكلية تحدث فقط في حوالي 40 ٪ من المقايسات. للتغلب على هذا ، ونضيف إلى أي علاج بشكل منتظم حول المطلوب اليوم من 7 إلى جميع المقايسات مع النمو مرئية. ويمكن توسيع نطاق استخدام في الأراضي الفلسطينية المحتلة في المستقبل أيضا للكشف عن تغيرات بالجملة ، خارج الجسم ، والناجمة عن العلاج بالعقاقير. وهذا يمكن أن يسهل بدوره أكثر فردية علاج السرطان ، ومستقلة عن النماذج الحيوانية. ونحن حاليا بصدد استكشاف مدى استجابة الأورام + ER لفيفو السابقين تاموكسيفين.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> رقم كتالوج </td></tr><tr><td> أكمل MEGM </td><td> Lonza </td><td> CC - 3150 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D8900 10X1L </td></tr><tr><td> β - oestradiol </td><td> سيغما الدريخ </td><td> E8875 - 250MG </td></tr><tr><td> أرنب المضادة للcytokeratin </td><td> داكو </td><td> Z0622 </td></tr><tr><td> الماعز المضادة للأرنب Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr></tbody></table> تم الحصول على جميع الكواشف الأخرى القياسية من سيغما الدريخ.

long-term culture of human breast cancer specimens and their analysis using optical projection tomography

سرطان الثدي هو السبب الرئيسي للوفيات في العالم الغربي. ومن الثابت أن انتشار سرطان الثدي ، أولا محليا وبشكل أقصى في وقت لاحق ، هو عامل رئيسي في تشخيص المريض. نظم تجريبية لسرطان الثدي تعتمد على خطوط الخلايا تستمد عادة من الأورام الأولية أو الانصباب الجنبي. عقبتين رئيسيتين تعيق هذا البحث : (ط) ليست ممثلة معروفة بعض أنواع فرعية من سرطان الثدي (تشخيص الأورام لا سيما الفقراء اللمعية B) ضمن مجموعات الخط الحالي ، (ب) لا تأثير للورم المكروية عادة ما تؤخذ في الحسبان. نظهر تقنية لثقافة العينات الأولية من سرطان الثدي من جميع الأنواع الفرعية. ويتحقق ذلك باستخدام نظام ثلاثي الأبعاد الثقافة (3D) والتي هي جزء لا يتجزأ من القطع الصغيرة من الأورام في الفئران الكولاجين لينة أنا الوسائد. في غضون 2-3 أسابيع ، وانتشار الخلايا السرطانية في الكولاجين وشكل مختلف هياكل مماثلة لتلك التي لوحظت في tumours1 الإنسان. الخلايا الشحمية قابلة للحياة ، كانت الخلايا الطلائية والخلايا الليفية داخل النواة الأصلية واضحة على الأنسجة. وقد أظهرت الخلايا الظهارية الخبيثة مع التشكل شبيه بالصدفة الغازية في الكولاجين المحيطة بها. وكان واضحا تعدد الأشكال النووية داخل هذه الخلايا ، جنبا إلى جنب مع شخصيات وهيئات الإنقسامية أفكارك. لقد استخدمنا البصرية التصوير المقطعي الإسقاط (المحتلة) ، وهي تكنولوجيا التصوير 3D ، من أجل تحديد مدى انتشار الورم في الثقافة. ونحن قد استخدمت الأراضي الفلسطينية المحتلة لقياس حجم الجزء الأكبر من الثقافة الورم ، معلمة تقاس بشكل روتيني أثناء العلاج الجدد مساعد لمرضى سرطان الثدي لتقييم الاستجابة للعلاج المخدرات. هنا نقدم فرصة لأورام الثدي ثقافة الإنسان دون تحيز النوع الفرعي وقياس انتشار هذه فيفو السابقين. ويمكن استخدام هذا الأسلوب في المستقبل لتحديد حساسية المخدرات في الورم الاصلي. وهذا قد تقدم نموذجا أكثر التنبؤية من خطوط الخلايا المستخدمة حاليا.

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography at JoVE.com

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

وضعنا القائم على الكولاجين<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص الذي يعزز الانتشار والغزو من عينات من جميع أنواع فرعية من سرطان الثدي. وقد استخدم التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية ، لمدة ثلاثة تقنية الأبعاد المجهري لتصور وتحديد توسع الورم. ويمكن استخدام هذا الاختبار لقياس استجابة المخدرات من عينات الأورام الفردية.

على المدى الطويل ثقافة الإنسان العينات والتحليل سرطان الثدي وذلك باستخدام التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

long-term-culture-human-breast-cancer-specimens-their-analysis-using

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Views.  University of Edinburgh. وضعنا القائم على الكولاجين في المختبر الفحص الذي يعزز الانتشار والغزو من عينات من جميع أنواع فرعية من سرطان الثدي. وقد استخدم التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية ، لمدة ثلاثة تقنية الأبعاد المجهري لتصور وتحديد توسع الورم. ويمكن استخدام هذا الاختبار لقياس ا...

Video: Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

التصوير خلايا الثدييات على المدى الطويل باستخدام الميكروسكوب واسعة الميدانية

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

ولد لتطبيع الإسفار التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية للتصوير القلب الجامع

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية الظهارية من الجلد البشري

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

الثقافة السابقين فيفو من خلايا الإنسان الأولية قناة فالوب طلائي

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

A simple method to derive and maintain spermatogonial stem and progenitor cell lines from adult mice is presented here. The method utilizes feeder cells originating from the somatic cell compartment of the adult mouse testis. This technique is applicable to common mouse strains, including transgenic, knock-out, and knock-in mice.

مسلسل إثراء الجذعية والخلايا الاولية الظروف المناسبة (جان معايير الأمان) في الثقافة لاشتقاق على المدى الطويل الكبار ماوس خطوط SSC

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

الكشف عن التعديلات الوراثية الجسدية في عينات الورم عن طريق التقاط اكسون وتسلسلها الموازي واسع

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

متعدد الطبقات لتركيب المدى الطويل المجهر الضوئي ورقة من الزرد

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

العزلة، وTransfection، والثقافة طويلة الأجل من الماوس الكبار والجرذان Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...