الكائنات العضوية المشتقة من المريض البشري هي أنظمة نماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر تمثل كلا من تنوع المريض وعدم التجانس الخلوي للأورام. يوفر هذا البروتوكول والفيديو التوضيحي دليلا مفصلا وعمليا لإنشاء ورم الثدي المشتق من المريض والكائنات العضوية الطبيعية. تعتبر عضويات أورام الثدي المشتقة من المريض نماذج جديدة مثيرة ، ولكن يصعب تحديدها.
يجب أن يساعد البروتوكول الشامل الذي نقدمه هنا في إعداد الباحثين الذين يحاولون تطوير عضويات الثدي وتعريفهم بالتحديات المتوقعة. كل خط PDO مشتق من مريض مختلف فريد من نوعه في التشكل ومعدل النمو. على عكس نظامي خط الخلايا 2D ، تنمو المواد العضوية بشكل أفضل عند طلائها بكثافة عالية ، مما يسمح بتفاعلات أفضل بين الخلايا.
ستوضح ديشا أغاروال ، طالبة دراسات عليا في مختبري. للبدء ، قم بإذابة زجاجة من مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. نقل الأنسجة المقطوعة إلى طبق بتري معقم 10 سم.
افحص الأنسجة بالمنظار وقم بتدوين ملاحظة إذا كانت تبدو دهنية شكليا أو وعائية أو نخرية. بالإضافة إلى ذلك ، سجل حجم وشكل الأنسجة والتقط صورة للنسيج مع عرض المسطرة. فرم الأنسجة إلى قطع صغيرة بمشرط معقم رقم 10 وانقلها إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
أضف 10 ملليلتر من ملليغرام لكل ملليلتر من محلول كولاجيناز IV وأغلق الأنبوب. ضع الأنبوب على شاكر مداري عند 37 درجة مئوية عند 140 دورة في الدقيقة لمدة 30 إلى 90 دقيقة بزاوية 30 درجة. أثناء الحضانة ، ضع قسامة من الوسط الكامل إلى التسخين المسبق عند 37 درجة مئوية في حبة أو حمام مائي.
كل 15 دقيقة ، أعد تعليق الأنسجة عن طريق الخلط لأعلى ولأسفل بقوة باستخدام ماصة مصلية معقمة ومغلفة مسبقا بخمسة ملليلترات. مراقبة التفكك بمرور الوقت من خلال مراقبة الأنبوب تحت المجهر بتكبير 5X أو أعلى. بمجرد فصل الأنسجة ، قم باستخدام جهاز الطرد المركزي عند 400 جرام لمدة خمس دقائق ، واستنشاق المادة الطافية ، وإضافة 10 ملليلتر من AdDF + مرة أخرى ، وأجهزة الطرد المركزي وشفط المادة الطافية بعناية ، حيث يمكن أن تكون كريات الأنسجة فضفاضة في بعض الأحيان.
إذا كانت حبيبات الأنسجة حمراء جزئيا ، أضف ملليلتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، أضف 10 ملليلتر من AdDF + إلى الأنبوب ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 جم لمدة خمس دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 50 إلى 300 ميكرولتر من مصفوفة غشاء القاعد البارد غير المخفف وخلطها عن طريق السحب بعناية لتجنب تكوين الفقاعات.
باستخدام صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار والتي يتم تسخينها مسبقا في الحاضنة طوال الليل ، لوحة 300 ميكرولتر من قبة مصفوفة الغشاء القاعدي التي تحتوي على مواد عضوية في كل بئر. اترك اللوحة دون إزعاج في الغطاء لمدة خمس دقائق قبل وضعها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة حتى تصلب قبة مصفوفة الغشاء القاعدي تماما. في نهاية الحضانة ، أضف ثلاثة ملليلتر من الوسط الكامل المسخن مسبقا إلى كل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد الحضانة ، التقط صورا للعضويات باستخدام هدف 5X على مجهر المجال الساطع المقلوب. ارفع قبة مصفوفة الغشاء القاعدي إلى الوسط في البئر باستخدام مكشطة خلية أو طرف ماصة سعة ملليلتر واحد. باستخدام طرف ماصة مطلي مسبقا ، انقل القبة العائمة للعضويات ذات الأنبوب المخروطي المتوسط إلى 15 أو 50 ملليلتر ، اعتمادا على عدد الآبار التي يتم حصادها.
ثم أضف DPBS لزيادة الحجم إلى خمسة ملليلتر على الأقل. تدور الأنابيب في 400 غرام لمدة خمس دقائق. تشكل مصفوفة الغشاء القاعدي مع المواد العضوية طبقة في الأسفل.
بعد استنشاق المادة الطافية ، أضف 5 إلى 20 ملليلتر من DPBS ، اعتمادا على عدد الآبار المجمعة في أنبوب. امزج حبيبات مصفوفة الغشاء القاعدي العضوي في DBPS باستخدام ماصة معقمة يمكن التخلص منها مطلية مسبقا. مرة أخرى ، أجهزة الطرد المركزي وتجاهل طاف.
باستخدام طرف ماصة مطلي ، أضف كاشف تفكك الخلايا بثلاثة أضعاف حجم مصفوفة الغشاء القاعدي وأعد تعليق المواد العضوية. ضع الأنبوب على شاكر مداري عند 37 درجة مئوية عند 140 دورة في الدقيقة لمدة 8 إلى 15 دقيقة في وضع زاوية. راقب الأنبوب من خلال مراقبته تحت المجهر كل خمس دقائق لضمان تقسيم المواد العضوية إلى مجموعات أصغر.
أضف AdDF + بحجم يساوي أو أكبر من كاشف تفكك الخلية والماصة لخلط المواد العضوية. تدور في 400 غرام لمدة خمس دقائق للحصول على بيليه عضوي. بمجرد الحصول على حبيبات عضوية بيضاء بدون مصفوفة غشاء قاعدي غير مذابة ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من AdDF + قم بتعويض الحجم إلى 10 ملليلتر باستخدام AdDF + قم بتدوير الأنبوب لخطوة الغسيل وتجاهل المادة الطافية.
أضف الكمية المطلوبة من مصفوفة الغشاء القاعدي إلى المواد العضوية المهضومة بناء على نسبة الانقسام المناسبة. امزجه عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل لتجنب تكوين فقاعات وضعه على الثلج على الفور. لوحة 300 ميكرولتر قباب من المواد العضوية المعاد تعليقها في مصفوفة غشاء القاع في لوحة ستة آبار دافئة مسبقا.
اترك اللوحة دون إزعاج في الغطاء لمدة خمس دقائق قبل وضعها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 إلى 30 دقيقة حتى تصلب القباب. في نهاية الحضانة ، وثلاثة ملليلتر من الوسط الكامل المسخن مسبقا لكل بئر ووضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة. أضف وسطا كاملا طازجا كل خمسة إلى سبعة أيام.
تختلف الخطوط العضوية المختلفة لأورام الثدي المشتقة من المريض في التشكل ومعدل النمو. تشبه عضويات الثدي الطبيعية وعدد قليل من سرطانات الأقنية المبكرة في الكائنات العضوية المشتقة من C2 بنية الثدي الطبيعية ، مع تجويف مركزي محاط بخلايا الأقنية. تميل المواد العضوية المشتقة من السرطان الفصيصي الغازي إلى تكوين هياكل تشبه عناقيد العنب متصلة بشكل فضفاض.
وفي الوقت نفسه ، تميل الكائنات العضوية المشتقة من سرطانات الأقنية الغازية إلى تكوين عضويات كثيفة وكبيرة ومستديرة. تم قياس نمو الكائنات العضوية باستخدام مقايسة صلاحية الخلية المضيئة في الأيام الثالث والسادس والتاسع و 12 ، مع قراءة خط الأساس في اليوم الأول بعد الطلاء. يتم عرض صور المجال الساطع لنفس الكائنات العضوية التي تم توسيعها بمرور الوقت هنا.
بعض الخطوط العضوية المشتقة من المريض لها وقت مضاعف لمدة يومين ، بينما يستغرق البعض الآخر خمسة أيام. من المهم التحلي بالصبر مع خطوط عضوية معينة بطيئة في التأسيس. في تجربتنا ، فإن زيادة كثافة الطلاء أو تصفية الحطام يعزز نمو PDOs.
تعتبر المواد العضوية المشتقة من المريض ، أو PDOs ، نماذج ممتازة لفحص الأدوية. إنهم يصممون تفاعلات الخلايا الخلوية وكذلك المصفوفة الخلوية خارج الخلية التي تعتبر أساسية لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للسرطان. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تخضع PDOs للتلاعب الجيني ويمكن استخدامها لتطوير الطعوم الخارجية في أنظمة الاستزراع المشترك ، مما يجعلها نماذج رائعة للدراسات الآلية.
