Questo lavoro è stato sostenuto dalla compagnia di assicurazione sulla vita &quot;Novalis-Taitbout&quot;, Ecole des Neurosciences de Paris (PEV), l&#39;Agence Nationale de la Recherche &quot;ANR-09-Neur-004&quot;, nella cornice di &quot;NEURON ERA-NET&quot; di 7 ° PQ dalla Commissione Europea, &quot;Fondazione pour la Recherche Medicale&quot;, la Fondazione Letten e la Fondazione Pasteur.

1. Stereotassica iniezioni <ol><li> Il virus usato in questi esperimenti è una replica con deficit di vettori lentivirali basati sul virus HIV per esprimere Channelrhodopsine2-YFP (gialla proteina fluorescente) fusione costruire guidata da un promotore sinapsina 6. Il plasmide è stato generosamente forniti da K. Deisseroth &#39;s di ricerca del gruppo ( <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html">http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html</a> ). Lentivirus possono essere ottenute da fonti commerciali o prodotti in laboratorio secondo i protocolli stabiliti 7. I titoli vettore media sono stati nell&#39;ordine di 10 10 unità di trasduzione / ml. Aliquote virali sono conservati a -80 ° C e deve essere scongelato poco prima del caricamento della pipetta. Molteplici cicli gelo / disgelo dovrebbe essere evitato. Mai esposizione la soluzione virus direttamente al ghiaccio secco. </li><li> Preparare pipette in vetro con vetro borosilicato capillari su standard estrattore pipetta (Sutter P-97 Pipetta estrattore). L&#39;impostazione della trazione dovrebbe essere correttamente calibrato per produrre una pipetta lunga e rigida. Quindi, tagliare la punta della pipetta con un paio di forbici per ottenere una punta di 30-40 micron di diametro. Conservare tirato pipette in una scatola di polvere. </li><li> Impostare il Nanoject II microinjector con le istruzioni del produttore per la consegna di 50 nL. Preparare la pipetta da iniezione di back-riempimento con olio minerale e inserirla per lo stantuffo microinjector. Attaccare il microinjector su un telaio stereotassico. Olio parzialmente vuote dalla pipetta di vetro prima di riempire con la soluzione antivirus </li><li> Con una micropipetta, trasferire 2 ml di soluzione di virus su un pezzo sterile di Parafilm. Abbassare delicatamente la pipetta di vetro nella goccia di soluzione di virus e riempire la pipetta con 1-2 microlitri. Assicurarsi che non vi siano bolle d&#39;aria nella pipetta. </li><li> Anestetizzare un mouse con 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xylazina, diluito in soluzione fisiologica sterile. Togliere i capelli dal cuoio capelluto delanimali con tagliaunghie roditore, rasoi, forbici, o depilitory agente chimico. Disinfettare il cuoio capelluto con tre applicazioni di alternare al 70% etanolo e Betadine. Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave e poi disinfettata con etanolo al 70%. Posto l&#39;animale nel telaio stereotassico con barre orecchio e naso bar, assicurando che la testa è sicuro. Applicare una pomata oculare per evitare l&#39;essiccazione delle cornee. </li><li> Con un bisturi, tagliare il cuoio capelluto da in mezzo agli occhi a tra le orecchie. Tirare la pelle da parte per esporre il cranio e la pelle ancora con un paio di pinze. Pulire la superficie del cranio. L&#39;apparato stereotassico viene azzerato con la punta della pipetta di vetro al bregma. Poi la punta è posizionata nel sito di iniezione (antero-posteriore, 3,30; medio-laterale, ± 0,82, per entrambi gli emisferi destro e sinistro, rispettivamente). La posizione della barra naso deve essere regolata in base al calcolo delle coordinate stereotassica. Nel nostro esperimento, il bar naso è regolata uino bregma e il sito di iniezione sono allineati alla stessa altezza. </li><li> Identificare il sito di iniezione. Utilizzando un trapano ad alta velocità chirurgica, accuratamente praticare dei fori nel cranio. Con un ago da siringa piegato agganciato alla punta, rimuovere i resti di ossa fino ad esporre la dura madre. Controllare che il foro sia centrato nella posizione corretta. Fare attenzione a non vasi sanguigni rottura sulla superficie del cervello durante la perforazione. Se i vasi sanguigni sono rotti, premere delicatamente sulla superficie del cervello con un cotton fioc di piccole dimensioni o tessuto per alcuni secondi fino a quando il flusso di sangue si ferma. </li><li> Abbassare la pipetta e zero il dorso-ventrale altezza quando la punta della pipetta tocca la superficie del cervello. Quindi, abbassare al corretto dorso-ventrale profondità (dorso-ventrale, 2,9 dalla superficie del cervello) e attendere 30 secondi per l&#39;equilibrio della pressione. Iniettare 4 volte 50 nl di virus per un totale di 200 nl. Attendere 30 secondi tra ogni iniezione. </li><li> Un minuto dopo l&#39;ultima iniezione, ritirare lentamente il tubotte. Ripetere 1,6-1,8 punti per l&#39;altro emisfero. Rimuovere l&#39;animale da un apparecchio stereotassico, pulire l&#39;incisione e cucire la pelle tagliata con filo chirurgico. Permettere agli animali di recuperare sul pad il riscaldamento prima di tornare in gabbia. Inoltre, gli animali può essere data una non-steroidei anti-infiammatori analgesico (ad esempio, Carprofen 4mg/kg) subito dopo e 3 giorni dopo l&#39;intervento. </li></ol> 2. Cronico impianto a LED per la stimolazione optogenetic vivo nel bulbo olfattivo <ol><li> Gli animali iniettati con particelle lentivirali bilateralmente sono accanto cronicamente impiantati con un LED blu in miniatura (Osram, LED blu CMS 4.6W). Saldare i pin LED per una femmina connettore elettrico in miniatura in modo che il connettore è posizionato sul lato opposto del LED. Controllare che non ci sia tagliato corto elettrico e di individuare il perno positivi e negativi sul connettore. Prova il LED collegandolo ad un regolatore di corrente per LED anche se un cavo adatto. </li><li> Per misurare e / o impostare il potere assoluto della luce del LED, montare il LED su un micromanipolatore e posizionare il LED in contatto diretto con il fotorilevatore di un misuratore di potenza di picco di intensità della luce a 470 nm. Praticare un foro di 3 mm di diametro in un bordo in PVC opaco. Apporre questo foro stenopeico al misuratore di potenza e costruire una curva standard di potenza ottica contro corrente di ingresso per il calcolo della potenza per mm 2. </li><li> Per misurare la propagazione della luce attraverso il cervello, tagliare i blocchi di tessuto cerebrale fresco di 300, 500, 1000, 1500 e 2500 micron di spessore 0-4 ° C ACSF utilizzando un vibratome 14. Posizionare un pezzo di cranio con una craniotomia identico a quello effettuato nei topi vivono sotto il LED. In primo luogo, misurare la potenza luminosa senza tessuto centrata su LED. Poi, luogo ogni blocco di tessuto tra i LED e il fotodetettore del misuratore di potenza, e misurare la potenza. Costruire una curva di spessore dei tessuti contro frazione di trasmissione relativa, calcolato come rapportotra la potenza misurata attraverso il tessuto e senza tessuto. </li><li> Anestetizzare un mouse con 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xylazina, diluito in soluzione fisiologica sterile. Pulire e disinfettare il LED con il 70% di etanolo. Togliere i capelli dal cuoio capelluto dell&#39;animale e disinfettare il cuoio capelluto con tre applicazioni di alternare al 70% etanolo e Betadine. Poi posto l&#39;animale nel frame stereotassico. Applicare una pomata oculare per evitare l&#39;essiccazione delle cornee. Collegare il connettore al titolare stereotassico. La posizione della barra di naso dovrebbe essere regolata fino a quando la superficie del cranio sopra il bulbo olfattivo è perfettamente orizzontale e parallelo alla superficie della miniatura LED. </li><li> Con un bisturi, tagliare il cuoio capelluto da 3 mm anteriore agli occhi a 3 mm posteriormente alle orecchie. Tirare la pelle da parte e ancorarlo con un paio di pinze. Raschiare le membrane sulla superficie del cranio con una lama di rasoio. Pulire e asciugare il cranio. Applicare una copertura sottile di collante cianoacrilato per consentire ad successivehesion di acrilico dentale. </li><li> Utilizzando un trapano ad alta velocità chirurgico, eseguire una craniotomia rettangolare (1 mm e 3 mm caudale laterale; centrata sulla caudale millimetri 5,1, 0 mm laterale da bregma) il bulbo olfattivo. Per fare questo, con attenzione sottile il cranio fino a solo un sottile strato di resti ossei. Rimuovere con cautela l&#39;osso residuo, con l&#39;aiuto di un ago della siringa piegato. Particolare cura deve essere adottate per evitare la puntura della dura madre e la rottura dei vasi sanguigni principali che si trovano tra i due emisferi e nel bordo caudale dei bulbi olfattivi. L&#39;accumulo e la coagulazione del sangue sulla superficie del cervello impedisce la penetrazione della luce ottimale nel tessuto. Sciacquare la craniotomia e la superficie del cervello con soluzione salina sterile e poi asciugare il cranio. </li><li> Fissare la miniatura LED al connettore. Abbassare la miniatura LED sulla parte superiore dei bulbi olfattivi. L&#39;asse principale della miniatura LED dovrebbe essere parallela alla rostrale-caudale asse del mouse, pulito con soluzione salina sterile e dry del cranio. Quindi fissare il LED al cranio con un primo strato di acrilico (cioè, cemento policarbossilato), seguita da un secondo strato di acrilico dentale. L&#39;aggiunta di due piccole viti possono essere necessari per risolvere il LED. Le viti devono essere inserite sul cranio (posteriore nella posizione a LED) e coperto con entrambe acrilici. Mentre l&#39;acrilico è ancora liquido, tirare indietro e colla i bordi liberi del cuoio capelluto sulla superficie della acrilico dentale. Fate attenzione a non applicare alcuna acrilico sul connettore. Dopo l&#39;acrilico è indurito, rimuovere l&#39;animale da un apparecchio stereotassico e farlo recuperare su un blocco del riscaldamento prima di tornare in gabbia. Gli animali sono rimasti isolati nella loro gabbia per recuperare da un intervento chirurgico per almeno sette giorni. Inoltre, gli animali può essere data una non-steroidei anti-infiammatori analgesico (ad esempio, Carprofen 4mg/kg) subito dopo e 3 giorni dopo l&#39;intervento. I LED dovrebbero essere testati prima dell&#39;impianto e dopo il termine degli esperimenti. </li><li> Una luce eletcal cavo è usato per legare l&#39;animale ad un regolatore di corrente per LED accoppiato ad un generatore di impulsi (Master-8) di controllare i tempi e l&#39;intensità dei LED. Il cavo sottile consente la completa libertà di movimento. Fare attenzione a rispettare la polarità del connettore. Invertendo la polarità può rompere il LED. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: ChR2-YFP è espresso in trasdotte neuroni circa 48 ore dopo l&#39;iniezione, e rimane stabile per diversi mesi 7. La figura 1 è un quadro rappresentativo di una sezione sagittale del paraformaldeide-fisso animali 15 giorni dopo l&#39;iniezione. Si noti l&#39;etichettatura denso e le dimensioni del sito di iniezione in RMS. Un gran numero di cellule neonato sono migrate lungo la RMS a colonizzare i vari strati del bulbo olfattivo (Fig. 1). La proteina di fusione è espresso in tutti i comparti neurone, tra cui il soma, dendriti e spine. In miniatura LED impla<html> ntation permette di grandi dimensioni e poco costoso stimolazione ottica di una vasta regione di interesse. L&#39;animale è legato al controller LED con un cavo della luce elettrica che permette una completa libertà di movimento. Caratterizzando la diffusione della luce nel tessuto cerebrale e la soglia di attivazione ChR2, stimiamo che l&#39;attivazione ottico potrebbe essere innescato ad una profondità di circa due millimetri sotto la superficie del LED (Fig. 2A). Per monitorare l&#39;attivazione funzionale di ChR2-esprimere i neuroni in vivo, l&#39;espressione del c-fos, un marker di attività neuronale, possono essere analizzati dopo stimolazione luminosa ripetitiva (Fig. 2B). In alternativa, nelle registrazioni elettrofisiologiche in vitro di neuroni che esprimono ChR2 accoppiato a stimolazione luminosa focale può essere effettuata 14. Infine, a due fotoni mirati loose-patch registrazioni sono state utilizzate per studiare l&#39;attivazione funzionale di ChR2-esprimere i neuroni corticali da miniatura simili a LED in vivo 9. ntent &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig1.jpg" /> Figura 1. ChR2-YFP espressione da iniezione lentivirale nel flusso migratorio rostrale. Immagini confocale rappresentante di una sezione sagittale del bulbo olfattivo di un topo 15 giorni dopo iniezioni di un lentivirus nel rostrale RMS. Si noti la presenza di neuroni sparsi YFP neonato migrazione da fine del RMS per i diversi strati della OB. La maggior parte delle cellule neonato (95%) sono le cellule dei granuli, che si trovano soma nello strato cellulare granuli (GCL) e dendriti arborize nello strato esterno plessiformi (EPL). Una piccola popolazione di neuroni neonati migrare fino allo strato più superficiale della OB, nel livello glomerulare (GL). Scala grafica, 100μm. Incasso, ad alto ingrandimento di una cellula granulo neonato, mostrando l&#39;espressione di membrana ChR2-YFP nella dendriti e in spine. Scala grafica, 20μm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig2.jpg" /&gt; Figura 2. Schema di impianto a LED sulla parte superiore del bulbo olfattivo e la luce-evocati c-fos espressione ChR2-YFP cellule che esprimono nuovi granuli. A Schema del LED impiantato al di sopra del bulbo olfattivo. B, Rappresentante immagini confocale mostrano doppio etichettati ChR2-YFP + c-fos granuli + un&#39;ora dopo stimolazione luminosa del bulbo olfattivo. C-fos espressione è rivelato con un anti-c-fos anticorpo primario di coniglio (Calbiochem, 1:5000) e A568-anti-coniglio coniugato anticorpo secondario (Invitrogen, 1:1000). Scala grafica, 10μm.

<ol>
	<li>Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Alonso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+astrocytes+from+the+rostral+migratory+stream+into+neurons:+a+role+for+the+olfactory+sensory+organ.">Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ.</a> J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).</li><li>Mouret, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+survival+of+newly+generated+neurons:+when+time+matters.">Learning and survival of newly generated neurons: when time matters.</a> J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).</li><li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How,+when,+and+where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb.">How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).</li><li>Haubensak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+an+amygdala+microcircuit+that+gates+conditioned+fear.">Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear.</a> Nature. 468, 270-276 (2010).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+Production.">Lentivirus Production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature protocols. 5, 247-254 (2010).</li><li>Huber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+optical+microstimulation+in+barrel+cortex+drives+learned+behaviour+in+freely+moving+mice.">Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice.</a> Nature. 451, 61-64 (2010).</li><li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+light-induced+activation+of+neural+circuitry+in+transgenic+mice+expressing+channelrhodopsin-2.">In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 .</li><li>Albeanu, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED+arrays+as+cost+effective+and+efficient+light+sources+for+widefield+microscopy.">LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy.</a> PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).</li><li>Slotnick, B., Bodyak, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+Discrimination+and+Odor+Quality+Perception+in+Rats+with+Disruption+of+Connections+between+the+Olfactory+Epithelium+and+Olfactory+Bulbs.">Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs.</a> J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Affordable+LED+Arrays+for+Photo-Stimulation+of+Neurons.">Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons.</a> J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Strumenti Optogenetic hanno recentemente aumentato il nostro controllo sulle popolazioni di neuroni selettivi, tra cui i neuroni adulti nati nel sistema olfattivo. Qui si descrivono come eseguire una iniezione stereotassica di un vettore lentivirus che esprimono ChR2-YFP in una specifica popolazione di adulti nati neuroni. Con un attento monitoraggio del periodo post-iniezione, siamo in grado di analizzare e manipolare l&#39;attività di una coorte di adulti nati i neuroni con un età relativa omogenea. <p class="jo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiale </td><td> Azienda </td><td> Catalogo N. </td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Merial </td><td> Imalgène 1000 </td></tr><tr><td> Xylazina </td><td> Bayer Health Care </td><td> Rompum 0,2% </td></tr><tr><td> Pipetta Puller </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> Capillari di vetro (3,5 &quot;) </td><td> Drummond scientifico </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Nanoject II Microinjector </td><td> Drummond scientifico </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Trapano ad alta chirurgia </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 18000-17 </td></tr><tr><td> Micro Drill acciaio Frese punta 0,7 millimetri di diametro </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 19008-07 </td></tr><tr><td> CMS LED blu 4,6 W </td><td> OSRAM </td><td> LBW5SN </td></tr><tr><td> Femmina connettore elettrico (2,54 mm) </td><td> Fischer Elektronik </td><td> BL5.36Z </td></tr><tr><td> Regolatore di corrente per LED (max: 1A) </td><td> A1W Electronik </td><td> HKO-KL50-1000 </td></tr><tr><td> Generatore di impulsi </td><td> AMPI </td><td> Maestro-8 </td></tr><tr><td> Misuratore di potenza ottica </td><td> Thor Labs </td><td> PM100 </td></tr><tr><td> Cianoacrilato </td><td> Loctite </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Policarbossilato cemento (cemento primo strato) </td><td> Septodont </td><td> Selfast (# 0068Q) </td></tr><tr><td> Metacrilato di cemento (cemento secondo strato) </td><td> GC InternationalCorp. </td><td> Unifast Trad - liquidi (# 339292) Unifast Trad - Polvere (# 339114) </td></tr><tr><td> Carprofene </td><td> Pfizer </td><td> Rimadyl </td></tr></tbody></table>

selective viral transduction of adult-born olfactory neurons for chronic in vivo optogenetic stimulation

Interneuroni locali sono continuamente rigenerati nel bulbo olfattivo di roditori adulti 1-3. In questo processo, chiamato neurogenesi adulta, le cellule staminali neurali nelle pareti del ventricolo laterale danno luogo a neuroblasti che migrano per diversi millimetri lungo il flusso migratorio rostrale (RMS) per raggiungere e incorporare nel bulbo olfattivo. Per studiare le diverse fasi e l&#39;impatto di adulti nati integrazione dei neuroni preesistenti in circuiti olfattiva, è necessario etichettare in modo selettivo e manipolare l&#39;attività di questa specifica popolazione di neuroni. Il recente sviluppo delle tecnologie optogenetic offre l&#39;opportunità di usare la luce per attivare appunto questo gruppo specifico di neuroni senza intaccare i neuroni circostanti 4,5. Qui vi presentiamo una serie di procedure per viralmente esprimere Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP in una coorte temporalmente ristretto di neuroblasti in RMS prima di raggiungere il bulbo olfattivo e diventare adulto-nato neurons. Inoltre, ci mostrano come impianto e calibrare una miniatura a LED per la stimolazione cronica in vivo di ChR2-esprimere i neuroni.

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Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

I neuroni adulti, nato del bulbo olfattivo può essere controllato tramite optogenetically Channelrhodopsin2 che esprimono iniezione lentivirali nel flusso migratorio rostrale e fotostimolazione cronica con una miniatura impiantato LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

selective-viral-transduction-adult-born-olfactory-neurons-for-chronic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

15.4K Views.  Institut Pasteur and Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). I neuroni adulti, nato del bulbo olfattivo può essere controllato tramite optogenetically Channelrhodopsin2 che esprimono iniezione lentivirali nel flusso migratorio rostrale e fotostimolazione cronica con una miniatura impiantato LED.

Video: Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

Studiare l&#39;integrazione degli adulti nati Neuroni

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Ricerca

Neuroscienze

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Fibra ottica Impianto per la Stimolazione Optogenetic cronica del tessuto cerebrale

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Stimolazione optogenetic del nervo uditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...