Die Autoren danken RIKEN für die Finanzierung. Wir danken auch Cagri Yalgin, Caroline Delandre und Jay Parrish für Diskussionen über genetische und Immunhistochemie-Protokollen.

1.Vorbereitung von Reagenzien <ol><li> Bereiten Ca + +-freien HL3.1 Kochsalzlösung 28. <ol><li> In mM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 Saccharose und 5 Trehalose; pH 7,2. Filter sterilisieren und lagern bei 4 ° C. Hinweis: Ca + +-freier Lösung verhindert Muskelkontraktion beim Präparieren. </li></ol></li><li> Machen Poly-L-Lysin (PLL) Deckgläser. <ol><li> Lösen 100mg PLL in 4.2ml Wasser und machen 300μl Aliquots in Eppendorf-Röhrchen und bei -20 ° C. </li><li> Vor der Beschichtung Deckgläser zunächst Tauwetter ein Aliquot, bringen Sie es bis zu 10ml in ddH 2 O, und fügen Sie 20 &amp;mgr; l von Kodak Photo-Flo; die endgültige PLL-Konzentration liegt bei 0,7 mg / ml. </li><li> Tauchen Deckgläser für 30 Minuten in PLL-Lösung, zu entfernen und trocken, dann kurz mit Wasser abspülen und trocknen. Zweimal wiederholen. Behandelte Deckgläser dauern ca. 1 Monat. </li></ol></li></ol> 2. Genetische Kreuzungen <ol><li> To generieren MARCM Klone. Hier ist ein Beispiel Kreuz mit einem pan-DA Fahrer 11,27: FRT2A x hsFLP; Gal4 109 (2) 80, UAS-mCD8:: GFP; Wanne-GAL80 FRT2A/SM5-TM6B </li><li> Zur Erzeugung von Flp-out-Klone. Hier ist ein Beispiel Kreuz mit einem Klasse IV-spezifische Treiber 8: ppk-Gal4 x yw, hsFLP; UAS-FRT-CD2, y +-stop-FRT-mCD8:: GFP </li></ol> 3. Sammlung von Embryonen <ol><li> Keep Drosophila Kreuze in einer Sammlung Flasche bei 25 ° C und sammeln Embryonen auf einem Apfelsaft-Agar Platte 29 verteilt mit einer dünnen Schicht von Hefepaste 30,31. </li></ol> 4. Hitze-Schock-Behandlung von Embryonen <ol><li> Stellen Sie eine leere Platte im Gegensatz zum Apfelsaft-Agar-Platte, auf der die Embryonen gelegt worden. Seal um diese beiden Platten mit Parafilm (Abb. 2). </li><li> Während Hitzeschockprotein, tauchen the Platte in das Wasserbad und halten Sie ihn mit dem Metall Gewicht. </li><li> Für MARCM Embryonen <ol><li> Sammeln Embryonen für 2h und inkubieren in einer 10cm Petrischale umgeben von feuchten Gewebe bei 25 ° C für eine zusätzliche 2h. Hinweis: Einstellung des Hitzeschock-Protokoll verändert die Frequenz, bei der Klone generiert werden. </li><li> Für eine kleinere Anzahl von Klonen, mit dem Ziel für einzelne isolierte Nervenzellen, tauchen und Hitzeschock im Wasserbad für 1 Stunde bei 38 ° C. </li><li> Für eine größere Anzahl von Klonen Hitzeschock für 45 Minuten bei 38 ° C, bei RT 30 Minuten, dann Hitzeschock wieder erholen für einen zusätzlichen 30 Minuten. </li></ol></li><li> Sammeln Flp-out Embryonen für 24 Stunden und Hitzeschock für 1h bei 38 ° C. </li></ol> 5. Screening nach Klonen <ol><li> Nach Hitzeschock, entfernen Sie den Deckel des Wasser-dichte Anordnung und Ort der Apfelsaft-Agar-Platte in eine 10 cm Petrischale mit angefeuchteten Gewebe umgeben. Kultur der Embryonen und Larven anschließende bei 25 ° C bis zu wandernIng. 3 rd instar. Hinweis: Kulturbedingungen, insbesondere Ernährung, haben gezeigt, dass DA dendritischen Dorn Morphologie 32,33 zu ändern. Stellen Sie sicher, dass wachsenden Larven Zugang zu Hefepaste zu allen Zeiten; überwachen und füllt die Hefepaste wie erforderlich. </li><li> Von diesem Zeitpunkt an das Protokoll ab, manipulieren Larven vorsichtig mit einer Pinzette Insekten. </li><li> Kurz und sanft spülen die Larven in Leitungswasser, und platzieren Sie dann auf eine Agarplatte. Hinweis: Dieser Schritt reduziert Hintergrundgeräusche Autofluoreszenz aus der Nahrung oder Schmutz auf der Oberfläche Larven. </li><li> Untersuchen Sie die Larven unter einem starken Fluoreszenz Präpariermikroskop. Identifizieren Larven mit GFP-positive Neurone / Zellen im Körper Wand. </li></ol> 6. In-vivo-Bildgebung von Dendriten <ol><li> Legen Sie die Larve in eine Depression Objektträger mit einem kleinen Tropfen von 80% Glycerin. Legen Sie ein Deckglas auf dem Objektträger um die Larve zu immobilisieren. Stellen Sie sicher, dass keine Luft zwischen der Larve und die coversli bleibtSeite </li><li> Schieben Sie das Deckglas auf die Larve Rolle der Visualisierung des Neurons von Interesse erlauben. Bild der mCD8:: GFP-markierten dendritischen Dorn über die konfokale Mikroskopie. </li></ol> 7. Larven Dissektion Beachten Sie vor Beginn: DA Neuron Dendriten verschlechtern sich rasch nach Beginn der Dissektion. Dissect jede einzelne Larve in weniger als 5min zum guten Dendriten Morphologie gewährleisten. <ol><li> Dissect wandernde 3 rd Larvenstadium auf einem Sylgard Platte wie zuvor 34 mit den folgenden Modifikationen: <ol><li> Für die Darstellung von DA Neuron Axon-Termini, sicherzustellen, dass das ZNS intakt ist und der segmentalen Nerven sind nicht kaputt. Nach dem Öffnen der Larven, zunächst vorsichtig schneiden die Tracheal-Verbindungen, um den Körper Wand und dann vorsichtig die gesamte Darm. </li><li> Wenn die Abbildung der Dendriten allein, entfernen Sie das ZNS zu erlauben eine flachere Montage. </li></ol></li></ol> 8. Fixation und Sperrung von Larven Filets <ol><li> Mit der Larve noch auf die Platte Sylgard merken, fix it in 4% PFA in PBS für 20 Minuten bei RT auf einem sanft rotierenden Schüttler. </li><li> Entfernen Spuren von Larven Gewebe (fat Körper, Luftröhre, etc.) nach der Fixierung. </li><li> Wash in PBST (PBS mit 0,1% Triton X-100) 3x 10 Minuten auf dem Sylgard Platte und Shaker. Wenn die Prüfung Axon-Termini, halten Sie das Filet auf dem Teller Sylgard. (Wenn Färbung Dendriten ist es möglich, die Larven Filets auf einem 0,5 ml Röhrchen füllen bei diesem Schritt 34) </li><li> Blockieren Sie die Larven für 20 Minuten bei RT in 5% normalem Esel-Serum (NDS) in PBST auf einem Schüttler. </li></ol> 9. Die Färbung der Larven Filets <ol><li> Blocking-Lösung und Inkubation in Primärantikörper (in 5% NDS / PBST) über Nacht bei 4 ° C in einer kleinen Tupperdose, umgeben von feuchten Gewebe. </li><li> Entfernen Sie die Rohre von 4 ° C inkubieren eine weitere Stunde bei RT. </li><li> Wash 6x 10 Minuten in PBST. Fügen Sie den sekundären antibOdy (in 5% NDS / PBST) und Abdeckung, um zu verhindern Fluorophor Photobleaching 34. </li><li> Inkubieren entweder bei RT für 2 Stunden oder über Nacht bei 4 ° C eine Stunde bei RT folgten. </li><li> Waschen Sie die Larven 6x 10 Minuten in PBST und fahren Sie mit Montage. </li></ol> 10. Montage der Larven Filets für die Prüfung der Dendriten Laube <ol><li> Montieren Sie je Larven Filet so flach wie möglich mit Sezieren einer Schere oder einem Skalpell den Kopf abzuschlagen (einschließlich der Mund Haken) und der hintere (einschließlich der Luftlöcher) 34. </li><li> Setzen Sie den Larven Filet auf der Folie Nagelhaut-Seite nach unten, in 80% Glycerin montieren und Dichtung den Seiten des Deckglases mit Nagellack für einen &quot;schnellen&quot; Halterung 34. </li><li> Für eine dauerhafte Befestigung und ein klareres Bild <ol><li> Setzen Sie den sezierten Larven Filet Muskel-Seite nach unten auf einen Tropfen PBS auf eine PLL Deckglas, wird es schnell zu dem Deckglas haften. </li><li> Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich nach der Montage, however nicht lassen Sie es vollständig trocknen. </li><li> Nehmen Sie das Deckglas (mit angeschlossenem Larven Filet) durch eine Ethanol-Serie: 35% Ethanol, 50%, 70%, 95%, und schließlich 2x 100% Ethanol für jeweils 10 Minuten (2. 100% EtOH Lösung häufig geändert werden soll, gefolgt ), und schließlich, waschen 2-3x 10 Minuten in Xylol. </li><li> Gib einen Tropfen des DPX Deckfluessigkeit (Distyrene Weichmacher Xylol) auf einen sauberen Objektträger und legen Sie es vorsichtig Deckglas Filet-side-down an der Spitze. Halten Sie in der Dunkelheit, und warten Sie einen Tag für die DPX vor Bildgebung gesetzt. </li></ol></li></ol> 11. Montage der Larven Filets für die Prüfung der Axon-Termini <ol><li> Halten Sie die segmentalen Nerven, die zwischen den PNS und ZNS intakt während der Präparation, Fixierung und Färbung, damit die Verfolgung der Axone von peripheren sensorischen Neuronen Zellkörper zu den VNC. </li><li> Montieren Sie je Larven Filet Nagelhaut-Seite nach unten in 80% Glycerin in eine Depression gleiten. Verfolgen Sie die Axone aus der DA Zellkörper zu denVNC unter dem konfokalen Mikroskop. Hinweis: PNS Neuronen in jeder Körperzelle Wandsegment Projekt auf die verwandten Segment des VNC. </li></ol> 12. Repräsentative Ergebnisse: Repräsentative Ergebnisse sind in den Abbildungen 3-5 dargestellt. Abb.. 3 zeigt die ganze Laube einer Klasse IV da Neuron, in vivo unter dem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Abb.. 4 zeigt eine Nahaufnahme eines Teils des Dendriten Laube eines immunhistochemisch markierten Klasse III Neuron, das richtig ist fest mit der Morphologie erhalten. Die zugehörigen Einschub zeigt die Erniedrigung, die nach einem erfolglosen Dissektion und Fixierung (beide gefärbt mit anti-GFP-Antikörper) auftreten können. Abb.. 5 zeigt eine einzelne Klasse IV Axon-Terminus in das ZNS (anti-GFP, grün), alle Klasse IV Termini sind mit anti-CD2 (magenta) co-gefärbt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig1.jpg" /> Abbildung 1 Protocol Überblick. a) Sammeln und dann Hitzeschock-Embryonen. b)<html> Wählen Sie eine Larve mit einem GFP-positive DA Neuron zu klonen, und dann Bild der GFP-markierten Dendriten Laube in der Live-Larve. c) Präparieren Sie die Larve, und dann immunhistochemisch färben das Filet. d) Montieren Sie die Kirchenfenster Filet, und dann Bild der dendritischen Dorn und axonalen Projektionen der DA Neuron Klone. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig2.jpg" /> Abbildung 2: Herstellung von Apfelsaft-Agar-Platte für Hitzeschock. Nehmen Sie die Platte (weißer Pfeil, ab), fügen Sie eine zweite Petrischale auf (roter Pfeil b) und Dichtung um mit Parafilm (blauer Pfeil, b). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig3.jpg" /> Abbildung 3 in vivo Bild des Dendriten Laube eines mCD8:: GFP-markierten MARCM clone (Genotyp in 2,1), die eine Klasse IV (v&#39;ada) Neuron einer 3 rd instar Larve. Scale-Bar ist 50 um. d/3111/3111fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4 mCD8:: GFP-markierten MARCM Klon eines Klasse-III-Neuron (ddaa) mit anti-GFP Antikörper gefärbt und zeigt gute Morphologie nach einer erfolgreichen Präparation und Befestigung (grün). Der Einschub zeigt Dendriten Abbau (weiße Pfeile), die nach erfolglosen Dissektion und Fixierung (magenta). Scale-Bar ist 25 um. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig5.jpg" /> Abbildung 5 Die 3. Larvenstadium Larven VNC. Eine Flp-out-Klon aus einer einzigen Klasse VI (VDAB) Axon-Terminus (Genotyp in 2,2) wird unter Verwendung anti-GFP-Antikörper (grün). Anti-CD2 Etiketten aller Klasse IV Termini (magenta). Scale-Bar ist 25 um.

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H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons.">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li><li>Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+the+Drosophila+neuropile:+a+strategy+for+the+standardised+characterisation+of+genetically+amenable+neurites.">Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites.</a> Dev Biol. 260, 207-225 (2003).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Drosophila Larve DA Neuronenmodell liefert eine hervorragende genetische System von Mechanismen zu untersuchen, dass die Kontrolle Neuron Morphologie und Schaltung Bildung. MARCM ist in der Regel für die Kennzeichnung und zur Erzeugung von Mutanten DA Neuron Klone verwendet. Für MARCM wir verwenden entweder eine pan-neuronalen (zB Gal4 C155) oder DA Neuronen-spezifische Treiber. Mit einem pan-neuronaler Fahrer ist es möglich, direkt zu verwenden mehrere Bestände weit aus öff...

<table border="1"><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> SZX16 Fluoreszenz Dissektionsmikroskop (mit GFPHQ Filter) </td><td> Olymp </td><td> SZX16 </td><td></td></tr><tr><td> Live-Insect Zange </td><td> FST </td><td> 26030-10 </td><td></td></tr><tr><td> 26mm x 76mm Depression Objektträger </td><td> Toshinriko Co. </td><td> T8-R004 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 (oder Silpot 184) </td><td> Dow Corning </td><td> 3097358-1004 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin </td><td> Sigma </td><td> P-1524 </td><td> Dieses Produkt hat sich als am effektivsten </td></tr><tr><td> DPX Eindeckmedium </td><td> Sigma </td><td> 44581 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-GFP </td><td> Invitrogen </td><td> A-11122 </td><td> Verdünnung 1:500 </td></tr><tr><td> Rat anti-CD8 </td><td> Caltag </td><td> 5h10 </td><td> Verdünnung 1:200 </td></tr><tr><td> Maus anti-CD2 </td><td> AbD serotec </td><td> MCA443R </td><td> Verdünnung 1:700 </td></tr><tr><td> Maus anti-Fasciclin2 </td><td> DSHB </td><td> 1D4 </td><td> Verdünnung 1:10 </td></tr></table>

morphological analysis of drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics

Entwicklung des Nervensystems erfordert die korrekte Spezifikation der Neuron Position und Identität, durch genaue Neuron-Klasse-spezifische dendritische Entwicklung und axonalen Verdrahtung gefolgt. Vor kurzem hat die dendritische Verzweigung (DA) sensorischen Neuronen der Drosophila Larve peripheren Nervensystem (PNS) haben sich leistungsfähige genetische Modelle, in denen sowohl allgemeine und Klassen-spezifische Mechanismen der neuronalen Differenzierung aufzuklären. Es gibt vier Haupt-DA Neuron Klassen (I-IV) 1. Sie sind in der Reihenfolge zunehmender Dendriten Laube Komplexität, benannt und haben klassenspezifische Unterschiede in der genetischen Kontrolle ihrer Differenzierung 2-10. Die DA sensorischen Systems ist ein praktisches Modell, um die molekularen Mechanismen hinter der Kontrolle von dendritischen Morphologie 11-13 zu untersuchen, weil: 1) es Vorteile der leistungsstarken genetischen Werkzeuge in der Fruchtfliege, 2) nehmen die DA Neuron Dendriten Laube breitet sich aus in nur 2 Dimensionen unter einem optisch clear Larvencuticula macht es einfach, mit hoher Auflösung in vivo, 3 Visualisierung) der Klasse-spezifische Vielfalt in dendritische Morphologie erleichtert eine vergleichende Analyse zu den wichtigsten Elementen der Kontrolle der Bildung von einfachen vs stark verzweigte dendritische Bäume zu finden, und 4) dendritischen Dorn stereotypen Formen der verschiedenen DA Neuronen zu erleichtern morphometrische statistischen Analysen. DA Neuronen-Aktivität modifiziert die Ausgabe eines larvalen Fortbewegung central pattern generator 14-16. Die verschiedenen DA Neuron Klassen haben verschiedene sensorische Modalitäten und deren Aktivierung auslöst verschiedenen Verhaltensreaktionen 14,16-20. Außerdem verschiedene Klassen schicken axonalen Projektionen stereotyp in die Drosophila Larve des zentralen Nervensystems in der Bauchmark (VNC) 21. Diese Projektionen enden mit topographischen Darstellungen beider DA Neuron Sinnesmodalität und die Position in der Körperwand der dendritischen Bereich 7,22, 23. Daher Untersuchung von DA axonalen Projektionen können verwendet werden, um Mechanismen, die topographische Kartierung 7,22,23, sowie die Verkabelung einer einfachen Schaltung modulierenden Larven Fortbewegung 14-17 aufzuklären. Wir stellen Ihnen hier eine praktische Anleitung zur Generierung und Analyse genetischer Mosaike 24 Kennzeichnung DA Neuronen über MARCM (Mosaic Analyse mit einem reprimierbaren Zell Marker) 1,10,25 und Flp-out 22,26,27 Techniken (zusammengefasst in Abb. 1)..

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Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Die dendritischen Verzweigung sensorischen Neuronen des<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven des peripheren Nervensystems sind nützliche Modelle, um sowohl allgemeine als auch Neuron-Klasse-spezifische Mechanismen der neuronalen Differenzierung aufzuklären. Wir präsentieren eine praktische Anleitung zur Generierung und Analyse dendritischer Verzweigung Neuron genetischen Mosaiken.

Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

morphological-analysis-drosophila-larval-peripheral-sensory-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

15.2K Aufrufe.  RIKEN Brain Science Institute. Die dendritischen Verzweigung sensorischen Neuronen des Drosophila Larven des peripheren Nervensystems sind nützliche Modelle, um sowohl allgemeine als auch Neuron-Klasse-spezifische Mechanismen der neuronalen Differenzierung aufzuklären. Wir präsentieren eine praktische Anleitung zur Generierung und Analyse dendritischer Verzweigung Neuron genetischen Mosaiken.

Serie: Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological studies to depict intricate morphologies and to manipulate the function of genes in subsets of neurons within otherwise unmarked and unperturbed organisms. Genetic mosaics generated in the MARCM system are mediated through site-specific recombination between homologous chromosomes within dividing precursor cells to produce both marked (MARCM clones) and unmarked daughter cells during mitosis. An extension of the MARCM method, called twin-spot MARCM (tsMARCM), labels both of the twin cells derived from a common progenitor with two distinct colors. This technique was developed to enable the retrieval of useful information from both hemi-lineages. By comprehensively analyzing different pairs of tsMARCM clones, the tsMARCM system permits high-resolution neural lineage mapping to reveal the exact birth-order of the labeled neurons produced from common progenitor cells. Furthermore, the tsMARCM system also extends gene function studies by permitting the phenotypic analysis of identical neurons of different animals. Here, we describe how to apply the tsMARCM system to facilitate studies of neural development in Drosophila.

Here, we present a protocol for a mosaic labeling technique that permits the visualization of neurons derived from a common progenitor cell in two distinct colors. This facilitates neural lineage analysis with the capability of birth-dating individual neurons and studying gene function in the same neurons of different individuals.

Zell Lineage Analysen und Genfunktion Studien mit Twin-Spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Entwicklungsbiologie

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

To understand how differences in complex cell shapes are achieved, it is important to accurately follow microtubule organization. The Drosophila larval body wall contains several cell types that are models to study cell and tissue morphogenesis. For example tracheae are used to examine tube morphogenesis1, and the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larva have become a primary system for the elucidation of general and neuron-class-specific mechanisms of dendritic differentiation2-5 and degeneration6.
The shape of dendrite branches can vary significantly between neuron classes, and even among different branches of a single neuron7,8. Genetic studies in DA neurons suggest that differential cytoskeletal organization can underlie morphological differences in dendritic branch shape4,9-11. We provide a robust immunological labeling method to assay in vivo microtubule organization in DA sensory neuron dendrite arbor (Figures 1, 2, Movie 1). This protocol illustrates the dissection and immunostaining of first instar larva, a stage when active sensory neuron dendrite outgrowth and branching organization is occurring 12,13.
In addition to staining sensory neurons, this method achieves robust labeling of microtubule organization in muscles (Movies 2, 3), trachea (Figure 3, Movie 3), and other body wall tissues. It is valuable for investigators wishing to analyze microtubule organization in situ in the body wall when investigating mechanisms that control tissue and cell shape.

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

To understand how complex cell shapes, such as neuronal dendrites, are achieved during development, it is important to be able to accurately assay microtubule organization. Here we describe a robust immunohistological labeling method to examine microtubule organization of dendritic arborization neuron sensory dendrites, trachea, muscle, and other Drosophila larva body wall tissues.

Immunhistologische Markierung von Mikrotubuli in Sensory Neuron Dendriten, Tracheen und Muskeln in der Drosophila Larva Körperwand

To understand how differences in complex cell shapes are achieved, it is important to accurately follow microtubule organization. The Drosophila larval ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

Drosophila Bein Motoneuronen Axone durch die Erwachsenen Nagelhaut zu visualisieren

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Entfernung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Muskelgewebe aus Larval Filets für Immunfluoreszenzanalyse von sensorischen Neuronen und epidermalen Zellen

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskuläre Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Quantitative Analyse der neuronalen dendritischen Arborization Komplexität in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Zusammenfassung

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