وقد تم دعم هذا العمل عن طريق منح وزارة الزراعة الأميركية 1999-35212-8680 ، 2005-01378 ، و2010-04288-01 وصناديق وزارة الزراعة الأميركية الفورمولا ودولة المنحة جورجيا الطب البيطري للبحوث الزراعية. تم تطوير بروتوكول وصفها في هذا المنشور لاستخدامها من قبل الطلاب الجامعيين كجزء من الدورات البحوث الموجهة : MIBO 4900L ، 4960H الجينات ، BCMB 4960L ، و4960H بيول في جامعة جورجيا واستخدامها من قبل الطلاب في العديد من مشاريع البحوث الوبائية الجزيئية في مورير المختبر. نود أن نشكر العديد من الطلاب الذين أدوا الجامعية البحوث والمختبرات في مورير لي ، ورئيس قسم لدينا ، وجون Glisson لدعم جهودنا الرامية إلى دمج التعليم الجامعية في مجال البحث.

<ol>
	<li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica.">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 .</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg,+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles.">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. o. f. a. c. r. e., Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. a. u. r. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles.">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li><li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments.">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li><li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques.">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li><li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper.">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory. , (1989).</li><li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air.">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

معظم المتاحة تجاريا اختبارات PCR للكشف عن الجينات أهداف السالمونيلا فريدة للجنس (مثلا invA). ومع ذلك ، ليس كل السالمونيلا متساوون في قدرتهم لتسبب المرض لدى البشر أو انتشار المرض في قطعان الحيوانات. التعرف المبكر للخلافات في مستضدي LPS السالمونيلا O - مستضد وflagellinH1 ومستضدات H2 قد تؤدي إلى التفريق بين السالمونيلا إلى أكثر من 2500 serovars بناء على هذه الاختلافات مستضدي. وهناك 46 مستضدات O و 86 متميزا متميزة مستضدات فلاجيلين (H) التي تم تحديدها في جنس السالمونيلا السالمونيلا قد تكون في حوزتها واحد (H1) أو مختلفين (H1 و H2) flagellins. اعترفت مجموعة مختلفة من O ، H1 ، H2 ومستضدات حساب serovars السالمونيلا 2500 اليوم. يتم تعيين ضرب مصلي على أساس صيغة مستضدي المستمدة من تحديد هوية الفرد ومستضدات O H. يتم كتابة الصيغة كما مستضدي O : H1 : H2 ، وحيث &quot;--&quot; ، ويشير إلى غياب أو فلاجيلين H1 H2 و &quot;NT&quot; (غير typeable) لالسالمونيلا سلبية على O - مستضد. على سبيل المثال ، يتم تعيين لضرب مصلي التيفية الفأرية S. enterica عزل مع الصيغة مستضدي B : ط : 1،2 بينما تعطى الملهبة لعزل مع D1 الصيغة : ز ، م : -. هذا الاختلاف في عدد السكان مستضدي السالمونيلا هو مظهر الخارجي لخلافات على المستوى النوكليوتيدات أنه لا يمكن بالتالي يمكن استغلالها بسهولة من قبل PCR. حددنا الاختلافات الجينية المرتبطة O محددة والأليلات H لوضع allelotyping PCR لتحديد س. enterica serovars : الملهبة ، الهدار ، هايدلبرغ ، والتيفية الفأرية (3). احالة صحيحة والإبلاغ عن ضرب مصلي السالمونيلا يتطلب اختبار لجميع الأليلات المرتبطة O : H1 : الصيغ مستضدي H2 للأمعاء (D1 : ز ، م : --) ، الهدار (C2 : Z10 : ه ، ن ، س) ، هايدلبرغ (B : ص : 1،2) ، والتيفية الفأرية (B : الأول : 1،2). أليل دون معرفة أو المستضد O ، عن العثور على ز H1 ، م أليل وحدها لا تحدد بالضرورة عزل السالمونيلا الملهبة والسالمونيلا وغيرها serovars : أغونا ، كاليفورنيا ، ومونتيفيديو ، كما تملك هذه الأليل نفسه. بينما كان مصمما أصلا للallelotyping PCR للكشف عن الصدارة المذكورة serovars السالمونيلا ، وهذا يمكن اختبار تحديد مبلغ إضافي 19 serovars (الجدول 3). كان مصمما أصلا لدينا allelotyping PCR للكشف عن O و H الأليلات. في الممارسة العملية ، فقد أصبح أكثر عملية وفعالة من حيث التكلفة بالنسبة لنا للتعرف على O - المستضد من خلال اختبار تراص الشريحة ، وذلك باستخدام O - أمصال مضادة محددة ، بدلا من أداء allelotyping O PCR عند العمل مع الثقافات السالمونيلا المعزولة. ومع ذلك ، فإننا نوصي باستخدام allelotyping O PCR إذا المختبر الخاص يستخدم هذا PCR كشاشة (2) أو لكتابة المقدمة السالمونيلا المعزولة على بطاقات اتفاقية التجارة الحرة (6) ، وتشتمل على السالمونيلا PCR محددة مع الشاشة الأولى من عينات (4 ). الحد من تقارير إتمام المشروعات allelotyping لعينات فقط تلك التي يتم تحديدها من قبل والسالمونيلا PCR أو الاختبارات البيوكيميائية / مستضدي. وقد تم تحسين البروتوكول الموصوفة في هذه المقالة للاستخدام مع Rapidcycler التكنولوجيا ايداهو ، وهو thermocycler الهواء الساخن الذي يسمح احد لتقليص حجم التفاعل وظروف التفاعل يعمل في وقت أقل من كثير thermocyclers كتلة التدفئة. ربما على التكيف مع هذا البروتوكول للاستخدام مع التدفئة thermocycler كتلة يتطلب تحسين ظروف التفاعل تجريبيا عن طريق خفض / رفع درجات الحرارة الصلب ، وتعديل تركيزات التمهيدي ، أو تعديل MgCl 2 التركيزات. على سبيل المثال ، كان علينا أن نكيف بروتوكول للبحوث PTC MJ - 200 thermocycler على النحو التالي. العمل مع وحدات التخزين نفس رد الفعل المذكورة في الجدول رقم 1 ، والأوراق المالية العاملة concentrationof كان المخفف مجموعة التمهيدي الأول إلى 2.5 ميكرومتر ، وخفض درجة الحرارة الصلب من 55 درجة مئوية إلى 45 درجة مئوية ، وحضانة مرات في تمسخ ، الصلب والإرشاد الخطوات وقد تطول الى 20 ق لPCR ط / ز ، allelotyping م. وجود الضوابط المناسبة الإيجابية والسلبية لا بد في البدء الأولية والأمثل لأي PCR ، بما في ذلك البروتوكولات التي تم نشرها. نوصي الحصول على serovars السالمونيلا المعروفة ، وتحديدا الشرجية (E1 : ه ، ح : 1،6) ، الملهبة (D1 : ز ، م : --) ، الهدار (C2 : Z10 : ه ، ن ، س) ، هايدلبرغ (B : ص : 1،2) ، مونتفيديو (C1 : ز ، م ، ق : 1،2،7) والتيفية الفأرية (B : الأول : 1،2) ؛ والقولونية مختبر K12 سلالة (DH5α ، LE393 ، JM109 ، الخ. ) ، والضوابط الإيجابية والسلبية على التوالي للاختبارات PCR allelotyping الموضحة في هذه المقالة. والعديد من هذه serovars السالمونيلا بمثابة الضوابط إما إيجابية أو سلبية ، اعتمادا على أليل يتم اختباره. احتياطات معينة ومبادئ توجيهية ينبغي اتباعها أثناء أداء هذه وغيرها من أي PCR التشخيص. الأول ، الفصل الماديإعداد القالب ، PCR مجموعة المتابعة ، وهلام إستشراد أمر حاسم في منع PCR ممكن المرحل التلوث والتقارير الكاذبة الخاطئة من ايجابيات. بالإضافة إلى ذلك ، إدراج الضوابط المناسبة أمر ضروري في أي PCR الروتينية وهذه الضوابط تحديد المشاكل التي تنشأ والمساعدة في تفسير النتائج (5). الأهم من ذلك ، والاتساق أمر ضروري ، خاصة فيما يتعلق بالشروط الكهربي لandestimation amplicon الكشف (PCR المنتج) من حجم amplicon. لتوضيح هذه النقطة ، علقنا الكهربائي عمدا في وقت سابق من المقصود في الشكل 1A. ليست معايير الوزن الجزيئي (حارات 1 و 13) والسيطرة الايجابية (حارة 2) فصل كاف لتقدير الأحجام بدقة أو مراعاة الفصل بين شظايا الحمض النووي ، حيث أن هناك اختلافات صغيرة (~ 50 BP) في الأحجام. فصل كاف من شظايا من الحمض النووي ، ولا سيما معايير الوزن الجزيئي ، كما من الضروري إبلاغ ايجابيات يعتمد على تقدير دقيق لحجم amplicon والتمييز &quot;الإيجابي الحقيقي&quot; من المنظمات غير محددة amplicons التي لوحظ في بعض الأحيان في إدارة اليومية في أي PCR (5 ). على سبيل المثال ، هناك amplicon غير محددة في الشكل 1B ، لين 7 (~ 700 شركة بريتيش بتروليوم في الحجم). وكان الكهربائي قد توقفت في وقت مبكر جدا ، عندما كانت الجبهة صبغ فقط عند نقطة منتصف الطريق في agarose هلام ، لن يكون هناك فرق بسيط ما بين 500 سنة مضت ، والحمض النووي شظايا BP 700. لذا ، كان من عينة في حارة 7 ، عن طريق الخطأ إيجابية لكلا الأول وغرام ، الأليلات م. أخيرا ، يحتاج المرء إلى التعرف على القيود المرتبطة بأي اختبار. العديد من PCR allelotyping H1/H2 لم يكن لديك القدرة على التمييز لتمييز الفروق الدقيقة في الأليلات الوراثية تنتمي إلى 1،2 H2 ، 1،5 ، 1،6 ، 1،7 معقد مستضد ؛ ه ، ن ، س / ه ، ن ، z15 معقدة مستضد والمستضد G H1 معقدة ، والذي يتضمن أليل ز م. واحد أو اثنين من التغييرات من الأحماض الأمينية حساب الحواتم مختلفة موجودة في هذه المستضدات سوطي. لذا كان من الصعب بالنسبة لنا لتصميم الاشعال التي يمكن أن تستغل هذه الزوج قاعدة واحدة أحيانا اختلافات في التسلسل الجيني فلاجيلين (3). على سبيل المثال ، السالمونيلا serovars دبلن (D1 : ز ، ع : --) وبيرتا (D1 : و ، ز ، ر : --) هي أيضا PCR إيجابية مع ز لدينا ، mallelotyping الاشعال. يمكن للallelotyping الاشعال H2 لا يميز التيفية الفأرية (B : الأول : 1،2) من لاغوس (B : الأول : 1،5) ، هايدلبرغ (B : ص : 1،2) من برادفورد (B : ص : 1،5) ، Winneba (B : ص : 1،6) ، أو ريمو (B : ص : 1،7) ، أو هدار (C2 : Z10 : ه ، ن ، س) من جلوستروب (C2 : Z10 : ه ، ن ، z15). في حين أن احتمال مواجهة بعض هذه serovars : لاغوس ، برادفورد ، Winneba ، ريمو Glustrup أو بعيد ، بل هو احتمال ويتطلب توفير إما إخلاء بشأن الحد من الاختبارات &quot;أو اختبار آخر مؤكد. في الختام ، وهذا المصلي PCR المستندة يحدد بسرعة س. enterica serovars الملهبة ، الهدار ، هايدلبرغ والتيفية الفأرية ، والإخراج ، H1 ، H2 والأليلات المرتبطة 19 serovars إضافية. هذا الاختبار هو سريع وفعال من حيث التكلفة البديلة لنهج الميكروبيولوجية التقليدية إلى السالمونيلا المصلي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم المادة </th><th> نوع </th><th> شركة </th><th> رقم كتالوج </th><th> تعليق </th></tr><tr><td> لوريا Bertani </td><td></td><td> الصياد </td><td></td><td> (أو أي مصدر للمقارنة) </td></tr><tr><td> أنابيب Microfuge </td><td> سعة 1.5 مل </td><td> الصياد </td><td></td><td> (أو أي مصدر للمقارنة) </td></tr><tr><td> الإيثانول </td><td> برهان 200 </td><td> الصياد </td><td></td><td> (أو أي مصدر للمقارنة) </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> البيولوجيا الجزيئية الصف </td><td> سيغما </td><td></td><td> (أو أي مصدر للمقارنة ؛ PCR فقط) </td></tr><tr><td> 10 × PCR الاحتياطي : </td><td> 20 ملي MgCl 2 </td><td> ايداهو التكنولوجيا </td><td></td><td> (العازلة يأتي مع جيش صرب البوسنة ، وFicoll التارتازين) </td></tr><tr><td></td><td> 30 ملم MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 ملم MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR الاشعال </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> روش </td><td></td><td> (أو أي مصدر للمقارنة) </td></tr><tr><td> طق بوليميراز الدنا </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (أو أي مصدر للمقارنة) </td></tr><tr><td> ماصات الشعرية </td><td> حجم 10 ميكرولتر </td><td> ايداهو التكنولوجيا </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cycler السريع </td><td></td><td> ايداهو التكنولوجيا </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> انخفاض تكافؤ فرص العمل ؛ البيولوجيا الجزيئية الصف </td><td> BioRad </td><td></td><td> (أو أي مصدر للمقارنة) </td></tr><tr><td> 50 X تاي الاحتياطي أو 5X الاحتياطي TBE </td><td></td><td> الصياد </td><td></td><td> (أو أي مصدر للمقارنة) </td></tr><tr><td> إيثيديوم بروميد </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (أو أي مصدر للمقارنة) </td></tr><tr><td> الأفقي ، الغاطسة مع الغرفة الكهربائي للهلام العفن هلام </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (أو أي مصدر للمقارنة) </td></tr><tr><td> إمدادات الطاقة </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (أو أي مصدر للمقارنة) </td></tr><tr><td> تصوير الجزيئي جل دوك النظام </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (أو أي مصدر للمقارنة) </td></tr></tbody></table> الجدول 4. المواد

an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium

تقارير إتمام المشروعات التجارية الحالية اختبارات لتحديد الجينات المستهدفة السالمونيلا فريدة من نوعها لهذا جنس. ومع ذلك ، هناك اثنين من الأنواع والسلالات الست ، وأكثر من 2500 serovars السالمونيلا مختلفة ، وليست جميعها متساوية في أهميتها على الصحة العامة. على سبيل المثال ، وإيجاد س. enterica السلالات الثالث ألف أريزونا على طبقة البيض مزرعة الجدول غير ذات أهمية بالمقارنة مع عزلة س. enterica السلالات الأول ضرب مصلي الملهبة ، والسبب الرئيسي لداء السلمونيلات مرتبطة استهلاك بيض المائدة. ويتم تحديد Serovars على أساس الاختلافات في مستضدي lipopolysaccharide (LPS) (O مستضد) وفلاجيلين (H1 و H2 المستضدات). هذه الاختلافات هي مستضدي المظهر الخارجي للتنوع الجينات والأليلات الجينات المرتبطة بهذا النمط الظاهري. طورنا allelotyping ، PCR أن مفاتيح متعددة على الاختلافات الجينية بين أربعة S. الرئيسية enterica السلالة serovars أنا وجدت في الدواجن والمرتبطة بأمراض بشرية كبيرة في الولايات المتحدة. واستهدفت أزواج التمهيدي PCR لتسلسل الجينات الرئيسية أو فريدة من نوعها لضرب مصلي السالمونيلا محددة ومصممة لإنتاج amplicon مع حجم معين لهذا الجين أو أليل. السالمونيلا ضرب مصلي تم تعيينه لعزل استند في على الجمع بين نتائج اختبار PCR محددة لLPS والأليلات فلاجيلين الجينات. في تقارير إتمام المشروعات متعددة الموصوفة في هذه المقالة هي محددة للكشف عن س. enterica السلالة أنا serovars الملهبة ، الهدار ، هايدلبرغ ، والتيفية الفأرية. نحن هنا لشرح كيفية استخدام تقارير إتمام المشروعات متعددة لتحديد ضرب مصلي لعزل السالمونيلا.

Watch this Scientific Journal Video about An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium at JoVE.com

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

نحن تصف PCR متعددة للكشف السريع لserovars السالمونيلا الملهبة enterica ، الهدار ، هايدلبرغ ، والتيفية الفأرية. يمكن التعرف على السالمونيلا serovars محددة من خلال استهداف متعددة PCR لتسلسل الجينات وفريدة من نوعها إلى الكتلة الحيوي O - مستضد وفلاجيلين لضرب مصلي معين. يتم تعيين ضرب مصلي ثم إلى عزل السالمونيلا استنادا إلى مظهر معين amplicons الحجم ، (PCR المنتج) المقابلة لأليل الهدف.

وPCR لتحديد Allelotyping السالمونيلا enterica serovars الملهبة ، الهدار ، هايدلبرغ ، والتيفية الفأرية

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

an-allelotyping-pcr-for-identifying-salmonella-enterica-serovars

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

21.6K Views.  University of Georgia. نحن تصف PCR متعددة للكشف السريع لserovars السالمونيلا الملهبة enterica ، الهدار ، هايدلبرغ ، والتيفية الفأرية. يمكن التعرف على السالمونيلا serovars محددة من خلال استهداف متعددة PCR لتسلسل الجينات وفريدة من نوعها إلى الكتلة الحيوي O - مستضد وفلاجيلين لضرب مصلي معين. يتم تعيين ض?...

Video: An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi&#039;s Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

تحديد الجينات المستحثة بواسطة Dysregulated الفيروسة ساركومة المرتبطة كابوزي (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

على<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة عدم تجانس التمايز بلعم الإنسان والاستقطاب

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium bacterial colonies growing inside tumors. 
We generated model xenograft tumors in mice by subcutaneous injection of a human ovarian cancer cell line, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). 
We transformed attenuated strains of S. typhimurium bacteria (ELH430:SL1344 phoPQ- 1) with a constitutively expressed luciferase (luxCDABE) plasmid for visualization2. These strains specifically colonize tumors while remaining essentially non-virulent to the mouse1. 
Once measurable tumors were established, bacteria were injected intravenously via the tail vein with varying dosage. Tumor-localized, bacterial gene expression was monitored in real time over the course of 60 hours using an in vivo imaging system (IVIS). At each time point, tumors were excised, homogenized, and plated to quantitate bacterial colonies for correlation with gene expression data. 
Together, this data yields a quantitative measure of the in vivo growth and gene expression dynamics of bacteria growing inside tumors.

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium bacterial colonies growing inside tumors. This video covers tumor cell preparation and implantation, bacteria preparation and injection, whole-animal luminescence imaging, tumor excision, and bacterial colony counting.

قياس النمو وحيوية التعبير الجيني للورم استهداف<em&gt; S. تيفوميوريم</em&gt; البكتيريا

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

إجراءات لتحديد المعدية البريونات بعد المرور عبر الجهاز الهضمي لأنواع الطيور

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

بروتوكول لتصيب<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; مع<em&gt; السالمونيلا التيفية الفأرية</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

عالية الإنتاجية الفحص إلى النمط الظاهري<em&gt; السالمونيلا الملهبة لل</em&gt; جمعية التيفية الفأرية، والغزو، والنسخ المتماثل في الضامة

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

التنميط الجيني ل<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; من جانب خاص بالريبوسوم فاصل PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...