Name: removal of drosophila muscle tissue from larval fillets for immunofluorescence analysis of sensory neurons and epidermal cells
Uploaded: 2016-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells at JoVE.com

نشكر غاري Laevsky لإجراء مناقشات مفيدة حول المجهري. بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة هذا العمل يمنح R01GM061107 وR01GM067758 إلى أرج

ملاحظة: الإجراء لإزالة العضلات (الشكل 1) هو تعديل من الأساليب المذكورة سابقا لإعداد شرائح اليرقات. وترد الخطوات التي تسبق واتبع إزالة العضلات لفترة وجيزة ويشار إلى القارئ إلى الأعمال السابقة 10 و 11 لوصف أكثر تفصيلا. 1. تشريح اليرقة في المياه المالحة الباردة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تخفيف العمل الباردة HL3.1 المالحة 15 أو الكالسيوم البارد 2+ خالية HL3.1 المالحة 11 (الجدول 1). مكان اليرقة في طبق المطاط الصناعي السيليكون مع ما يكفي المالحة الباردة لتغطية الجزء السفلي من الطبق. ملاحظة: انظر مناقشة فيما يتعلق باختيار من المياه المالحة. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1X المالحة HL3.1 (درجة الحموضة 7.2) </td></tr><tr><td> 5 ملي HEPES </td></tr><tr><td> 70 ملي كلوريد الصوديوم </td></tr><tr&gt; <td> 5 ملي بوكل </td></tr><tr><td> 1.5 ملي CaCl 2 (حذف ل Ca 2+ المالحة خالية) </td></tr><tr><td> 4 ملي MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 ملم NaHCO 3 </td></tr><tr><td> 5 ملي طرهالوز </td></tr><tr><td> 115 ملي السكروز </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> تعقيم تصفية وتخزينها في 4 درجات مئوية </td></tr><tr><td> يقلد تكوين الحشرة الدملمف: مذكرة </td></tr></tbody></table> الجدول 1. تكوين الباردة المالحة. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اليرقة مع الجانب حتى بطني. السطح البطني لليرقة يمكن تحديدها عن طريق الأحزمة dentical البطن والجانب الظهري من أنابيب القصبة الهوائية اليرقات الأولية يمتد من الأمامي إلى الخلفي. تمتد اليرقة في الاتجاه الأمامي الخلفي ويعلقون الرأس والذيل لسيليكون المطاط الصناعي طبق تشريح باستخدام دبابيس الحشرات. استخدام مقص تشريح غرامة لقطع على طول خط الوسط بطني، ابتداء من نهاية واحدة وتتقدم في اتجاه آخر. ملاحظة: هذا التوجه يحفظ الكتلة الظهرية درس عادة من دا الخلايا العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد قطع اليرقة مفتوحة، دبوس الأركان الأربعة للطبق تشريح كما لو فتح الكتاب. استخدام ملقط لانتزاع وإزالة الأعضاء الداخلية بما فيها الجهاز العصبي المركزي، القناة الهضمية، والقصبة الهوائية. ضبط دبابيس الحشرات بحيث فيليه هو مشدود ولكن لا تمتد الى اقصى حد ممكن. وترسو العضلات لجدار الجسم في حدود القطاعية: ملاحظة. على الرغم من أن عضلات تغطي معظم جدار الجسم، فهي غائبة في منطقة ضيقة بالقرب من خط الوسط الظهرية. </li></ol> إزالة 2. العضلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد خط الوسط الظهري لليرقة، حيث الأنسجة العضلية هي غائبة. وضع ملقط الشق واحد بحيث يمكن إدراجها تحت الأنسجة العضلية في تسطحا التوجه ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبدأ منخط الوسط الظهرية، بالقرب من الحدود الأمامي من الجزء، الشريحة بعناية الشق ملقط بين العضلات والبشرة، مع الحرص على تقليل الاتصال بين ملقط والبشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب ملقط صعودا لكسر الحجز على العضلات لجدار الجسم في مرساة نقطة واحدة. كرر هذه العملية لباقي نصفي جزء (ق) من الفائدة. ملاحظة: هذا البروتوكول يحسن الحفاظ على الخلفي من كل حقل التغصنات دا الخلايا العصبية. للحفاظ على الجزء الأمامي من الملعب في التغصنات، فمن الأفضل لإدراج الشق ملقط في نهاية الخلفي من كل قطعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة ضبط دبابيس الحشرات مثل أن شرائح اليرقات ويمتد الحد الأقصى في جميع الاتجاهات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح فيليه في حين انها لا تزال معلقة على طبق تشريح باستخدام الباردة، طازجة الفورمالديهايد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 25 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف 5 مرات في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الملقط لسحب بعناية بعيدا الأنسجة العضلية من نقاط الربط المتبقية، مع الحرص على تقليل حساب المشتركط م مع البشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بفصل وإزالة شرائح من الطبق تشريح لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل. أداء جميع الغسيل، حظر، والخطوات المناعي تلطيخ لاحقة، كما هو موضح سابقا (11). </li></ol> 3. جبل اليرقات فيليه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا إزالة الرأس والذيل باستخدام مقص تشريح غرامة من أجل جعل عينة شقة ممكن. تركيب شرائح على ساترة في antifade مرس مع السطح الداخلي للشرائح التي تواجه ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع شريحة المجهر على ساترة واضغط برفق لتفريق المتوسطة المتزايدة. الوجه شريحة المجهر مرارا وختم ساترة على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر. ويمكن تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل. </li></ol>

<ol>
	<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+Drosophila+sensory+neurons.">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+Drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space.">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li><li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+Drosophila+sensory+neurons.">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li><li>Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+regulates+a+developmental+transition+in+epithelial+cells+that+restricts+sensory+dendrite+growth.">The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth.</a> Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).</li><li>Meltzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermis-derived+Semaphorin+promotes+dendrite+self-avoidance+by+regulating+dendrite-substrate+adhesion+in+Drosophila+sensory+neurons.">Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila.">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics.">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. (57), e3111 (2011).</li><li>Gustafsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+flow+quantified+beyond+the+diffraction+limit+by+spatiotemporal+image+correlation+of+structured+illumination+microscopy+data.">Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data.</a> Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).</li><li>Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+response+mediated+by+the+TRP+channels+NOMPC,+NANCHUNG,+and+INACTIVE+in+chordotonal+organs+of+Drosophila+larvae.">Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae.</a> PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هنا يوصف بروتوكول للالإزالة اليدوية من الأنسجة العضلية من ذبابة الفاكهة شرائح اليرقات. هذا البروتوكول يعدل الموصوفة سابقا تقنيات تشريح اليرقات 10،11. بعد تشريح اليرقة في طبق المطاط الصناعي السيليكون، يقع خط الوسط الظهرية. وملقط الشق واحد، في تسطحا توجهها ا...

توفر ذبابة الفاكهة اليرقات تشجر شجيري (دا) الخلايا العصبية نموذجا قيما لدراسة تطوير الخلايا العصبية بسبب قابليته لالتلاعب الجيني والسهولة التي يمكن تصويرها. وكانت هذه الخلايا العصبية الحسية دور فعال في تحديد العديد من مسارات التي تتحكم في التغصنات التشكل 1-3. أربع فئات من دا الخلايا العصبية (الصف الأول - الرابع) يعصب البشرة اليرقات. هذه الخلايا العصبية تقع بين الغشاء القاعدي والبشرة، مع التشعبات الذين يشكلون صفائف إلى حد كبير ثنائية الأبعاد 4،5. من الفئات الأربع، والطبقة الرابعة دا الخلايا العصبية لديها العرش الأكثر تشعبت للغاية، ومثل الخلايا العصبية الحسية من الحيوانات الأخرى، ووضع هذه العرش يتطلب العوامل الجوهرية وكذلك العظة من الأنسجة المجاورة، وخاصة البشرة، لتنميتها 6-9 . دراسات لتحديد كيف يمكن لهذه الخلايا العصبية والواقع خارج الخلايا العصبيةالأملاح السيطرة صالح التشكل تغصناته من القدرة على الكشف عن بروتين تعبير في الموقع المناعي. بشرة الخارجية لليرقة هو منيع لالأجسام المضادة، ولكن التغلب على هذا العائق بسهولة عن طريق إعداد شرائح اليرقات من خلال وسائل تشريح راسخة 10،11. ومع ذلك، فإن الأنسجة العضلية جدار الجسم التي تقع على بعد الداخلية إلى الغشاء القاعدي تقدم العديد من التحديات نحو التصور من الخلايا العصبية دا وخلايا البشرة. أولا، الأنسجة العضلية، والتي خطوط معظم من جدار الجسم، يحجب كثيرا إشارات الفلورية المنبعثة من الأنسجة العصبية أو البشرة. هذا يقلل بشكل كبير من إشارة إلى نسبة الضوضاء في العينة. ثانيا، يمكن التعبير عن العديد من البروتينات ذات الصلة في الأنسجة العضلية وكذلك في الخلايا العصبية أو البشرة. ومن المرجح أن مزيدا من الكشف غامضة إشارة مضان من الخلايا العصبية أو البشرة هذه الإشارة مضان مأخوذة من العضلات. وأخيرا، فإن التقدم في تقنيات المجهر لاث التصوير تصريح العينات في قرار دون حيود وقد تكون مفيدة خاصة في تمييز توطين البروتينات التي يتم التعبير عنها في الخلايا العصبية والخلايا المحيطة البشرة 12،13. ومع ذلك، والتصوير عبر فوائد المجهر فائقة الدقة من إشارة قوية إلى نسبة الضوضاء وبالقرب من العينة إلى ساترة. بالإضافة إلى الحد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء، واليرقات جدار الجسم مسافات العضلات دا الخلايا العصبية من ساترة، مما يحد من دقة وضوح الصورة المحسنة التي يمكن تحقيقها مع أساليب الفحص المجهري فائقة الدقة. وبالاضافة الى التحديات التي تواجه التحليل المناعي، تقدم الأنسجة العضلية عائقا أمام تسجيل الكهربية من الخلايا العصبية الحسية في جدار الجسم اليرقات. وبالتالي زواله يفيد التلاعب العصبي الخلايا العصبية الحسية 14. هنا يتم وصف طريقة لإزالة يدوية من ذبابة الفاكهة الأنسجة العضلية اليرقات. علينا أن نبرهن أن لدينا بروتوكول صermits التصوير المناعي من البروتينات التي يتم حجب خلاف ذلك أنسجة العضلات، ويحسن إشارة إلى نسبة الضوضاء لرؤية الدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية، ويمكن استخدام فائقة قرار المجهري للتمييز أفضل العلاقات المكانية للبروتينات والهياكل الخلوية في دا الخلايا العصبية و البشرة.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-D</td><td></td></tr><tr><td>Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>for dissecting plates</td></tr><tr><td>Austerlitz insect pins, 0.1 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Fostec 8375 light source</td><td>Artisan Technology Group</td><td>62792-4</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade mounting medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Prolong Diamond antifade mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36970</td><td>for structured illumination microscopy</td></tr><tr><td>Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Coracle antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>C615.16</td><td>supernatant, dilute 1:50</td></tr><tr><td>Mouse anti-Discs large antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3</td><td>supernatant, dilute 1:50</td></tr><tr><td>Rabbit anti-dsRed antibody</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>dilute 1:1,000</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>dilute 1:1,000</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>dilute 1:500</td></tr></tbody></table>

removal of drosophila muscle tissue from larval fillets for immunofluorescence analysis of sensory neurons and epidermal cells

ذبابة الفاكهة اليرقات تشجر شجيري (دا) الخلايا العصبية هي نموذج شعبية للتحقيق في آليات التشكل الخلايا العصبية. دا الخلايا العصبية تتطور في اتصال مع خلايا البشرة التي يعصب وبالتالي فوائد تحليلهم من التصور في مواقعها الطبيعية في كل من البروتينات وأعرب neuronally وepidermally المناعي. الطرق التقليدية في تحضير شرائح اليرقات لتجارب المناعي على حالها الأنسجة العضلية التي تغطي أكثر من جدار الجسم، وتقديم العديد من التحديات لتصوير الخلايا العصبية والبشرة البروتينات. نحن هنا تصف طريقة لإزالة الأنسجة العضلية من ذبابة الفاكهة شرائح اليرقات. يتيح هذا البروتوكول التصوير من البروتينات التي يتم حجب خلاف ذلك أنسجة العضلات، ويحسن إشارة إلى نسبة الضوضاء، ويسهل استخدام فائقة الدقة المجهر لدراسة دا تنمية الخلايا العصبية.

ونحن لشرح فائدة هذا الإجراء إزالة العضلات لتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء في التجارب المناعي للمشاركة في تصور البروتينات محوجزة تقاطع Coracle (كورا) وقرص واسع (أجهزة ...) جنبا إلى جنب مع الصنف الرابع دا الخلايا العصبية المسماة مع علامة غشاء CD4- tdTomato. <p class="jove_content" fo:keep-together.w...

Watch this Scientific Journal Video about Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells at JoVE.com

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

تفيد الدراسات التشكل الخلايا العصبية باستخدام ذبابة الفاكهة تشجر شجيري اليرقات (دا) الخلايا العصبية من في التصور الموقع من البروتينات العصبية والبشرة المناعي. نحن تصف الإجراء الذي يحسن التحليل المناعي دا الخلايا العصبية والخلايا المحيطة البشرة عن طريق إزالة الأنسجة العضلية من جدار الجسم اليرقات.

إزالة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة العضلية من اليرقات شرائح التحليل المناعي من العصبونات الحسية وخلايا البشرة

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

removal-drosophila-muscle-tissue-from-larval-fillets-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

8.9K Views.  Princeton University.  تفيد الدراسات التشكل الخلايا العصبية باستخدام ذبابة الفاكهة تشجر شجيري اليرقات (دا) الخلايا العصبية من في التصور الموقع من البروتينات العصبية والبشرة المناعي. نحن تصف الإجراء الذي يحسن التحليل المناعي دا الخلايا العصبية وا...

Video: Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

تحليل الصرفي ذبابة الفاكهة اليرقات المحيطية الانشعابيات عصبون حسي والمحاوير استخدام الفسيفساء الوراثية

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

تشريح العضلات الطائرة الصباغية لنهج الomics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genetics

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

ذبابة الفاكهة تشريح اليرقات NMJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Biology

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ المناعية

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

تشريح والكيمياء المناعية من الساق الكبار Drosophila للكشف عن التغيرات في تقاطع العصبية والعضلية لخلية عصبية محركية محددة

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

عرض شبكات الأنابيب الدقيقة في تقاطعات ذبابة الفاكهة العصبية العضلية وخلايا العضلات

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

تسليط الضوء على المؤلف: فهم شبكة الأنابيب الدقيقة في تقاطعات ذبابة الفاكهة العصبية العضلية 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

إزالة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي

تحليل الصرفي ذبابة الفاكهة اليرقات المحيطية الانشعابيات عصبون حسي والمحاوير استخدام الفسيفساء الوراثية

تشريح العضلات الطائرة الصباغية لنهج الomics

ذبابة الفاكهة تشريح اليرقات NMJ

ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ المناعية

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة

تشريح والكيمياء المناعية من الساق الكبار Drosophila للكشف عن التغيرات في تقاطع العصبية والعضلية لخلية عصبية محركية محددة

استخدام ذبابة الفاكهة اليرقات العصبية العضلية والخلايا العضلية لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة

استخدام ذبابة الفاكهة اليرقات العصبية العضلية والخلايا العضلية لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة

استخدام ذبابة الفاكهة اليرقات العصبية العضلية والخلايا العضلية لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة