אנו מודים לורנה רנשו (יחידת השד אדינבורו) לקבלת סיוע שלא יסולא בפז לה בהשגת דגימות קליניות. שימוש בחומר הגידול אושרה על ידי מחקר Lothian ועדת האתיקה (08/S1101/41) וקיבלנו בחסות Experimental Medicine סרטן מרכז התוכנית (אדינבורו). עבודה זו נתמכת על ידי המועצה הסקוטית מימון. הליגה נגד השמצה היא מרגרט מיס באטרס Reekie בחור בנאמנות קלינית.

1. מחלץ קולגן מ זנבות עכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום קפוא זנבות עכברוש טרי אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deglove והעור שמעליה עם גידים חשיפת אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצועת הגידים מן הזנב מקום אתנול 70% לעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הגידים נאספים להעביר חומצה אצטית (גיד 1g ל 250 מ&quot;ל חומצה אצטית 0.5m). מערבבים עבור 48hr ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תמהיל חומצה גיד / אצטית ב g 10,000 עבור 30 דקות וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של 10% (w / v) NaCl כדי supernatant ולאפשר לתערובת לעמוד לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את שכבת קולגן עשיר, תחתית מסיס ו centrifugate במשך 30 דקות נוספות על 10,000 g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend קולגן עשיר החומר חומצה אצטית 0.25M ב 4 ° C ו dialyse נגד חומצה אצטית 1:1000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים, שינוי חיץ דיאליזה פעמיים ביום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לעקר את הפתרון קולגן על ידי צנטריפוגה (20,000 g עבור 2hr) ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל קולגן כנדרש עם תוספת של חומצה אצטית סטרילי 1:1000 ריכוז מלאי של 1mg/ml. </li></ol> 2. 3D יצירה Assay Assay 3D מבוסס על assay קו התא, שפורסמו בעבר 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביופסיות מרובות ליבה נקצרים מן הסכמה חולים בזמן כריתה כירורגית מרפא עבור סרטן שד פולשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפי העין, לחלק את ליבות באמצעות אזמל לתוך 1mm 3 שברים. חתוך וזורקים שומן ברורים macroscopically. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את שברי בתקשורת השלם MEGM. הרקמה ניתן לאחסן במצב זה עד 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור את ג&#39;ל קולגן, על תמהיל קולגן קרח 1mg/ml זנב חולדה, 1:1000 חומצה אצטית מסונן, DMEM/F12 10x ו 0.22M NaOH ביחס של 3:5:1:1 ליצירת קולגן הריכוז הסופי של 0.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 1.2ml של תערובת קולגן לתוך בארות בודדים של צלחת 24 היטב לתוך מקום באינקובטור ב 37 מעלות 10min ליזום gelling. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10min, הסר את צלחת גם 24 מתוך החממה. מניחים את חתיכות הגידול על הקולגן gelling בעדינות לדחוף אותם אל מרכז ג&#39;ל באמצעות קצה 10μl פיפטה. מחזירים את הצלחת היטב 24 את החממה עבור 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ER + גידולים, תוספת התקשורת השלם MEGM עם β-oestradiol ריכוז של 3.2x10 -10 מ &#39; לאחר מבחני ג&#39;ל יש בג&#39;ל עבור 1 שעות, בזהירות להציג 1.2ml של התקשורת השלים לבאר כל אחד. הריכוז הסופי β-oestradiol בתוך assay יהיה equilibriate ל -10 1.6x10 M לשחזר את רמות האסטרוגן פיזיולוגיים למצוא רקמת השד 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל טיפ פיפטה 10μl מסביב לקצה הפנימי של כל טוב, שחרור כל ג&#39;ל circumferentially, ובכך מאפשר ג&#39;ל כל לצוף בחופשיות בתוך התקשורת. מחזירים את הצלחת היטב 24 אל האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שערי בתוספת התקשורת פעמיים בשבוע עד תום הניסוי. לסיים את הניסוי על ידי הסרת התקשורת והוספת מקבע פורמלין. </li></ol> 3. נוגדן מכתים של Assay לקראת הקרנת טומוגרפיה אופטית אימצנו שיטה שפורסמו בעבר עבור כל דגימה 4 מכתים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קבוע דגימות בפורמלין עבור 30 דקות ב-PBS. מייבשים את הג&#39;לים בשלבים של מתאנול מדולל PBS המכיל 0.05% Tween 20 (0.05% PBST): 33%, 66% ו 100% ≥ 15min בכל שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמות MeOH מוכן טרי: DMSO: 30% H 2 O 2 ביחס של 02:01:03 (15% v / v H 2 O 2) בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות כדי לכבות את autofluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות פעמיים בתוך 30 דקות מתנול. להקפיא את דגימות -80 ° C חמש פעמים לפחות 1 שעות בכל פעם בחזרה לטמפרטורת החדר (RT) על מנת להבטיח כי אנטיגנים בחלקים עמוקים יותר של רקמת ניתנים נגיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם רקמת חזרה PBST 0.05% עם מתנול כפי diluent (33%, 66% ו -100% עבור 15min בכל שלב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הרקמה חוסמים פתרון (10% בסרום PBST 0.05%) עבור 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמה עם נוגדן ראשוני לזהות את התוכן אפיתל, באמצעות ארנבת אנטי cytokeratin בריכוז של 1:500 מדולל 1.5ml של פתרון חסימת המכילה DMSO 5% 48hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות ארבע פעמים עם PBST 0.05% עבור כל 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמה עם נוגדן פלואורסצנטי משני (1:100 עיזים נגד ארנב Alexa555), בדילול מלא בתמיסה המכילה DMSO חסימת 1.5ml 5% 48hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את דגימות שוב עם 0.05% ארבע פעמים PBST עבור 30 דקות כל אחד. </li></ol> 4. הקרנה אופטי טומוגרפיה טומוגרפיה הקרנה אופטית היא טכניקה מיקרוסקופיה שפותחה בעבר כדי להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה 3D של דגימות ביולוגיות ניאון עם עובי של עד 15 מ&quot;מ 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר יםג&#39;ל מזרקת ב 1% נקודת התכה נמוכה agarose ו מייבשים מתנול ב 100% עבור 24 שעות. נקה את הדגימה ב באב פתרון (01:02 בנזיל אלכוהול, בנזיל בנזואט) עבור 48hr ולסרוק בעזרת סורק הכבושים 3001M (Bioptonics). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני היעד autofluorescence נלכדים באמצעות מערכת Cy3 המסנן (exciter 545nm/30 ננומטר, פולט 610/75 ננומטר) GFP1 להגדיר מסנן (exciter 425nm/40 ננומטר, LP475 ננומטר פולט) בהתאמה. </li></ol> 5. שחזור וכימות 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט התחזיות זוויתיים נרכשה על ידי הכבושים ניתן לשחזר באמצעות תוכנה NRecon (SkyScan) כדי ליצור סדרה של פרוסות חתך דרך assay את הפלישה. תוכנה זו זמינה להורדה בחינם ב <a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הנתונים מחדש באמצעות תוכנת Volocity (PerkinElmer). תוכנות הדגמה חינם זמין להורדה ב <a href="http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/">http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לכמת נפח אפיתל על ידי מכתים cytokeratin, להגדיר voxel מינימום עוצמת סף להפחית מהפרעות הקרינה רקע בערוץ היעד. הגדרנו את זה באופן אמפירי על סף 9000 au באמצעות רשימה של פרמטרים זמינים יישום המדידה, אנו לכמת את עוצמת הקול של אפיתל ברצף עם ליבת המקורי (התחום בערוץ autofluorescent). זו אפשרה לנו לכמת כרכים של תולדה אפיתל בין שונים הגידול דגימות. </li></ol> 6. נציג תוצאות: במהלך הפיתוח של assay, סך של סרטן השד 52 דגימות ביופסיה עם מגוון רחב של histopathology כבר בשימוש. מבין אלה &lt;10% (5 / 52) לא הצליחו לספק לפחות אחד assay הפלישה קיימא. הכישלון נבע Assay או חיידקי העל זיהום או מספיק חומר ביופסיה הגידול. לכן הבקשה של assay אינו מוגבל תת סוג מסוים של סרטן השד. מבחני טיפוסית (איור 1) לאחר 20 ימים קבוע בתרבות קולגן מוכתם לאחר מכן עבור cytokeratin. תוכנה Volocity הוא מסוגל לזהות גם את עיקר אפיתל רציפה עם ליבת המקורי קבוצות מנותקים פולשים לתאים ולכמת כל כרך בנפרד. <img src="/files/ftp_upload/3085/3085fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הפלישה מבחני הבאים קיבעון וכימות. Assay תומכת דגימות שהתקבלו תת סרטן השד מרובות: א) ER + b) HER2 + ג) ER-.

<ol>
	<li>Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+precursors+revisited:+molecular+features+and+progression+pathways.+Histopathology.">Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.</a> 57, 171-192 (2010).</li><li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs:+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited.">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).</li><li>Dabrosin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+extracellular+local+levels+of+estradiol+in+normal+breast+in+vivo+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle.">Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).</li><li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs.">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li><li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies.">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li><li>Hidalgo-Carcedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+requires+suppression+of+actomyosin+at+cell-cell+contacts+mediated+by+DDR1+and+the+cell+polarity+regulators+Par3+and+Par6.">Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6.</a> Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).</li><li>Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+on+the+HER2+amplicon,+C35,+is+an+oncogene+in+breast+cancer+whose+actions+are+prevented+by+inhibition+of+Syk.">A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk.</a> Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).</li><li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53.">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li></ol>

לתפור JF מועסקים על ידי MRC טכנולוגיה, המהווה מסחור Bioptonics סורקים הכבושים. מחברים אחרים מצהירים שום ניגוד עניינים.

קולגן מבוססי מבחני ללמוד את ההתנהגות של שורות תאים סרטניים נמצאים כעת בשימוש נרחב 6,7,8. עם זאת, מבחני אלה לא בא לידי ביטוי במורכבות מלאה של הגידול וסביבתו. במחקר זה, אנו מראים כי חומרים סרטן השד אנושי יכול לשמש באופן דומה, לשעבר vivo. יתר על כן, הפלסטינים הכבושים הוא כלי שימושי כדי לאפיין את התפשטות 3D של סרטן השד. מצאנו כי המגבלה העיקרית של הטכניקה הזו הוא הזמינות של חומרים הגידול (יחיד הליבה ביופסיה מספיק עבור מבחני 4-6). גורם נוסף המגביל הוא כי הפלישה מבניים מתרחשת רק כ -40% של מבחני. כדי להתגבר על זה, אנחנו באופן קבוע להוסיף כל טיפול הרצוי סביב יום 7 לכל מבחני עם צמיחה גלוי. השימוש של השטחים הכבושים ניתן יהיה להרחיב בעתיד גם לזהות שינויים בתפזורת, vivo לשעבר, הנובע טיפול תרופתי. זה בתורו יכול להקל בטיפול בסרטן פרטנית יותר, עצמאיים של מודלים של בעלי חיים. כרגע אנחנו בוחנים את התגובה של ER + גידולים vivo לשעבר טמוקסיפן.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> השלם MEGM </td><td> Lonza </td><td> CC-3150 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D8900 10X1L </td></tr><tr><td> β-oestradiol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> E8875-טבליות של 250 </td></tr><tr><td> הארנב נגד cytokeratin </td><td> Dako </td><td> Z0622 </td></tr><tr><td> עיזים נגד ארנב Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr></tbody></table> ריאגנטים כל תקן אחרים התקבלו סיגמא אולדריץ.

long-term culture of human breast cancer specimens and their analysis using optical projection tomography

סרטן השד הוא הגורם המוביל לתמותה בעולם המערבי. היא מבוססת היטב כי התפשטות של סרטן השד, תחילה מקומית ולאחר מכן distally, היא גורם מרכזי פרוגנוזה המטופל. מערכות ניסיוני של סרטן השד מסתמכים על שורות תאים שמקורם בדרך כלל גידולים ראשוניים או השתפכויות פלאורלי. שני המכשולים העיקריים המעכבים את המחקר הזה: (i) ידוע כמה תתי סוגים של סרטן השד (בעיקר העניים luminal הפרוגנוזה גידולים B) אינם מיוצגים בתוך אוספים הקו הנוכחי (ii) את ההשפעה של microenvironment הגידול לא נלקח כלל בחשבון. אנו להפגין טכניקה ראשונית תרבות סרטן השד דגימות של כל סוגי המשנה. זו מושגת על ידי שימוש תלת ממדי (3D) מערכת התרבות שבה חתיכות קטנות של גידולים המוטבעים קולגן עכברוש רך אני כריות. בתוך 2-3 שבועות, בתאי הגידול התפשט לתוך קולגן ויוצרים מבנים שונים הדומים לאלו שנצפו tumours1 האדם. Adipocytes קיימא, תאים אפיתל fibroblasts בתוך הליבה המקורית ניכרו על היסטולוגיה. תאים אפיתל ממאירים עם מורפולוגיה squamoid היו הפגינו הפולש לתוך קולגן שמסביב. Pleomorphism גרעיני ניכרה בתוך תאים אלה, יחד עם דמויות mitotic גופים אפופטוטיים. יש לנו תחזית המועסקים טומוגרפיה אופטית (הכבושים), טכנולוגיית הדמיה 3D, על מנת לכמת את מידת התפשטות הגידול בתרבות. השתמשנו הכבושים כדי למדוד את נפח עיקר הגידול תרבות, פרמטר נמדד באופן שגרתי במהלך טיפול ניאו אדג&#39;ובנטי של חולות סרטן השד על מנת להעריך תגובה לטיפול תרופתי. כאן, אנו מציגים הזדמנות גידולים התרבות האנושית השד ללא משוא פנים תת סוג ולכמת את התפשטות vivo אלה לשעבר. שיטה זו יכולה לשמש בעתיד כדי לכמת את רגישות התרופה בגידול המקורי. זו עשויה לספק מודל החיזוי יותר שורות תאים המשמשים כיום.

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography at JoVE.com

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

פיתחנו מבוססי קולגן<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay המקדמת התפשטות ופלישה דגימות של כל תת סרטן השד. טומוגרפיה הקרנה אופטית, טכניקה three מיקרוסקופיה ממדי נוצל כדי לחזות ולכמת התפשטות הגידול. Assay זה עשוי לשמש לכמת תגובה התרופה של דגימות גידולים בודדים.

לטווח ארוך של תרבות האדם סרטן השד דוגמאות וניתוח שלהם באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

long-term-culture-human-breast-cancer-specimens-their-analysis-using

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Views.  University of Edinburgh. פיתחנו מבוססי קולגן במבחנה Assay המקדמת התפשטות ופלישה דגימות של כל תת סרטן השד. טומוגרפיה הקרנה אופטית, טכניקה three מיקרוסקופיה ממדי נוצל כדי לחזות ולכמת התפשטות הגידול. Assay זה עשוי לשמש לכמת תגובה התרופה של דגימות גידולים בודדים.

Video: Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

לטווח ארוך הדמיה בתאי יונקים באמצעות מיקרוסקופית שדה רחב

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

נורמליזציה נולד עבור טומוגרפיה Fluorescence הקרנה אופטית עבור הדמיה בלב שלם

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

A simple method to derive and maintain spermatogonial stem and progenitor cell lines from adult mice is presented here. The method utilizes feeder cells originating from the somatic cell compartment of the adult mouse testis. This technique is applicable to common mouse strains, including transgenic, knock-out, and knock-in mice.

העשרה סידורית של גזע Spermatogonial ותאי אב (SSCs) בתרבות לגזירת קווי SSC מאוסים למבוגרים לזמן ארוך

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...