המחברים מודים RIKEN למימון. אנו מודים גם Cagri Yalgin, קרוליין Delandre, וג&#39;יי פריש לדיונים על פרוטוקולים גנטיים אימונוהיסטוכימיה.

1.Preparation של ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Ca + + ללא HL3.1 מלוחים 28. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במ&quot;מ: 70 NaCl, KCl 5, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 סוכרוז, ו 5 trehalose; pH 7.2. סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C. הערה: Ca + + ללא פתרון המונע התכווצות שרירים במהלך לנתיחה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פולי-L-ליזין (PLL) coverslips. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 100 מ&quot;ג PLL במים 4.2ml ולעשות aliquots 300μl צינורות Eppendorf ולהקפיא ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני coverslips ציפוי, להפשיר הראשונה בה aliquot, ולהביא אותו עד 10 מ&quot;ל ב DDH 2 O ולהוסיף 20μl של Kodak Photo-פלו; ריכוז PLL הסופית היא 0.7 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips לצלול עבור 30mins בפתרון PLL, להסיר ויבש, ולאחר מכן לשטוף עם מים לזמן קצר ויבש. חזור פעמיים. המטופלים coverslips האחרון כחודש. </li></ol></li></ol> 2. חוצה גנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> To ליצור שיבוטים MARCM. הנה דוגמה לחצות באמצעות הנהג הפאן התובע 11,27: FRT2A x hsFLP; Gal4 109 (2) 80, כטב&quot;מ-mCD8: ה-GFP, גיגית, Gal80 FRT2A/SM5-TM6B </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור Flp-out שיבוטים. הנה דוגמה לחצות באמצעות הנהג IV ספציפיים בכיתה 8: פ.פ.ק. Gal4 x-YW, hsFLP; כטב&quot;מ-FRT-CD2, y +-stop-FRT-mCD8: GFP </li></ol> 3. אוסף של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור חוצה תסיסנית בבקבוק אוסף של 25 ° C ו לאסוף עוברים על התפשטות אגר מיץ תפוחים 29 צלחת בשכבה דקה של ממרח שמרים 30,31. </li></ol> 4. הלם חום טיפול של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת ריקה בניגוד צלחת אגר מיץ תפוחים שעליו עוברים נקבעו. חותם סביב אלה שתי צלחות עם Parafilm (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הלם חום, לצלול הצלחת דואר באמבט מים והחזק אותו באמצעות משקולת מתכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עוברי MARCM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עוברים 2h ו דגירה בצלחת פטרי 10 ס&quot;מ מוקף לחלח ברקמות של 25 מעלות צלזיוס במשך 2h נוספים. הערה: התאמת פרוטוקול הלם החום משנה את התדירות שבה הם שיבוטים שנוצרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך מספר קטן יותר של שיבוטים, מכוון נוירונים בודדים בודד, לצלול הלם החום באמבט מים 1h ב 38 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מספר גדול יותר של שיבוטים, הלם חום עבור 45mins ב 38 ° C, ולשחזר את 30mins RT, אז הלם החום שוב 30mins נוספים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף Flp-out עוברים 24 שעות, ו הלם החום 1h ב 38 ° C. </li></ol> 5. הקרנת עבור שיבוטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי ההלם חום, להסיר את המכסה של ההסדר האטומה למים והמקום צלחת אגר מיץ תפוחים בצלחת פטרי 10 ס&quot;מ מוקף ברקמות לחלח. התרבות עוברים הזחלים לאחר מכן ב 25 ° C עד לנדודing 3 rd instar. הערה: התנאים תרבות, במיוחד תזונה, הוכחו לשנות התובע הדנדריטים מורפולוגיה סוכת 32,33. ודא כי הזחלים גדל גישה להדביק שמרים בכל עת, לפקח לחדש את השמרים להדביק כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודה זו ואילך בפרוטוקול, לתמרן בעדינות באמצעות מלקחיים זחלי חרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה בעדינות ולשטוף את הזחלים במי ברז ולאחר מכן מקום לצלחת אגר. הערה: צעד זה מפחית את הקרינה רקע אוטומטי מהמזון או לכלוך על פני הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את הזחלים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי חזק לנתח. זיהוי הזחלים עם GFP חיובי נוירונים / תאים בדופן הגוף. </li></ol> 6. הדמיה in vivo של דנדריטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הזחל לתוך כוס שקופית דיכאון עם טיפה קטנה של גליצרול 80%. מניחים coverslip בשקופית כדי לשתק את הזחל. ודא כי לא נותר אוויר בין הזחל לבין coversliעמ &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחף בעדינות את coverslip לגלגל את הזחל כדי לאפשר ויזואליזציה של הנוירון של עניין. תמונת mCD8: GFP שכותרתו סוכת הדנדריטים באמצעות מיקרוסקופיה confocal. </li></ol> 7. הזחל לנתיחה הערה לפני שמתחילים: התובע דנדריטים נוירון לבזות במהירות לאחר תחילתו של דיסקציה. לנתח כל זחל בודדים פחות 5min כדי להבטיח מורפולוגיה דנדריט טוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נדודים 3 rd הזחלים instar על צלחת Sylgard כפי שתואר לעיל 34 בשינויים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה של התובע נוירון האקסון טרמיני, להבטיח כי מערכת העצבים המרכזית הוא שלם את העצבים סגמנטלי לא שבורים. לאחר פתיחת זחלים, תחילה בזהירות לחתוך את הקשרים קנה הנשימה אל הקיר הגוף ואז בעדינות להסיר את הבטן כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה דנדריטים לבד, להסיר את מערכת העצבים המרכזית לאפשר להחמיא גובר. </li></ol></li></ol> 8. Fixatיונים חסימת פילה הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הזחל ניצח עדיין הצלחת Sylgard, לתקן את זה PFA 4% PBS עבור 20mins ב RT על שייקר בעדינות מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עקבות של רקמות הזחל (שומן הגוף, הנשימה וכו &#39;) לאחר קיבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ב PBST (PBS עם 0.1% טריטון X-100) 10mins 3x על צלחת Sylgard ו שייקר. אם בוחנים Termini האקסון, לשמור על פילה בצלחת Sylgard. (אם דנדריטים מכתים אפשר להעביר את פילה הזחל אל צינור 0.5 מ&quot;ל בשלב זה 34) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הזחלים עבור 20mins ב RT ב 5% נורמלי חמור בדם (NDS) ב PBST על שייקר. </li></ol> 9. הכתמה של פילה הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון חסימת דגירה של הנוגדן הראשוני (ב 5% NDS / PBST) לילה ב 4 מעלות צלזיוס במיכל פלסטיק קטן מוקף לחלח רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורות מתוך 4 ° C ו דגירה שעה נוספת ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 10mins 6x ב PBST. מוסיפים את antib משניody (ב 5% NDS / PBST), ומכסים על מנת למנוע צילום הלבנת fluorophore 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה או ב RT במשך שעתיים, או לילה ב 4 ° C ואחריו שעה אחת ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את 10mins הזחלים 6x ב PBST והמשך גובר. </li></ol> 10. הרכבה של פילה הזחל לבדיקה של סוכת דנדריט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר כל פילה הזחל ישר ככל הניתן באמצעות מספריים או אזמל מנתחים לנתק את הראש (כולל ווים הפה), ואת האחורי (כולל spiracles) 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פילה הזחל בשקופית לציפורן בצד למטה, לעלות ב 80% גליצרול ו לאטום את הצדדים של coverslip עם לק על &quot;מהיר&quot; הר 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הרכבה קבוע תמונה ברורה יותר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פילה גזור הזחל שרירים בצד למטה על ירידה של PBS על coverslip PLL, זה יהיה מהר לדבוק coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כנוזל רב ככל האפשר לאחר הרכבה, however לא לאפשר לו להתייבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את coverslip (עם פילה הזחל המצורפת) באמצעות סדרה אתנול: אתנול 35%, ואחריהם 50%, 70%, 95% ו 100% אתנול 2x בסופו של דבר כל אחד במשך 10 דקות (את פתרון 2 100% EtOH צריך להיות שונה לעיתים קרובות ;) סוף סוף, לשטוף 2-3x 10mins ב קסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים טיפת DPX mountant (קסילן Distyrene plasticizer) בשקופית נקי בזהירות להניח את coverslip פילה בצד למטה למעלה. שמור בחושך, ולהמתין יום אחד עבור DPX להגדיר לפני הדמיה. </li></ol></li></ol> 11. הרכבה של פילה הזחל לבדיקה של Termini האקסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העצבים סגמנטלי רץ בין PNS ו CNS ללא פגע במהלך קיבעון לנתיחה, והכתים כדי לאפשר מעקב של אקסונים מן הפריפריה גוף תא עצב תחושתי על VNC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר כל הזחל פילה לציפורן בצד למטה גליצרול 80% שקופית דיכאון. עקוב אחר אקסונים מגוף התא אל התובעVNC תחת מיקרוסקופ confocal. הערה: PNS הנוירונים בכל פרויקט קיר גוף קטע לקטע מאותו מקור של VNC. </li></ol> 12. נציג תוצאות: תוצאות נציג מוצגות דמויות 3-5. איור. 3 מציג את סוכת שלמה של IV בכיתה דה נוירון, שנתפסו in vivo תחת מיקרוסקופ confocal. איור. 4 מראה תקריב של חלק סוכת דנדריט של המעמד השלישי שכותרתו immunohistochemically נוירון כי תוקנה כראוי כדי לשמור על המורפולוגיה. הבלעה הקשורים מציגה את השפלה שעלול להתרחש לאחר דיסקציה כושל ועל קיבעון (שניהם מוכתמים נוגדן אנטי-GFP). איור. 5 מראה בכיתה אחת IV האקסון הסופית של מערכת העצבים המרכזית (אנטי GFP, ירוק); כל IV Termini בכיתה הם שיתוף מוכתם אנטי CD2 (מג&#39;נטה). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig1.jpg" /> איור 1 סקירת הפרוטוקול. א) איסוף ולאחר מכן חום עוברים זעזוע. ב)<html> בחר הזחל עם GFP חיובי התובע נוירון לשבט, ואז התמונה GFP שכותרתו דנדריט סוכה הזחל לחיות. ג) מנתחים את הזחל, ולאחר מכן immunohistochemically הכתם פילה. ד) הר פילה מוכתם, ואז התמונה סוכת הדנדריטים ותחזיות axonal של נוירון התובע שיבוטים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig2.jpg" /> איור 2 הכנת צלחת אגר מיץ תפוחים להלם חום. קחו את הצלחת (חץ לבן, א.ב.), להוסיף המנה השנייה פטרי על גבי (אדום חץ ב) ו חותם מסביב עם Parafilm (חץ כחול, ב). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig3.jpg" /> איור 3 בתמונה vivo של סוכת דנדריט של mCD8: GFP שכותרתו שיבוט MARCM (גנוטיפ כמו 2.1) המייצג הרביעי בכיתה (v&#39;ada) הנוירון של הזחל instar 3 rd. סרגל קנה המידה 50μm. d/3111/3111fig4.jpg &quot;/&gt; איור 4 mCD8: GFP שכותרתו שיבוט MARCM של המעמד השלישי נוירון (ddaA) מוכתם נוגדן אנטי-GFP, מראה מורפולוגיה טוב לאחר דיסקציה קיבעון מוצלח (ירוק). מראה הבלעה השפלה דנדריט (חצים לבנים) המתרחשים לאחר דיסקציה קיבעון נכשל (מג&#39;נטה). סרגל קנה המידה 25μm. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3111/3111fig5.jpg" /> איור 5 3 rd instar הזחל VNC. שיבוט Flp, מתוך מסוף יחיד בכיתה ו האקסון (vdaB) (גנוטיפ כמו 2.2) הוא זוהה באמצעות נוגדן אנטי-GFP (ירוק). Anti-CD2 כל התוויות IV בכיתה טרמיני (מג&#39;נטה). סרגל קנה המידה 25μm.

<ol>
	<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons.">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li><li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila:+the+role+of+Collier.">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315, 232-242 (2008).</li><li>Hattori, Y., Sugimura, K., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+expression+of+Knot/Collier,+a+transcriptional+regulator+of+the+EBF/Olf-1+family,+endows+the+Drosophila+sensory+system+with+neuronal+class-specific+elaborated+dendritic+patterns.">Selective expression of Knot/Collier, a transcriptional regulator of the EBF/Olf-1 family, endows the Drosophila sensory system with neuronal class-specific elaborated dendritic patterns.</a> Genes Cells. 12, 1011-1022 (2007).</li><li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knot/Collier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape.">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li><li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt.">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43, 809-822 (2004).</li><li>Li, W., Wang, F., Menut, L., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BTB/POZ-zinc+finger+protein+abrupt+suppresses+dendritic+branching+in+a+neuronal+subtype-specific+and+dosage-dependent.">BTB/POZ-zinc finger protein abrupt suppresses dendritic branching in a neuronal subtype-specific and dosage-dependent.</a> 43, 823-834 (2004).</li><li>Zlatic, M., Landgraf, M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+specification+of+axonal+arbors:+atonal+regulates+robo3+to+position+terminal+branches+in+the+Drosophila+nervous+system.">Genetic specification of axonal arbors: atonal regulates robo3 to position terminal branches in the Drosophila nervous system.</a> Neuron. 37, 41-51 (2003).</li><li>Grueber, W. B., Ye, B., Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrites+of+distinct+classes+of+Drosophila+sensory+neurons+show+different+capacities+for+homotypic+repulsion.">Dendrites of distinct classes of Drosophila sensory neurons show different capacities for homotypic repulsion.</a> Curr Biol. 13, 618-626 (2003).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons.">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112, 805-818 (2003).</li><li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hamlet,+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology.">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li><li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+regulating+dendritic+outgrowth,+branching,+and+routing+in+Drosophila.">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+mechanisms+to+define+neuron+class-specific+dendrite+arbor+morphology.">Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology.</a> Cell Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).</li><li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila.">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Mol. Cell. Neurosci. 35, 383-396 (2007).</li><li>Nishimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+Behaviors+and+Segmental+Coordination+During+Larval+Locomotion+Is+Disrupted+by+Nuclear+Polyglutamine+Inclusions+in+a+New+Drosophila+Huntington's+Disease-Like+Model.">Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model.</a> J Neurogenet. 24, 194-206 (2010).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li><li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li><li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion.">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19, 799-806 (2009).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Larval+CNS+in+Drosophila+Melanogaster.">Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (1), e85-e85 (2006).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Merritt, D. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+sensory+neurons+in+the+Drosophila+embryo+correlate+with+sensory+modality,+soma+position,+and+proneural+gene+function.">Central projections of sensory neurons in the Drosophila embryo correlate with sensory modality, soma position, and proneural gene function.</a> J Neurosci. 15, 1755-1767 (1995).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development.">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130, 5065-5072 (2003).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Wong, A. M., Wang, J. W., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+representation+of+the+glomerular+map+in+the+Drosophila+protocerebrum.">Spatial representation of the glomerular map in the Drosophila protocerebrum.</a> Cell. 109, 229-241 (2002).</li><li>Shimono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidendritic+sensory+neurons+in+the+adult+Drosophila+abdomen:+origins,+dendritic+morphology,+and+segment-+and+age-dependent+programmed+cell+death.">Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death.</a> Neural Dev. 4, 37-37 (2009).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Kaczynski, T. J., Gunawardena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+Embryonic+Nervous+System+in+Whole-mount+Drosophila+Embryos.">Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (46), e2150-e2150 (2010).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Medina, P. M., Swick, L. L., Andersen, R., Blalock, Z., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+forward+genetic+screen+for+identifying+mutations+affecting+larval+neuronal+dendrite+development+in+Drosophila+melanogaster.">A novel forward genetic screen for identifying mutations affecting larval neuronal dendrite development in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 172, 2325-2335 (2006).</li><li>Mirouse, V., Swick, L. L., Kazgan, N., St Johnston, D., Brenman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LKB1+and+AMPK+maintain+epithelial+cell+polarity+under+energetic+stress.">LKB1 and AMPK maintain epithelial cell polarity under energetic stress.</a> J Cell Biol. 177, 387-392 (2007).</li><li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Larval+NMJ+Immunohistochemistry.">Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. 25, e1108-e1108 (2009).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Sugimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons.">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li><li>Landgraf, M., Sanchez-Soriano, N., Technau, G. M., Urban, J., Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+the+Drosophila+neuropile:+a+strategy+for+the+standardised+characterisation+of+genetically+amenable+neurites.">Charting the Drosophila neuropile: a strategy for the standardised characterisation of genetically amenable neurites.</a> Dev Biol. 260, 207-225 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הזחל תסיסנית מודל התובע נוירון מספקת מערכת אחת גנטי מעולה לחקור מנגנוני בקרה נוירון מורפולוגיה היווצרות מעגל. MARCM משמש בדרך כלל עבור תיוג ליצירת מוטציה התובע שיבוטים נוירון. עבור MARCM אנו משתמשים או מחבת-עצביים (למשל Gal4 c155) או התובע נוירון ספציפי הנ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> SZX16 לנתיחה מיקרוסקופ פלואורסצנטי (עם GFPHQ לסנן) </td><td> אולימפוס </td><td> SZX16 </td><td></td></tr><tr><td> חיים מלקחיים חרקים </td><td> FST </td><td> 26030-10 </td><td></td></tr><tr><td> 26mm x 76mm דיכאון שקופיות זכוכית </td><td> Toshinriko ושות </td><td> T8-R004 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 (או Silpot 184) </td><td> Dow Corning </td><td> 3097358-1004 </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> P-1524 </td><td> מוצר זה הוכח כיעיל ביותר </td></tr><tr><td> DPX הרכבה בינונית </td><td> סיגמא </td><td> 44581 </td><td></td></tr><tr><td> הארנב נגד ה-GFP </td><td> Invitrogen </td><td> A-11122 </td><td> דילול 1:500 </td></tr><tr><td> עכברוש אנטי CD8 </td><td> Caltag </td><td> 5H10 </td><td> דילול 1:200 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי CD2 </td><td> AbD serotec </td><td> MCA443R </td><td> דילול 1:700 </td></tr><tr><td> עכבר אנטי Fasciclin2 </td><td> DSHB </td><td> 1D4 </td><td> דילול 1:10 </td></tr></table>

morphological analysis of drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics

התפתחות מערכת העצבים מחייב את המפרט הנכון של נוירון עמדה וזהות, ואחריו התפתחות דנדריטים מדויק בכיתה ספציפית נוירון וחיווט axonal. לאחרונה הדנדריטי (DA) arborization עצב סנסורי של המערכת תסיסנית הזחל העצבים ההיקפית (PNS) הפכו מודלים גנטי חזק שבו להבהיר שני מנגנונים כלליים בכיתה ספציפית של בידול נוירון. ישנם ארבעה הראשי התובע כיתות נוירון (I-IV) 1. הם שם לפי סדר המורכבות הגוברת סוכת דנדריט, יש מעמד ספציפי ההבדלים בשליטה הגנטי של בידול שלהם 20-10. המערכת החושית התובע הוא מודל מעשי לחקור את המנגנונים המולקולריים מאחורי שליטתה של מורפולוגיה הדנדריטים 11-13 כי: 1) הוא יכול לנצל את הכלים גנטי חזק זמין זבוב הפירות, 2) התובע דנדריט נוירון סוכת פורשת רק 2 מימדים מתחת אופטית CLEלציפורן ar הזחל ולכן קל לדמיין עם רזולוציה גבוהה in vivo, 3) את המגוון בכיתה ספציפית במורפולוגיה הדנדריטים מאפשרת ניתוח השוואתי למצוא אלמנטים מרכזיים שליטה על היווצרות של עצים דנדריטים פשוט מול מסועפת מאוד, 4) סוכת הדנדריטים סטריאוטיפיות צורות שונות של נוירונים התובע להקל על ניתוחים סטטיסטיים morphometric. פעילות התובע נוירון משנה את הפלט של גנרטור דפוס הזחל מרכזי תנועה 14-16. שונה התובע כיתות נוירון יש שיטות שונות חושית, והפעלה שלהם מעוררת תגובות התנהגותיות שונות 14,16-20. מעמדות שונים ועוד לשלוח תחזיות axonal סטריאוטיפי לתוך מערכת הזחל תסיסנית מרכזי העצבים בחוט עצב הגחון (VNC) 21. תחזיות אלו לסיים עם ייצוגים הטופוגרפי של מודליות הן התובע נוירון חושי את המיקום בקיר גוף השדה הדנדריטים 7,22, 23. לפיכך, בחינה של תחזיות התובע axonal יכול לשמש כדי להבהיר המנגנונים מיפוי טופוגרפי 7,22,23, כמו גם את החיווט של תנועה הזחל פשוט ויסות מעגל 14-17. אנו מציגים כאן מדריך מעשי ליצור ולנתח פסיפסים גנטי 24 נוירונים סימון התובע באמצעות MARCM (ניתוח פסיפס עם מרקר תא Repressible) 1,10,25 ו Flp-out 22,26,27 טכניקות (מסוכם באיור. 1).

Watch this Scientific Journal Video about Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics at JoVE.com

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Arborization הנוירונים הדנדריטים חושית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; הזחל מערכת העצבים ההיקפית הם מודלים שימושי להבהיר הן בכלל נוירון מעמד ספציפי מנגנוני התמיינות נוירון. אנו מציגים מדריך מעשי ליצור ולנתח הדנדריטים נוירון arborization פסיפסים גנטית.

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

morphological-analysis-drosophila-larval-peripheral-sensory-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

15.2K Views.  RIKEN Brain Science Institute. Arborization הנוירונים הדנדריטים חושית של תסיסנית הזחל מערכת העצבים ההיקפית הם מודלים שימושי להבהיר הן בכלל נוירון מעמד ספציפי מנגנוני התמיינות נוירון. אנו מציגים מדריך מעשי ליצור ולנתח הדנדריטים נוירון arborization פסיפסים גנטית.

Video: Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological studies to depict intricate morphologies and to manipulate the function of genes in subsets of neurons within otherwise unmarked and unperturbed organisms. Genetic mosaics generated in the MARCM system are mediated through site-specific recombination between homologous chromosomes within dividing precursor cells to produce both marked (MARCM clones) and unmarked daughter cells during mitosis. An extension of the MARCM method, called twin-spot MARCM (tsMARCM), labels both of the twin cells derived from a common progenitor with two distinct colors. This technique was developed to enable the retrieval of useful information from both hemi-lineages. By comprehensively analyzing different pairs of tsMARCM clones, the tsMARCM system permits high-resolution neural lineage mapping to reveal the exact birth-order of the labeled neurons produced from common progenitor cells. Furthermore, the tsMARCM system also extends gene function studies by permitting the phenotypic analysis of identical neurons of different animals. Here, we describe how to apply the tsMARCM system to facilitate studies of neural development in Drosophila.

Here, we present a protocol for a mosaic labeling technique that permits the visualization of neurons derived from a common progenitor cell in two distinct colors. This facilitates neural lineage analysis with the capability of birth-dating individual neurons and studying gene function in the same neurons of different individuals.

ניתוח שושלת תא ולימודי תפקוד גן באמצעות Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Developmental Biology

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

To understand how differences in complex cell shapes are achieved, it is important to accurately follow microtubule organization. The Drosophila larval body wall contains several cell types that are models to study cell and tissue morphogenesis. For example tracheae are used to examine tube morphogenesis1, and the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larva have become a primary system for the elucidation of general and neuron-class-specific mechanisms of dendritic differentiation2-5 and degeneration6.
The shape of dendrite branches can vary significantly between neuron classes, and even among different branches of a single neuron7,8. Genetic studies in DA neurons suggest that differential cytoskeletal organization can underlie morphological differences in dendritic branch shape4,9-11. We provide a robust immunological labeling method to assay in vivo microtubule organization in DA sensory neuron dendrite arbor (Figures 1, 2, Movie 1). This protocol illustrates the dissection and immunostaining of first instar larva, a stage when active sensory neuron dendrite outgrowth and branching organization is occurring 12,13.
In addition to staining sensory neurons, this method achieves robust labeling of microtubule organization in muscles (Movies 2, 3), trachea (Figure 3, Movie 3), and other body wall tissues. It is valuable for investigators wishing to analyze microtubule organization in situ in the body wall when investigating mechanisms that control tissue and cell shape.

Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall

To understand how complex cell shapes, such as neuronal dendrites, are achieved during development, it is important to be able to accurately assay microtubule organization. Here we describe a robust immunohistological labeling method to examine microtubule organization of dendritic arborization neuron sensory dendrites, trachea, muscle, and other Drosophila larva body wall tissues.

תיוג Immunohistological של microtubules ב דנדריטים Neuron חושי, Tracheae, והשרירים של תסיסנית גוף Larva הכותל

To understand how differences in complex cell shapes are achieved, it is important to accurately follow microtubule organization. The Drosophila larval ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

דמיינו דרוזופילה הרגל מוטור נוירון אקסונים דרך הקוטיקולה למבוגרים

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

שני אלגוריתמים עבור תפוקה גבוהה וכימות Multi-פרמטרית של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; מורפולוגיה צומת Neuromuscular

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video