ومن شأن وضع بروتوكولات نقل أنواع الإيميريا أن يساعد على المضي قدما في دراسة الوظائف الجينية، وتطوير لقاحات جديدة، وفحص أهداف جديدة للأدوية في إيميريا. باستخدام هذه التقنية ، حققنا نقل العديد من أنواع الإيميرية ، والنوية هي أداة مفيدة لتسهيل تطبيق التلاعب الجيني في الطفيليات الإيميرية. يوفر النيوكلوفيction من إيميريا مرجعا لtransfefection الطفيليات الأخرى التي لا يمكن أن تكون مزرعت في المختبر ، وسوف تسريع دراسة التلاعب الجيني.
إذا حاولت هذه التقنية للمرة الأولى، يجب عليك إعداد جميع الكواشف وأدواتها جيدا قبل بدء transfection لتجنب التدافع أثناء التجربة. تحقيق هذه الطريقة يساعد الناس الذين يركزون على transfection من ايميريا لمعرفة التفاصيل المعقدة لهذه التجربة. لتبدأ مع إطلاق sporocysts، الطرد المركزي مرة واحدة 10 إلى بويضات sporulated السبعة في محلول ديكرومات البوتاسيوم في 2، 300 مرات ز لمدة خمس دقائق.
غسلها مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. Resuspend بيليه مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، ونقل الخليط إلى أنبوب 15 ملليلتر. إضافة حجم متساو من الخرز الزجاجي قطره ملليمتر واحد، وتتأرجح تعليق oocyst باستخدام خلاط دوامة للافراج عن sporocysts.
كل دقيقة، ورصد الإفراج عن sporocysts عن طريق المجهر. عندما يتم كسر أكثر من 90٪ من البويضات، والتوقف عن دوامة. نقل تعليق sporocyst إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر، والطرد المركزي في 1، 600 مرات ز لمدة خمس دقائق.
إعادة تعليق الترسبة مع ملليلتر واحد من 50٪ حل التدرج الكثافة, والطرد المركزي في 10,000 مرات ز لمدة دقيقة واحدة. لإطلاق sporozoites، resuspend الترسب مع العازلة excystation، واحتضان في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 40 إلى 60 دقيقة للافراج عن sporozoites. هز الأنابيب مرة واحدة كل خمس دقائق خلال excystation.
عندما يتم تحرير أكثر من 90٪ من sporozoites، ووقف في احتضان. جهاز طرد مركزي في 600 مرة ز لمدة 10 دقائق. Resuspend هطول الأمطار مع ملليلتر واحد من 55٪ حل التدرج الكثافة، والطرد المركزي الأنبوب في 10، 000 مرات ز لمدة دقيقة واحدة.
Resuspend هطول الأمطار مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، وعد sporozoites باستخدام مقياس الهيموسيت. لجمع الميروزويت من الجيل الثاني من necatrix Eimeria، وقطع الأمعاء الدجاج طوليا من ساق صفار إلى الفوهة الايلوسيكال، وغسلها مع برنامج تلفزيوني أو HBSS بلطف ثلاث مرات في طبق بيتري. قطع الأمعاء إلى قطع، ووضعها في قارورة مخروطية مع عازلة الهضم.
ضع القارورة على خلاط مغناطيسي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع شريط مثير لمدة 30 إلى 60 دقيقة لإطلاق المزيج. بعد 30 دقيقة من الحضانة، مراقبة الإفراج عن الميروزات عن طريق الفحص المجهري كل خمس دقائق. لتنقية الميروزايت، صب تعليق يحتوي على الميروزيت المهضمة على أربع طبقات من الشاش لتصفية في أنابيب 50 ملليلتر، والطرد المركزي الأنابيب في 600 مرة ز لمدة 10 دقائق.
بعد الطرد المركزي، تخلص من الماحشة التي تحتوي على حطام الأمعاء. نقل هطول الأمطار مع merozoites تنقية إلى أنابيب 1.5 ملليلتر. Resuspend هطول الأمطار مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، وعد merozoites باستخدام مقياس الهيموسيت.
أولاً، جهاز الطرد المركزي تعليق sporozoite أو merozoite في 600 مرة ز لمدة 10 دقائق. ثم تجاهل المُندفع. في الترتيب التالي، إضافة 85 ميكرولترات من العازلة النووية transfection، 10 ميكروغرام من plasmid، و 25 وحدة من إنزيم تقييد في أنبوب 1.5 ملليلتر التي تحتوي على sporozoites أو merozoites.
نقل الإيقاف إلى كوب نقل نووي. ضع الكأس في أخدود نقل نووي. قم بتشغيل جهاز النيوكلوفيكشن باستخدام زر الطاقة، وحدد إجراء U-033.
عند انتهاء البرنامج، اضغط على زر X للجهاز nucleofection، وتعرض الشاشة موافق، مما يشير إلى أن النيوكلوفيكتيون ناجحة. إضافة 0.5 إلى ملليلتر واحد من متوسطة النسر المعدلة في دولبيككو إلى كأس النيوكلوفيكشن لوقف التفاعل. بعد خلط بلطف، نقل تعليق إلى أنبوب 1.5 ملليلتر.
تلقيح الطفيليات النووية المصابة في الدجاج عمرها سبعة أيام. تلقيح merozoites من necatrix أو sporozoites من Eimeria tenella عبر طريق الكلواكال ، ولكن تلقيح Eimeria acervulina sporozoites عن طريق الحقن الوريدي. بعد جمع البويضات من البراز، استخدم فرز الخلايا المنشطة بالفلورسين و150 ملليغرام لكل كيلوغرام من البييميثامين لزيادة نسبة السكان المعدلة وراثياً.
وقد استخدم هذا البروتوكول لTransfect الطفيليات إيميريا. في هذه الدراسة، تظهر الميرونات من الجيل الثاني وميروزويت من necatrix Eimeria، وكذلك sporocysts وsporozoites من تينيلا إيميريا بعد استخدام حلول التدرج الكثافة. تشير صور البويضات من ايميريا نيكاتريكس بعد إصابتها بالنويات الميروزية المصابة وبويضات إيميريا تينيلا بعد إصابتها بـ sporozoites المصابة بالنيوكلية إلى النيوكلوفيت الناجح.
الشيء الأكثر أهمية في حين تحاول هذا الإجراء هو التأكد من تنقية sporozoites والمروزوايتس ناجحة واستخدام 50٪ حل التدرج كثافة لإزالة OS2 مع التأكد من sporocysts وsporozoites هي أكثر تنقية. بعد هذا الإجراء ، يمكنك تحسين هذا البروتوكول ، مثل بويضة البويضة أو sporocyst لتبسيط إجراءات نقل الطفيليات Eimeria في المستقبل. مع تطور عملية نقل الأمهات في إيميريا، فإن تقنية CRISPR-Cas9 في إيميريا ستكون من المتوقع أن تطرح بشكل كبير التلاعب الوراثي الحذر في إيميريا وأن يتم تطبيقها كمركبة مناسبة لتوصيل اللقاح.
