Bu çalışma, ABD Tarım Bakanlığı Hibe 1999-35212-8680 2.005-01.378 ve 2010-04288-01, USDA Formula Fonları ve Gürcistan&#39;ın Veterinerlik Tarımsal Araştırma Grant Devlet tarafından desteklenen olmuştur. Bu yayında açıklanan protokol yönettiği araştırma derslerin bir parçası olarak lisans öğrencileri tarafından kullanılmak için geliştirilmiştir: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L, ve Georgia Üniversitesi BIOL 4960H ve Maurer birkaç moleküler epidemiyoloji araştırma projeleri öğrenciler tarafından kullanılan laboratuvar. Maurer ve Lee laboratuvarlar araştırmalar yapmış, pek çok lisans öğrencileri ve Bölüm Başkanı John Glisson araştırma ile lisans eğitimi bütünleştirmek için çabalarımızı desteklemek için teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica.">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 .</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg,+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles.">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. o. f. a. c. r. e., Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. a. u. r. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles.">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li><li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments.">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li><li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques.">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li><li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper.">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory. , (1989).</li><li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air.">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Salmonella cinsi (örn. invaziv) özgü hedefleri genlerin tespiti için piyasada bulunan PCR testleri. Ancak, tüm Salmonella insan ve hayvan popülasyonlarının prevalansı hastalığa neden yeteneklerini eşit. Salmonella LPS O-antijen ve flagellinH1 ve H2 antijenleri antijenik farklılıklar erken tanınması, bu antijenik farklılıklar üzerinde 2.500 serovars Salmonella farklılaşma yol açmıştır . Cinsi, Salmonella belirlenen 46 ayrı O antijenleri ve 86 ayrı flagellin (H) antijenleri vardır. Salmonella (H1) ya da iki farklı (H1, H2) flagellins sahip olabilir. O, H1, H2 antijenleri 2500 Salmonella serovars hesabı farklı bir birleşimi bugün kabul etti . Serovar belirlenmesi bireysel O ve H antijenleri elde edilen antijenik formül üzerinde olarak atanır. O antijenik formül olarak şöyle yazılabilir: H1: H2 ve burada &quot;-&quot; O-antijen için negatif Salmonella H1 veya H2 flagellin ve &quot;NT&quot; (tiplendirilemeyen) yokluğu anlamına gelir . Örneğin, bir S. serovar Typhimurium atanır 1,2 Enteritidis bir formülü D1 ile izole edilirken: i: enterica antijenik formül B ile izole g, m: -. Salmonella nüfusunun Bu nedenle PCR ile kolayca yararlanılabilir nükleotid düzeyde farklılıklar antijenik varyasyon dışa tezahürüdür. Biz belirlenmesi S. allelotyping PCR geliştirmek için belirli O ve H alleller ile ilişkili genetik farklılıkları tespit enterica serovars: Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium (3). Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B-H1: Salmonella serovar Enteritidis H2 antijenik formüller (D1:: g, m) doğru atama ve raporlama O ile ilişkili tüm alleller için test : r: 1,2) ve Typhimurium (B: i: 1,2). O aleli veya antijen, H1 g bulgu bilgisi olmadan, tek başına m allel mutlaka Salmonella Salmonella serovars olarak Enteritidis olarak izole tanımlamaz: Agona, California ve Montevideo, aynı zamanda bu aynı allel sahip. Allelotyping PCR başlangıçta ön plana Salmonella serovars belirtilen algılamak için tasarlanmış iken, bu test bir ek 19 serovars (Tablo 3) tanımlayabilirsiniz. Bizim allelotyping PCR aslında O ve H allel tespit etmek için tasarlanmıştır. Pratikte ise, bize değil, O-spesifik antiserumlar kullanılarak izole edilen Salmonella kültürleri ile çalışırken O allelotyping PCR performans, O-antijen slayt aglütinasyon testi ile tespit etmek için daha pratik ve uygun maliyetli hale gelmiştir. Ancak, laboratuvar (2) bir ekran veya Salmonella FTA kartları (6) teslim izole yazmak için bu PCR kullanıyorsa O allelotyping PCR yöntemi tavsiye ve numunelerin ilk ekran ile Salmonella-spesifik PCR (4 include .) Allelotyping PCR PCR veya biyokimyasal / antijen testleri Salmonella olarak tanımlanır sadece bu örnekleri sınırlayın. Bu makalede açıklanan protokol Idaho Teknoloji Rapidcycler, bir çok ısıtma bloğu thermocyclers daha kısa sürede reaksiyon hacmi ve çalışan reaksiyon şartları küçültün sağlayan bir sıcak hava PCR ile kullanım için optimize edilmiştir. Ayarlayarak astar konsantrasyonları; veya MgCl 2 konsantrasyonları ayarlayarak bir ısıtma bloğu PCR ile kullanmak için bu protokol uyarlamak için tavlama sıcaklıkları düşürülmesi / yükseltilmesi deneysel reaksiyon koşulları optimize gerekebilir. Örneğin, MJ Research PTC-200 PCR aşağıdaki gibi protokol uyum sağlamak zorunda kalıyor. Tablo 1&#39;de açıklanan aynı reaksiyon hacmi ile çalışma, çalışma stok concentrationof i astar set 2.5 mcM seyreltilir, tavlama sıcaklığı 55 ° C - 45 ° C ve inkübasyon denatürasyon kez, tavlama ve uzatma adımları düşürülmüştür i / g, m allelotyping PCR için 20 saniye kadar uzatılmış oldu. Yayınlanan protokoller de dahil olmak üzere herhangi bir PCR için başlangıç ​​yukarı ve optimizasyonu, uygun pozitif ve negatif kontroller gereklidir. Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B: r - Enteritidis (D1:: g, m) Biz özellikle Anatum (E1:: e, h 1,6), bilinen Salmonella serovars elde önermektedir. : 1,2), Montevideo (C1: g, m, s: 1,2,7) ve Typhimurium (B: i: 1,2) ve bir laboratuvar Escherichia coli K12 suşu (DH5α LE393, JM109, vb . sırasıyla bu makalede anlatılan allelotyping PCR testleri pozitif ve negatif kontrolleri gibi). Bu Salmonella serovars birkaç test edildiği allel bağlı olarak, pozitif veya negatif kontrol olarak hizmet verecek. Bazı önlemler ve kurallar Bu ve diğer herhangi bir teşhis PCR yaparken takip edilmesi gerekir. İlk olarak, fiziksel ayırmaşablon hazırlama, PCR set-up ve jel elektroforezi mümkün PCR carry-over, kirlenme ve yanlış pozitif hatalı raporlama önlenmesinde kritik önem taşımaktadır. Ayrıca, bu kontroller olarak ortaya çıkan sorunları belirlemek ve sonuçları (5) yorumlanmasına yardımcı olarak gerekli kontrollerin dahil herhangi bir rutin PCR gereklidir. En önemlisi, tutarlılık Amplikon boyutu Amplikon (PCR ürünü) algılama andestimation elektroforetik koşulları açısından, özellikle önemlidir. Bu noktayı açıklamak için, biz bilerek Şekil 1A amaçlanan daha önceki elektroforez askıya aldı. Moleküler ağırlık standartları (şerit 1 ve 13) ve pozitif kontrol (2 şeritli), yeterince doğru boyutları tahmin ya da küçük boyutlarda farklılıklar vardır (~ 50 bp) DNA parçalarının ayrılması gözlemlemek için ayrılmış değildir. Yeterli DNA parçalarının ayrılması, özellikle moleküler ağırlık standartları, pozitif Amplikon boyutu ve bazen herhangi bir PCR (5 günlük çalışma gözlenen non-spesifik amplikonlarının ayırt &quot;gerçek pozitif&quot; doğru tahmin bağlıdır esastır .) Örneğin, Şekil 1B, şeritli 7 (boyut olarak ~ 700 bp) non-spesifik bir Amplikon vardır. Boya ön agaroz jel yarı yolda noktada sadece elektroforez, çok erken kesilmeli olsaydı, 500 bp ve 700 bp DNA parçalarının arasında çok az bir farklılaşma var olacaktır. Bu nedenle, örnek şeritli 7 yanlışlıkla i ve g, m allel hem de olumlu bildirilmiştir olurdu. Son olarak, herhangi bir test ile ilgili sınırlamaları tanımak gerekir. 1,5, 1,6, 1,7 antijen kompleksi; e, n, x / e H2 1,2 ait alleller ince genetik farklılıkları ayırt etmek H1/H2 allelotyping PCR çeşitli ayrımcı güç yok? n, g, m allel Z15 antijen içeren karmaşık ve H1 G antijen kompleksi,. Bir ya da iki farklı epitoplar bu flagellar antijenleri bulunan amino asit değişiklikleri oluşturmaktadır. Bu nedenle bize flagellin gen sekansı (3), bu bazen tek bir baz çifti farklılıklar yararlanabilir primerler dizayn için zordu. Örneğin, Salmonella serovars Dublin (D1: g: p) ve Berta (D1: f, g, t:) primerler mallelotyping, g da PCR pozitif. Bradford (1,5: r B), Heidelberg (1,2 B: r), Lagos (: i 1,5 B) H2 allelotyping primerler Typhimurium (1,2: i B) ayırt edemez Glostrup&#39;dan ikinci Winneba (B: r: 1,6), ya da Remo (C2: z10: e, n, Z15) (B: ​​r: 1,7), ya da Hadar (e, n, x C2: z10). Bu serovars karşılaşma ihtimalini de beraberinde getirir: Lagos, Bradford, Winneba, Remo veya Glustrup uzak bir olasılık ve ya testler sınırlama veya başka bir doğrulayıcı test feragatname sağlayan gerektirir. Sonuç olarak, bu PCR tabanlı serotipleme hızla S. tanımlar enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium ve O, H1 ve H2 allel 19 ek serovars ile ilişkilidir. Bu testte serotipleme Salmonella geleneksel mikrobiyolojik yaklaşım hızlı, düşük maliyetli bir alternatif.

<table border="1"><tbody><tr><th> Malzeme Adı </th><th> Tip </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorum </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> Balıkçı </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Mikrofuge&#39;de tüpler </td><td> 1.5 ml kapasiteli </td><td> Balıkçı </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> 200 kanıtı </td><td> Balıkçı </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> Moleküler Biyoloji </td><td> Sigma </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak; PCR sadece) </td></tr><tr><td> 10 x PCR Buffer: </td><td> 20 mM MgCl 2 </td><td> Idaho Teknoloji </td><td></td><td> (Tampon BSA, Ficoll ve Tartrazin gelir) </td></tr><tr><td></td><td> 30 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR primerleri </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Taq DNA Polimeraz </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Kılcal pipetler </td><td> 10 ul hacmi </td><td> Idaho Teknoloji </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hızlı Cycler </td><td></td><td> Idaho Teknoloji </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Düşük EEO, Moleküler Biyoloji </td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> 50 X TAE Tampon veya 5X TBE Tampon </td><td></td><td> Balıkçı </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Etidyum bromür </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Yatay, dalgıç jel elektroforez jel kalıp odasına </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Güç kaynağı </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr><tr><td> Moleküler Imager Gel Doc Sistemi </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ya da herhangi bir karşılaştırılabilir tek bir kaynak) </td></tr></tbody></table> Tablo 4. Malzemeler

an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium

Bu cinse özgü Salmonella hedef genlerin belirlenmesi için mevcut ticari PCR testleri. Ancak, iki tür, altı alttür ve 2.500 &#39;in üzerinde farklı Salmonella serovars, ve tüm halk sağlığı için önemi eşit. Örneğin, S. bulma enterica alttür IIIa Arizona bir tablo yumurta katman çiftlikte S. izolasyonu ile karşılaştırıldığında önemsiz enterica alttür serovar Enteritidis, salmonelloz tablo yumurta tüketimi ile bağlantılı önde gelen nedenidir. Serovars antijenik lipopolisakkarid farklılıklar (LPS) (O antijen) ve flagellin (H1 ve H2 antijenleri) göre tespit edilir. Bu antijenik farklılıklar bu fenotip ile ilişkili genler ve gen allel çeşitliliğini dış görünüş. Multipleks PCR allelotyping geliştirilen dört ana S. arasında genetik farklılıkların tuşları enterica alttür I serovars kümes hayvanlarında bulunan ve ABD&#39;de önemli bir insan hastalığı ile ilişkili . PCR primer çiftleri, anahtar gen ya da belirli bir Salmonella serovar benzersiz ve bu gen ya da alleli için belirli bir büyüklüğe sahip bir Amplikon üretmek için tasarlanmış dizileri hedef alındı. Salmonella serovar özel LPS için PCR testi sonuçlarının kombinasyonu dayalı izole etmek için atanır ve flagellin allel gen. Bu makalede açıklanan multipleks PCR S. tespiti için özeldir enterica alttür I serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, ve Typhimurium. Burada Salmonella izole serovar belirlemek için multipleks PCR nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium at JoVE.com

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, ve Typhimurium hızlı tespiti için bir multipleks PCR açıklar. Belirli Salmonella serovars, belirli bir serovar O-antijen biyosentezi küme ve flagellin benzersiz genler ve dizileri bir multipleks PCR hedef tespit edilebilir. Serovar hedef allel ilgili özel, boyut amplikonlarının (PCR ürünü) görünümünü dayalı izole Salmonella sonra atanır.

Allelotyping belirlenmesi için bir PCR Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg ve Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

an-allelotyping-pcr-for-identifying-salmonella-enterica-serovars

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

21.6K Görüntüleme.  University of Georgia. Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, ve Typhimurium hızlı tespiti için bir multipleks PCR açıklar. Belirli Salmonella serovars, belirli bir serovar O-antijen biyosentezi küme ve flagellin benzersiz genler ve dizileri bir multipleks PCR hedef tespit edilebilir. Serovar hedef allel ilgili özel, boyut amplikonlarının (PCR ürünü) görünümünü dayalı izole Salmonella sonra atanır.