الكتاب أشكر بتبريد للتمويل. ونحن نشكر أيضا Cagri Yalgin ، Delandre كارولين باريش وجاي لاجراء مناقشات حول بروتوكولات الوراثية والمناعية.

1.Preparation الكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد الكالسيوم + + خالية HL3.1 28 المالحة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في ملي : 70 كلوريد الصوديوم ، 5 بوكل ، 20 MgCl 2 ، 10 NaHCO 3 و 5 HEPES ، والسكروز 115 ، وطرهالوز 5 ؛ الهيدروجيني 7.2. تعقيم وتصفية المحل في 4 درجات مئوية. ملاحظة : الكالسيوم + + خالية حل يمنع تقلص العضلات أثناء تشريح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل بولي - L - يسين (PLL) coverslips. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب في الماء 100mg PLL 4.2ml وجعل aliquots 300μl في أنابيب إيبندورف والتجميد في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل coverslips طلاء ، أذاب أولا قسامة ، وجعله يصل إلى 10ML في DDH 2 O وإضافة 20μl كوداك فوتو فلو ؛ تركيز PLL النهائي هو 0.7 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips ليغرق في حل 30mins PLL ، لإزالة والجافة ، لفترة وجيزة ثم يشطف بالماء والجافة. كرر مرتين. تعامل coverslips مشاركة حوالي شهر واحد. </li></ol></li></ol> 2. الوراثية الصلبان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tس تولد الحيوانات المستنسخة MARCM. هنا هو المثال عبر استخدام برنامج لعموم DA 11،27 : س FRT2A hsFLP ؛ Gal4 109 (2) 80 ، UAS - mCD8 : GFP ؛ الحوض ، Gal80 FRT2A/SM5-TM6B </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد FLP التدريجي الحيوانات المستنسخة. هنا هو المثال عبر استخدام IV - فئة محددة سائق (8) : PPK - X Gal4 YW ، hsFLP ؛ UAS - FRT - CD2 ، ذ + للتوقف FRT - mCD8 : GFP </li></ol> 3. جمع الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الصلبان ذبابة الفاكهة في زجاجة جمع عند 25 درجة مئوية ، وجمع الأجنة على آغار عصير التفاح نشر 29 لوحة مع طبقة رقيقة من معجون الخميرة 30،31. </li></ol> 4. الحرارة العلاج بالصدمة للأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان لوحة فارغة في المعارضة لوحة عصير التفاح أغار عليها التي زرعت الأجنة. ختم حول هذه اللوحات مع اثنين Parafilm (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصدمة الحرارية خلال ال يغرقاللوحة الإلكترونية في حمام مائي وأنه عقد لأسفل باستخدام وزن المعدن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للأجنة MARCM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مبلل جمع الأجنة ل2H واحتضان في 10cm طبق بتري محاطة الأنسجة عند درجة 25 ل2H إضافية. ملاحظة : ضبط بروتوكول الصدمة الحرارية يغير من التردد التي يتم إنشاؤها استنساخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعدد أصغر من الحيوانات المستنسخة ، وذلك بهدف عزل الخلايا العصبية واحد ، والصدمة الحرارية يغرق في حمام مائي ل1H في 38 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعدد أكبر من الحيوانات المستنسخة ، والصدمة الحرارية لل45mins عند 38 درجة مئوية ، في استرداد RT 30mins ، ثم الصدمة الحرارية مرة أخرى ل30mins إضافية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع FLP التدريجي للأجنة 24H ، والصدمة الحرارية ل1H في 38 درجة مئوية. </li></ol> 5. الكشف عن الحيوانات المستنسخة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الصدمة الحرارية ، وإزالة غطاء محكم الترتيب المياه ووضع لوحة آغار عصير التفاح في طبق بتري 10cm تحيط بها الأنسجة مبلل. ثقافة الأجنة واليرقات لاحقة عند 25 درجة مئوية حتى يهيمون على وجوههمجي 3 الثالثة طور مرحلي. ملاحظة : لقد ثبت أن ظروف التربية والتغذية بشكل خاص ، لتغيير DA مورفولوجيا الشجرة شجيري 32،33. تأكد من أن اليرقات المتزايد في الحصول على عجينة الخميرة في جميع الأوقات ، ورصد وتجديد الخميرة لصق كما هو مطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من هذه النقطة فصاعدا في البروتوكول ، والتعامل معها برفق باستخدام ملقط يرقات الحشرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة وبلطف شطف اليرقات في مياه الحنفية ، ثم وضع على لوحة آغار. ملاحظة : هذه الخطوة تقلل الخلفية لصناعة السيارات في مضان من الغذاء أو الأوساخ على سطح اليرقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة اليرقات تحت المجهر مضان قوية تشريح. تحديد اليرقات مع GFP إيجابية الخلايا العصبية / الخلايا في جدار الجسم. </li></ol> 6. التصوير في الجسم الحي من التشعبات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليرقة إلى مكان هبوط الشريحة الزجاجية مع نقطة من الجلسرين 80 ٪. وضع ساترة على الشريحة لشل حركة اليرقة. ضمان عدم وجود الهواء لا تزال قائمة بين اليرقة وcoversli للص </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع برفق ساترة للفة اليرقة للسماح التصور من الخلايا العصبية في المصالح. صورة mCD8 : GFP المسمى جذع شجيري عبر المجهري متحد البؤر. </li></ol> 7. اليرقات تشريح ملاحظة قبل البداية : DA التشعبات العصبيه تتحلل بسرعة بعد بدء تشريح. تشريح كل يرقة الفردية في أقل من 5min لضمان حسن تغصن التشكل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح 3 تجول اليرقات طور مرحلي الثالث على طبق من ذهب كما هو موضح سابقا Sylgard 34 مع التعديلات التالية : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصوير محوار DA مصطلحات عصبون ، تأكد من أن الجهاز العصبي المركزي سليمة وليست مقطوعة الأعصاب قطعي. بعد فتح اليرقات ، وأول خفض بعناية اتصالات القصبة الهوائية لجدار الجسم بلطف ثم إزالة الأمعاء بأكملها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان التصوير التشعبات وحدها ، إزالة الجهاز العصبي المركزي للسماح للتملق في تصاعد مستمر. </li></ol></li></ol> 8. Fixatايون ومنع اليرقات من شرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع اليرقة لا تزال معلقة على لوحة Sylgard ، بإصلاحه في PFA 4 ٪ في برنامج تلفزيوني عن 20mins في RT على شاكر الدورية بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة آثار لأنسجة اليرقات (الدهون في الجسم والقصبة الهوائية ، الخ.) بعد التثبيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل في PBST (PBS بنسبة 0.1 ٪ تريتون X - 100) 10mins 3X على لوحة Sylgard وشاكر. إذا كان فحص مصطلحات محوار ، والحفاظ على فيليه على لوحة Sylgard. (إذا التشعبات تلطيخ فمن الممكن لنقل اليرقات إلى شرائح أنبوب 0.5 مل في هذه الخطوة 34) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة اليرقات في ل20mins RT 5 ٪ في المصل الحمار العادي (NDS) في PBST على شاكر. </li></ol> 9. تلطيخ شرائح اليرقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحجب والحل في احتضان الضد الأساسية (في 5 ٪ NDS / PBST) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في وعاء صغير محاط تثبرور مبلل الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنابيب من 4 درجات مئوية ، واحتضان ساعة إضافية في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 10mins 6X في PBST. إضافة antib الثانويةody (في 5 ٪ NDS / PBST) ، وغطاء لمنع الصور تبيض fluorophore 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إما في احتضان RT لمدة ساعتين ، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية تليها ساعة واحدة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 10mins اليرقات في PBST 6X ، والشروع في التركيب. </li></ol> 10. تصاعد شرائح اليرقات لفحص جذع تغصن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل جبل فيليه كما شقة ممكن اليرقات باستخدام مقص أو مشرط تشريح بقطع الرأس (بما في ذلك الفم السنانير) والخلفي (بما في ذلك spiracles) 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع فيليه اليرقات على الشريحة إهاب من جانب إلى أسفل ، في جبل الجلسرين 80 ٪ ، وختم على جانبي مع طلاء الأظافر ساترة لجبل &#39;سريع&#39; 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصاعد دائم وصورة أكثر وضوحا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اليرقات فيليه تشريح العضلات الجانب السلبي على قطرة من برنامج تلفزيوني على PLL ساترة ، وسوف تنضم سريعا إلى ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كسائل أكبر قدر ممكن بعد تصاعد مستمر ، وhoweveص لا اتركه حتى يجف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ ساترة (مع فيليه اليرقات المرفقة) من خلال سلسلة الايثانول : الإيثانول 35 ٪ ، يليه بنسبة 50 ٪ ، 70 ٪ ، 95 ٪ ، وأخيرا 2X الإيثانول بنسبة 100 ٪ لكل 10 دقائق (ينبغي تغيير 2 حل EtOH 100 ٪ في كثير من الأحيان ) ، وأخيرا ، يغسل 2 - 3X 10mins في الزايلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة من mountant DPX (Distyrene الزيلين تلدين) على شريحة نظيفة ووضع بعناية من جانب شرائح ساترة لأسفل على أعلى. نضع في الظلام ، والانتظار ليوم واحد لضبط DPX قبل التصوير. </li></ol></li></ol> 11. تصاعد شرائح اليرقات لدراسة مصطلحات محوار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الأعصاب القطعي بين تشغيل الجهاز العصبي المركزي والمحيطي سليمة أثناء التثبيت ، التشريح ، والتلوين للسماح للبحث عن المفقودين من محاور عصبية من الخلايا العصبية الحسية المحيطية جسم الخلية إلى فنك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل جبل اليرقات فيليه إهاب ، الجانب السلبي في الجلسرين 80 ٪ في شريحة الاكتئاب. تتبع محاور عصبية من خلايا الجسم إلى DAVNC تحت المجهر متحد البؤر. ملاحظة : الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المحيطي كل قطعة مشروع جدار الجسم إلى الجزء وما شابه ذلك من فنك. </li></ol> 12. ممثل النتائج : وتظهر نتائج ممثلة في الأرقام 3-5. التين. 3 يبين الشجرة بأكملها من الخلايا العصبية دا الطبقة الرابعة ، التي احتلتها في الجسم الحي تحت المجهر متحد البؤر. التين. 4 يظهر قرب جزء من جذع تغصن من الخلايا العصبية المسماة immunohistochemically من الدرجة الثالثة التي لم يحدد بشكل صحيح للحفاظ على شكلها. وأقحم المرتبطة يظهر تدهور التي يمكن أن تحدث بعد تشريح ناجحة والتثبيت (كلاهما ملطخة مكافحة GFP الضد). التين. 5 معارض واحد صول الطبقة الرابعة محور عصبي في الجهاز العصبي المركزي (مكافحة GFP ، والأخضر) ، كلها مصطلحات الطبقة الرابعة المشارك ملطخة مكافحة CD2 (قرمزي). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig1.jpg" /> الشكل 1 نظرة عامة على البروتوكول. أ) جمع والأجنة ثم حرارة الصدمة. ب)<html> حدد اليرقة مع استنساخ الخلايا العصبية GFP - DA إيجابية ، ومن ثم صورة GFP المسمى تغصن الشجرة في يرقة حية. ج) تشريح يرقة ، ومن ثم وصمة عار في immunohistochemically فيليه. د) وجبل فيليه الملون ، ثم صورة الشجرة شجيري والإسقاطات محواري من استنساخ الخلايا العصبية DA. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig2.jpg" /> الشكل 2 إعداد لوحة عصير التفاح أغار من الصدمة الحرارية. تأخذ لوحة (أبيض السهم ، أ ب) ، إضافة إلى طبق بتري الثاني على أعلى (السهم الأحمر ب) وختم حولها مع Parafilm (السهم الأزرق ، ب). <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig3.jpg" /> الرقم 3 في الصورة الحية من جذع تغصن من mCD8 : GFP المسمى استنساخ MARCM (كما هو الحال في النمط الجيني 2.1) وهو ما يمثل الدرجة الرابعة (v&#39;ada) الخلايا العصبية لاليرقة 3 طور مرحلي الثالثة. شريط المقياس 50μm. d/3111/3111fig4.jpg &quot;/&gt; الشكل 4 mCD8 : GFP المسمى MARCM استنساخ الخلايا العصبية من الدرجة الثالثة (ddaA) ملطخة مكافحة GFP الأضداد ، وتبين بعد تشريح مورفولوجية جيدة وناجحة التثبيت (الخضراء). وأقحم تدهور تغصن معارض (السهام البيضاء) التي تحدث بعد تشريح ناجحة والتثبيت (قرمزي). شريط المقياس 25μm. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig5.jpg" /> الشكل 5 3 والثالثة طور مرحلي اليرقات VNC. تم الكشف عن استنساخ FLP التدريجي من محطة واحدة من الدرجة السادسة محوار (vdaB) (كما هو الحال في النمط الجيني 2.2) استخدام الألغام المضادة للGFP الأضداد (الخضراء). مكافحة CD2 جميع التسميات الصف الرابع مصطلحات (قرمزي). شريط المقياس 25μm.

<ol>
	<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons.">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li><li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila:+the+role+of+Collier.">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315, 232-242 (2008).</li><li>Hattori, Y., Sugimura, K., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+Knot/Collier,+a+transcriptional+regulator+of+the+EBF/Olf-1+family,+endows+the+Drosophila+sensory+system+with+neuronal+class-specific+elaborated+dendritic+patterns.">Selective expression of Knot/Collier, a transcriptional regulator of the EBF/Olf-1 family, endows the Drosophila sensory system with neuronal class-specific elaborated dendritic patterns.</a> Genes Cells. 12, 1011-1022 (2007).</li><li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knot/Collier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape.">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li><li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt.">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43, 809-822 (2004).</li><li>Li, W., Wang, F., Menut, L., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BTB/POZ-zinc+finger+protein+abrupt+suppresses+dendritic+branching+in+a+neuronal+subtype-specific+and+dosage-dependent.">BTB/POZ-zinc finger protein abrupt suppresses dendritic branching in a neuronal subtype-specific and dosage-dependent.</a> 43, 823-834 (2004).</li><li>Zlatic, M., Landgraf, M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+specification+of+axonal+arbors:+atonal+regulates+robo3+to+position+terminal+branches+in+the+Drosophila+nervous+system.">Genetic specification of axonal arbors: atonal regulates robo3 to position terminal branches in the Drosophila nervous system.</a> Neuron. 37, 41-51 (2003).</li><li>Grueber, W. B., Ye, B., Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrites+of+distinct+classes+of+Drosophila+sensory+neurons+show+different+capacities+for+homotypic+repulsion.">Dendrites of distinct classes of Drosophila sensory neurons show different capacities for homotypic repulsion.</a> Curr Biol. 13, 618-626 (2003).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons.">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112, 805-818 (2003).</li><li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hamlet,+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology.">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li><li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+regulating+dendritic+outgrowth,+branching,+and+routing+in+Drosophila.">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+mechanisms+to+define+neuron+class-specific+dendrite+arbor+morphology.">Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology.</a> Cell Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).</li><li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila.">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Mol. Cell. Neurosci. 35, 383-396 (2007).</li><li>Nishimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Behaviors+and+Segmental+Coordination+During+Larval+Locomotion+Is+Disrupted+by+Nuclear+Polyglutamine+Inclusions+in+a+New+Drosophila+Huntington's+Disease-Like+Model.">Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model.</a> J Neurogenet. 24, 194-206 (2010).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li><li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li><li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion.">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19, 799-806 (2009).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Larval+CNS+in+Drosophila+Melanogaster.">Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (1), e85-e85 (2006).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Merritt, D. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+sensory+neurons+in+the+Drosophila+embryo+correlate+with+sensory+modality,+soma+position,+and+proneural+gene+function.">Central projections of sensory neurons in the Drosophila embryo correlate with sensory modality, soma position, and proneural gene function.</a> J Neurosci. 15, 1755-1767 (1995).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development.">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130, 5065-5072 (2003).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Wong, A. M., Wang, J. W., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+representation+of+the+glomerular+map+in+the+Drosophila+protocerebrum.">Spatial representation of the glomerular map in the Drosophila protocerebrum.</a> Cell. 109, 229-241 (2002).</li><li>Shimono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidendritic+sensory+neurons+in+the+adult+Drosophila+abdomen:+origins,+dendritic+morphology,+and+segment-+and+age-dependent+programmed+cell+death.">Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death.</a> Neural Dev. 4, 37-37 (2009).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Kaczynski, T. J., Gunawardena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+Embryonic+Nervous+System+in+Whole-mount+Drosophila+Embryos.">Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (46), e2150-e2150 (2010).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+forward+genetic+screen+for+identifying+mutations+affecting+larval+neuronal+dendrite+development+in+Drosophila+melanogaster.">A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 172, 2325-2335 (2006).</li><li>Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LKB1+and+AMPK+maintain+epithelial+cell+polarity+under+energetic+stress.">LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress.</a> J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).</li><li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Larval+NMJ+Immunohistochemistry.">Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons.">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li><li>Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+the+Drosophila+neuropile:+a+strategy+for+the+standardised+characterisation+of+genetically+amenable+neurites.">Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites.</a> Dev Biol. 260, 207-225 (2003).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ويرقات ذبابة الفاكهة نموذجا عصبون DA يوفر نظام واحد وراثية ممتازة للتحقيق في الآليات التي تحكم مورفولوجيا الخلايا العصبية وتشكيل الدائرة. يستخدم عادة لوضع العلامات وMARCM لتوليد متحولة DA استنساخ الخلايا العصبية. لMARCM نستخدمها إما لعموم العصبية (مثل Gal4 ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><th> اسم الكاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليق (اختياري) </th></tr><tr><td> SZX16 مجهر تشريح مضان (مع GFPHQ فلتر) </td><td> اوليمبوس </td><td> SZX16 </td><td></td></tr><tr><td> تعيش الحشرة الملقط </td><td> FST </td><td> 26030-10 </td><td></td></tr><tr><td> 26mm خ 76mm الشريحة الاكتئاب الزجاج </td><td> شركة Toshinriko </td><td> T8 - R004 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 (أو Silpot 184) </td><td> داو كورنينج </td><td> 3097358-1004 </td><td></td></tr><tr><td> بولي - L - يسين </td><td> سيغما </td><td> P - 1524 </td><td> وقد أثبت هذا المنتج الأكثر فعالية </td></tr><tr><td> DPX تصاعد المتوسطة </td><td> سيغما </td><td> 44581 </td><td></td></tr><tr><td> أرنب المضادة للGFP </td><td> Invitrogen </td><td> A - 11122 </td><td> التخفيف 1:500 </td></tr><tr><td> مكافحة الفئران CD8 </td><td> Caltag </td><td> 5H10 </td><td> التخفيف 1:200 </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للCD2 </td><td> ABD serotec </td><td> MCA443R </td><td> التخفيف 1:700 </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للFasciclin2 </td><td> DSHB </td><td> 1D4 </td><td> تخفيف 01:10 </td></tr></table>

morphological analysis of drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics

تطوير النظام العصبي يتطلب مواصفات الصحيح للموقف الخلايا العصبية والهوية ، وتلتها دقيقة عصبون التنمية شجيري فئة محددة والأسلاك محواري. مؤخرا أصبحت شجيري تشجر (DA) الخلايا العصبية الحسية لنظام ذبابة الفاكهة اليرقات العصبي الطرفي (المحيطي) نماذج الوراثية القوية التي لتوضيح الآليات العامة على حد سواء ، وفئة محددة من تمايز الخلايا العصبية. هناك أربع فئات رئيسية DA الخلايا العصبية (I - IV) 1. أنها تتم تسمية من أجل زيادة تعقيد تغصن الشجرة ، ولها فئة محددة الاختلافات في التحكم الجيني للتمايز من 2-10. نظام DA الحسي هو نموذج عملي لتحقيق في الآليات الجزيئية وراء السيطرة على التشكل شجيري 11-13 للأسباب التالية : 1) أنه يمكن الاستفادة من الأدوات الجينية القوية المتاحة في ذبابة الفاكهة ، 2) الخلايا العصبية DA تغصن جذع ينتشر سوى 2 في أبعاد اسفل كلي بصرياع اليرقات بشرة مما يجعل من السهل تصور مع دقة عالية في الجسم الحي ، 3) التنوع في فئة محددة مورفولوجيا شجيري يسهل إجراء تحليل مقارن للعثور على السيطرة على العناصر الرئيسية في تشكيل الأشجار التغصنية بسيطة مقابل تشعبت للغاية ، و 4) شجيري جذع النمطية أشكال مختلفة من الخلايا العصبية DA تسهيل التحليلات الإحصائية morphometric. DA نشاط الخلايا العصبية تعديل الناتج من مولد تنقل نمط المركزية اليرقات 14-16. DA الطبقات المختلفة والخلايا العصبية الحسية طرائق مختلفة ، وتفعيلها تثير استجابات سلوكية مختلفة 14،16-20. وعلاوة على فئات مختلفة ارسال التوقعات محواري نمطيا في النظام العصبي اليرقات ذبابة الفاكهة المركزي في الحبل البطني العصب (VNC) 21. إنهاء هذه التوقعات مع كل من تمثيل الطبوغرافية طريقة الخلايا العصبية الحسية وDA موقف في جدار الجسم من الحقل 7،22 شجيري، 23 عاما. ويمكن استخدام فحص بالتالي من الإسقاطات DA محواري لتوضيح الآليات الأساسية رسم الخرائط الطوبوغرافية 7،22،23 ، فضلا عن الأسلاك من الدوائر تنقل اليرقات تحوير بسيط 14-17. نقدم هنا دليلا عمليا لتوليد وتحليل الفسيفساء الجينية 24 وسم الخلايا العصبية عبر MARCM DA (تحليل الفسيفساء مع خلية Repressible ماركر) 1،10،25 وFLP التدريجي 22،26،27 تقنيات (ملخصة في الشكل 1).

Watch this Scientific Journal Video about Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics at JoVE.com

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

الخلايا العصبية الحسية تشجر شجيري من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات النظام العصبي الطرفي ونماذج مفيدة لتوضيح عامة والطبقة العصبية آليات محددة للتمايز الخلايا العصبية. نقدم دليلا عمليا لتوليد وتحليل الخلايا العصبية شجيري تشجر الفسيفساء الجينية.

تحليل الصرفي ذبابة الفاكهة اليرقات المحيطية الانشعابيات عصبون حسي والمحاوير استخدام الفسيفساء الوراثية

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

morphological-analysis-drosophila-larval-peripheral-sensory-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

15.2K Views.  RIKEN Brain Science Institute. الخلايا العصبية الحسية تشجر شجيري من ذبابة الفاكهة اليرقات النظام العصبي الطرفي ونماذج مفيدة لتوضيح عامة والطبقة العصبية آليات محددة للتمايز الخلايا العصبية. نقدم دليلا عمليا لتوليد وتحليل الخلايا العصبية شجيري تشجر الفسيفساء الجينية.

Video: Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

في التصور المجراة من الحويصلات متشابك ضمن محاور عصبية ذبابة الفاكهة القطاعي اليرقات

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

To understand how differences in complex cell shapes are achieved, it is important to accurately follow microtubule organization. The Drosophila larval body wall contains several cell types that are models to study cell and tissue morphogenesis. For example tracheae are used to examine tube morphogenesis1, and the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larva have become a primary system for the elucidation of general and neuron-class-specific mechanisms of dendritic differentiation2-5 and degeneration6.
The shape of dendrite branches can vary significantly between neuron classes, and even among different branches of a single neuron7,8. Genetic studies in DA neurons suggest that differential cytoskeletal organization can underlie morphological differences in dendritic branch shape4,9-11. We provide a robust immunological labeling method to assay in vivo microtubule organization in DA sensory neuron dendrite arbor (Figures 1, 2, Movie 1). This protocol illustrates the dissection and immunostaining of first instar larva, a stage when active sensory neuron dendrite outgrowth and branching organization is occurring 12,13.
In addition to staining sensory neurons, this method achieves robust labeling of microtubule organization in muscles (Movies 2, 3), trachea (Figure 3, Movie 3), and other body wall tissues. It is valuable for investigators wishing to analyze microtubule organization in situ in the body wall when investigating mechanisms that control tissue and cell shape.

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

To understand how complex cell shapes, such as neuronal dendrites, are achieved during development, it is important to be able to accurately assay microtubule organization. Here we describe a robust immunohistological labeling method to examine microtubule organization of dendritic arborization neuron sensory dendrites, trachea, muscle, and other Drosophila larva body wall tissues.

Immunohistological بطاقات المواد ميكروتثبول في الخلايا العصبية الحسية الانشعابيات ، القصبات الهوائية ، وعضلات في ذبابة الفاكهة الجدار اليرقة الهيئة

To understand how differences in complex cell shapes are achieved, it is important to accurately follow microtubule organization. The Drosophila larval ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

الجهد حساسة من تسجيل صبغ محاور عصبية، التشعبات والعمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الفردية في شرائح الدماغ

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

التحليل الوظيفي للتغذية اليرقات الدائرة في ذبابة الفاكهة</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

إنتاج وعزل محاور عصبية من الخلايا العصبية الحسية لتحليل الكيمياء الحيوية باستخدام مرشحات المسامية

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

إزالة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة العضلية من اليرقات شرائح التحليل المناعي من العصبونات الحسية وخلايا البشرة

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

عن طريق القنوات الخطي الاغاروز لدراسة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات الزحف السلوك

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

التحليل الأيضي اليرقات melanogaster المورفولوجية و "العقول الكبار"

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...