Este trabalho foi suportado pelo USDA Grants 1999-35212-8680, 2005-01378, e 2010-04288-01, Fundos USDA Formula eo Estado de Veterinária da Geórgia Grant Pesquisa Agrícola Medicina. O protocolo descrito no presente publicação foi elaborada para uso por alunos de graduação como parte de cursos de pesquisa dirigida: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L e 4960H Biol da Universidade da Geórgia e utilizados pelos alunos em vários projetos de pesquisa em epidemiologia molecular na Maurer laboratório. Queremos agradecer os muitos estudantes de graduação que realizaram pesquisas em laboratórios Maurer e Lee, e nosso chefe de departamento, John Glisson para apoiar os nossos esforços para integrar ensino de graduação com a pesquisa.

<ol>
	<li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica.">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 .</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg,+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles.">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. o. f. a. c. r. e., Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. a. u. r. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles.">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li><li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments.">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li><li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques.">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li><li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper.">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory. , (1989).</li><li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air.">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Comercialmente disponíveis os testes de PCR para a detecção de genes alvos Salmonella exclusivo para o gênero (ex. inva). No entanto, nem todos são iguais Salmonella em sua capacidade de causar doenças em seres humanos ou prevalência em populações animais. O reconhecimento precoce das diferenças antigênicas em Salmonella LPS O antígeno e flagellinH1 e antígenos H2 levou à diferenciação de Salmonella em mais de 2.500 sorotipos com base nessas diferenças antigênicas. Há 46 diferentes antígenos O e 86 distintas flagelina (H) antígenos identificados no gênero Salmonella. Salmonella pode possuir um (H1) ou dois diferentes (H1 e H2) flagellins. A combinação diferente de O, H1, H2 e conta antígenos para os sorovares Salmonella 2500 reconheceu hoje. A sorovar é atribuída com base na fórmula antigênica derivada da identificação do Ó individuais e antígenos H. A fórmula antigênica é escrito como O: H1: H2, e onde &quot;-&quot;, refere-se à ausência de H1 ou H2 flagelina e &quot;NT&quot; (não-tipáveis) para Salmonella negativo para o antígeno O-. Por exemplo, o sorovar Typhimurium é atribuído a um S. enterica isolar com a fórmula antigênica B: i: 1,2, enquanto Enteritidis é dado a um isolado com o D1 fórmula: g, m: -. Essa variação antigênica na população Salmonella é a manifestação exterior de diferenças no nível de nucleotídeos que podem, portanto, ser facilmente explorada por PCR. Nós identificamos as diferenças genéticas associadas com O alelos específicos e H para desenvolver um PCR para a identificação de S. allelotyping enterica sorotipos: Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium (3). A atribuição correta e comunicação de Salmonella sorovar requer testes para todos os alelos associados com O: H1: fórmulas antigênicas H2 para Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B : r: 1,2), e Typhimurium (B: i: 1,2). Sem o conhecimento de O alelo ou antígeno, a conclusão do g H1, m alelo por si só não significa necessariamente identificar a Salmonella Enteritidis como isolar como outros sorovares de Salmonella: Agona, Califórnia, e Montevidéu, também possuem este mesmo alelo. Enquanto a PCR allelotyping foi originalmente concebido para detectar a tona mencionado sorovares de Salmonella, este teste pode identificar um adicional de 19 sorovares (Tabela 3). Nosso allelotyping PCR foi originalmente concebido para detectar alelos S e H. Na prática, tornou-se mais prático e de custo eficaz para identificar a O antígeno pelo teste de aglutinação, utilizando anti-soros específicos O-, ao invés de executar o allelotyping O PCR quando se trabalha com culturas de Salmonella isoladas. No entanto, nós recomendamos o uso do allelotyping O PCR se o seu laboratório utiliza esta PCR como uma tela (2) ou para a digitação Salmonella isolados submetidos em FTA cards (6), e incluem uma PCR Salmonella específicas com a primeira tela de amostras (4 ). Limitar os PCRs allelotyping apenas aquelas amostras que são identificados como Salmonella pela PCR ou testes bioquímicos / antigênica. O protocolo descrito neste artigo foi otimizado para uso com a tecnologia Idaho Rapidcycler, um termociclador de ar quente que permite que um de reduzir volumes de reação e as condições de reação corre em menos tempo do que muitos termocicladores bloco de aquecimento. Para adaptar este protocolo para uso com um termociclador bloco de aquecimento pode exigir otimização das condições de reação empiricamente através da redução / elevando a temperatura do recozimento; ajustar as concentrações de primer; ou ajustar MgCl 2 concentrações. Por exemplo, tivemos de adaptar o protocolo para a Pesquisa MJ PTC-200 termociclador como se segue. Trabalhando com a mesma reação volumes descritos na Tabela 1, o estoque de trabalho concentrationof o conjunto de primers i foi diluído a 2,5 mM, a temperatura de recozimento foi reduzida de 55 ° C a 45 ° C, tempos e incubação na desnaturação, anelamento e extensão passos foi alongado para 20 s para o i / g, m allelotyping PCR. Tendo os controles apropriados positivos e negativos são essenciais para o arranque inicial para cima e otimização para qualquer PCR, incluindo protocolos publicados. Recomendamos a aquisição de sorovares de Salmonella conhecidos, especificamente Anatum (E1: e, h: 1,6), Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B: r : 1,2), Montevidéu (C1: g, m, s: 1,2,7) e Typhimurium (B: i: 1,2), e um laboratório de Escherichia coli K12 tensão (DH5α, LE393, JM109, etc ) como controles positivos e negativos, respectivamente, para os testes de PCR allelotyping descrito neste artigo. Vários desses sorovares Salmonella servirá como controle positivo ou negativo, dependendo de qual alelo é testada. Certas precauções e diretrizes precisam ser seguidas durante a realização deste e de qualquer outro meio de diagnóstico PCR. Primeiro, a separação físicamodelo de preparação, PCR set-up, e eletroforese em gel é fundamental na prevenção da PCR possibilidade de reporte de contaminação e geração de relatórios errôneos de falso-positivos. Além disso, a inclusão de controles adequados é necessário em qualquer PCR de rotina como esses controles identificar problemas que possam surgir e ajudar na interpretação dos resultados (5). Mais importante ainda, a consistência é essencial, especialmente no que diz respeito às condições eletroforéticas para amplicon andestimation detecção (PCR produto) de tamanho amplicon. Para ilustrar este ponto, nós propositadamente suspenso eletroforese anteriormente que o previsto na Figura 1A. Os padrões de peso molecular (faixas 1 e 13) e controle positivo (pista 2) não são suficientemente separadas para estimar com precisão tamanhos ou observar a separação de fragmentos de DNA onde existem pequenas diferenças (~ 50 pb) em tamanhos. Separação adequada dos fragmentos de DNA, especialmente os padrões de peso molecular, é essencial como relatórios positivos é dependente da estimativa precisa do tamanho do amplicon e distinguindo &quot;verdadeiro positivo&quot; de não-específica amplicons que às vezes são observadas no cotidiano de qualquer PCR (5 ). Por exemplo, há um amplicon não-específicas na Figura 1B, pista 7 (~ 700 pb de tamanho). Eletroforese tinha sido interrompido cedo demais, quando a frente de corante foi somente no ponto a meio caminho do gel de agarose, haveria pouca diferenciação entre 500 pb e 700 pb fragmentos de DNA. Portanto, a amostra na pista 7 teria sido erroneamente reportados como positivos para ambos os alelos i e g, m. Finalmente, é preciso reconhecer as limitações associadas a qualquer teste. Vários dos allelotyping H1/H2 PCR não tem o poder discriminatório para discernir sutis diferenças genéticas na alelos pertencentes à H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 complexo antígeno; e, n, x / e , n, z15 complexo antígeno ea H1 complexo antígeno-G, que inclui a g, m alelo. Uma ou duas mudanças de aminoácidos para a conta de epítopos presentes em diferentes esses antígenos flagelar. Foi, portanto, difícil para nós, para projetar primers que poderiam explorar essas diferenças de base, por vezes único par na seqüência do gene da flagelina (3). Por exemplo, Salmonella sorovares Dublin (D1: g, p: -) e Berta (D1: f, g, t: -) são também PCR positivos com o nosso g, mallelotyping primers. Os primers H2 allelotyping não pode distinguir Typhimurium (B: i: 1,2) de Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) de Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), ou Remo (B: r: 1,7), ou Hadar (C2: z10: e, n, x) de Glostrup (C2: z10: e, n, z15). Enquanto a probabilidade de encontrar alguns desses sorovares: Lagos, Bradford, Winneba, Remo ou Glustrup é remota, é uma possibilidade e requer o fornecimento de aviso sobre a limitação dos testes ou outro teste confirmatório. Em conclusão, este sorotipagem baseados em PCR identifica rapidamente S. enterica sorotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg e Typhimurium, e O, H1, H2 e alelos associados com 19 sorotipos adicionais. Este ensaio é uma resposta rápida, alternativa de baixo custo para abordagem microbiológica tradicional para Salmonella sorotipagem.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do material </th><th> Tipo </th><th> Companhia </th><th> Número Catálogo </th><th> Comentário </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> Pescador </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Tubos de microcentrífuga </td><td> 1,5 ml de capacidade </td><td> Pescador </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> 200 prova </td><td> Pescador </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> Grau Biologia Molecular </td><td> Sigma </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparáveis; PCR apenas) </td></tr><tr><td> 10 x PCR Buffer: </td><td> 20 mM MgCl 2 </td><td> Idaho Tecnologia </td><td></td><td> (Buffer vem com BSA, Ficoll e tartrazina) </td></tr><tr><td></td><td> 30 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Taq DNA polimerase </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Pipetas capilares </td><td> 10 mL de volume </td><td> Idaho Tecnologia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rápida Cycler </td><td></td><td> Idaho Tecnologia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> EEO baixa; Grau Biologia Molecular </td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> 50 X tampão TAE ou TBE 5X </td><td></td><td> Pescador </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Brometo de etídio </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Horizontal, câmara submersível de eletroforese em gel com o molde de gel </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Fonte de alimentação </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr><tr><td> Molecular Imager Gel Doc Sistema </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou qualquer outra fonte comparável) </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Materiais

an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium

Comercial atual testes PCR para identificação de genes-alvo Salmonella exclusivo para este gênero. No entanto, existem duas espécies, seis subespécies, e mais de 2.500 sorotipos de Salmonella diferentes, e nem todos são iguais em sua importância para a saúde pública. Por exemplo, encontrar S. enterica subespécie IIIa Arizona em uma fazenda camada tabela de ovos é insignificante comparado com o isolamento de S. enterica subespécie I serovar Enteritidis, a principal causa de salmonelose relacionados ao consumo de ovos de mesa. Sorovares são identificados com base nas diferenças antigênicas de lipopolissacarídeo (LPS) (antígeno O) e flagelina (H1 e H2 antígenos). Essas diferenças antigênicas são a aparência externa da diversidade de genes e alelos do gene associado a este fenótipo. Nós desenvolvemos um allelotyping, multiplex PCR que as chaves sobre as diferenças genéticas entre os quatro grandes S. sorovares enterica subespécie I encontrados em aves domésticas e associados com doenças humanas significativas em os EUA. Os pares de primers de PCR foram direcionados para os principais genes ou seqüências únicas para um sorotipo Salmonella específicas e destinadas a produzir um amplicon com tamanho específico para o gene ou alelo. Salmonella sorovar é atribuída a um isolado com base na combinação dos resultados dos testes de PCR para LPS específicas e alelos do gene flagelina. Os PCRs multiplex descritos neste artigo são específicos para a detecção de S. enterica subespécie I sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Aqui demonstramos como usar o PCRs multiplex para identificar serovar Salmonella para uma isolar.

Watch this Scientific Journal Video about An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium at JoVE.com

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Nós descrevemos um multiplex PCR para a detecção rápida de Salmonella enterica sorotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Sorovares de Salmonella específicos podem ser identificados por alvo um multiplex PCR para os genes e as seqüências exclusivas para o cluster biossíntese O antígeno-flagelina e de um sorovar dado. Sorovar é atribuída então a uma Salmonella isolar baseado na aparência de amplicons específicos, o tamanho (produto de PCR) correspondente ao alelo alvo.

Uma PCR Allelotyping para Identificar Salmonella enterica Sorovares Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

an-allelotyping-pcr-for-identifying-salmonella-enterica-serovars

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

21.6K visualizações.  University of Georgia. Nós descrevemos um multiplex PCR para a detecção rápida de Salmonella enterica sorotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Sorovares de Salmonella específicos podem ser identificados por alvo um multiplex PCR para os genes e as seqüências exclusivas para o cluster biossíntese O antígeno-flagelina e de um sorovar dado. Sorovar é atribuída então a uma Salmonella isolar baseado na aparência de amplicons específicos, o tamanho (produto de PCR) corre...