עבודה זו נתמכה על ידי חברת ביטוח החיים &quot;Novalis-Taitbout&quot;, Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), את Agence Nationale de la משוכלל ונדיר &quot;ANR-09-NEUR-004&quot; במסגרת של &quot;נוירון ERA-NET&quot; של FP7 התוכנית על ידי הנציבות האירופית, &quot;קרן לשפוך la משוכלל ונדיר Medicale&quot;, קרן Letten וקרן פסטר.

1. Stereotaxic זריקות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הווירוס השתמשו בניסויים אלו הוא וקטור שכפול מחסר lentiviral מבוסס על נגיף ה-HIV להביע Channelrhodopsine2-YFP (חלבון פלואורסצנטי צהוב) היתוך לבנות מונע על ידי מקדם synapsin 6. הפלסמיד נמסר בנדיבות על ידי ק Deisseroth של קבוצת המחקר ( <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html">http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html</a> ). Lentiviruses ניתן להשיג ממקורות מסחריים או המיוצר במעבדה על פי פרוטוקולים הוקמה 7. Titers ממוצע וקטור היו בסדר גודל של 10 10 יחידות התמרה / ml. Aliquots ויראלי מאוחסנים ב -80 ° C ויש מופשר רק לפני טעינת פיפטה. ריבוי להקפיא / להפשיר מחזורים יש להימנע. לעולם החשיפה וירוס הפתרון ישירות קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן pipettes זכוכית באמצעות בורוסיליקט זכוכית נימים על תקן פיפטה חולץ (סאטר Pחולץ -97 פיפטה). הגדרת משיכת צריך להיות מכויל כראוי להניב פיפטה ארוך ונוקשה. בשלב הבא, לחתוך את קצה פיפטה בעזרת זוג מספריים כדי לקבל טיפ של 30-40 מיקרומטר קוטר. חנות משך pipettes בקופסה אבק חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההתקנה השנייה Nanoject microinjector עם הוראות היצרן עבור משלוח של 50 NL. הכן את פיפטה הזרקת ידי גב עם מילוי שמן מינרלי הכנס אותו על הבוכנה microinjector. צרף את microinjector למסגרת stereotaxic. שמן ריק חלקית מן פיפטה הזכוכית לפני מילוי עם פתרון וירוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם micropipette, להעביר 2 μl של פתרון וירוס על גבי פיסת סטרילית של Parafilm. בעדינות להוריד את פיפטה זכוכית לתוך ירידה של פתרון וירוס ולמלא את פיפטה עם μl 1-2. ודא שאין בועות אוויר בתוך פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר עם קטמין מ&quot;ג / ק&quot;ג 100 ו 10 מ&quot;ג / ק&quot;ג Xylazine, בדילול מלא מלוחים סטרילית. הסר את השיער מהקרקפת שלבעלי חיים באמצעות קוצץ מכרסם, גילוח, מספריים, או depilitory סוכן כימיים. לחטא את הקרקפת עם שלושה יישומים לסירוגין 70% אתנול ו בבטאדין. כל מכשירי ניתוח צריך להיות גם autoclaved וחיטוי מכן עם 70% אתנול. מניחים את חיה בתוך מסגרת stereotaxic במוטות האוזן בר האף, והבטיח כי הראש הוא מאובטח. החל משחה העין כדי למנוע התייבשות של הקרניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אזמל, לחתוך את הקרקפת מ בין העיניים אל בין האוזניים. משוך את העור בצד לחשוף את הגולגולת לעגן את העור עם זוג מלחציים. נקו את פני השטח של הגולגולת. מנגנון stereotaxic הוא התביית עם קצה פיפטה זכוכית גבחת. אז הטיפ ממוקמת במקום ההזרקה (Antero-Posterior, 3.30; מדיו-Lateral, ± 0.82, עבור שני חצאי ימין ועל שמאל, בהתאמה). המיקום של הבר האף צריך להיות מותאם על פי חישוב הקואורדינטות stereotaxic. בניסוי שלנו, בר האף מותאם until גבחת ואתר הזרקת מיושרות באותו גובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את ההזרקה. באמצעות מקדחה במהירות גבוהה כירורגי, בזהירות לקדוח חורים לתוך הגולגולת. עם מחט מזרק כפוף המעוקל בקצהו, להסיר שאריות של עצמות דק לחשוף את דורה מאטר. בדוק את החור מרוכז במיקום הנכון. הקפד לא כלי הדם הקרע על פני השטח של המוח בזמן הקידוח. אם כלי הדם הם מקרע, לחצו בעדינות על פני השטח של המוח עם ניצן כותנה רקמה קטנה או למשך מספר שניות עד זרימת הדם נפסקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את פיפטה ואפס את גובה הגחון Dorso, כאשר קצה פיפטה נוגע פני השטח של המוח. ואז, נמוך יותר לעומק הנכון Dorso-הגחון (Dorso-הגחון, 2.9 ממשטח המוח) ולחכות 30 שניות על שיווי משקל הלחץ. להזריק 4 פעמים 50 nl של וירוס עבור סכום כולל של 200 nl. המתן 30 שניות בין כל הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דקה אחת לאחר הזריקה האחרונה, לאט למשוך את הצינורTTE. חזור על 1.6-1.8 נקודות עבור חצי הכדור השני. הסר את החיה מן המנגנון stereotaxic, לנקות את החתך תפר לחתוך את העור באמצעות ניתוח האשכולות. אפשר החיה להתאושש על כרית חימום לפני החזרה לכלוב. בנוסף, חיות אפשר לתת סטרואידיות נוגדות דלקת משכך כאבים (למשל, Carprofen 4mg/kg) מיד לאחר ו 3 ימים לאחר הניתוח. </li></ol> 2. ההשתלה LED כרונית שכן גירוי optogenetic vivo ב הנורה חוש הריח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים הזריקו חלקיקים lentiviral בילטרלי הבא הם מושתלים כרוני עם LED כחול מיניאטורי (Osram, CMS 4.6W LED כחול). הלחמה הפינים LED למחבר נקבה חשמלי מיניאטורי כך מחבר ממוקם בצד השני של ה-LED. בדוק כי אין לקצר חשמלי לזהות את הסיכה חיוביות ושליליות על המחבר. מבחן ה-LED על ידי חיבורו בקר הנוכחית LED כי כבל מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד ו / או להגדיר את כוח האור המוחלט של ה-LED, הר LED על micromanipulator לבין עמדת LED במגע ישיר עם photodetector של מד הכוח של עוצמת אור לשיא של 470 ננומטר. מקדחה חריר בקוטר של 3 מ&quot;מ לוח PVC אטום. להטביע זה חריר למונה החשמל לבנות עקומת תקן של כוח אופטי לעומת קלט הנוכחי כדי לחשב את כוח לכל מ&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את התפשטות האור דרך המוח, לחתוך בלוקים של רקמת המוח הטרי של 300, 500, 1000, 1500 ו 2500 עובי מיקרומטר 0-4 מעלות צלזיוס ACSF באמצעות 14 vibratome. מניחים פיסת הגולגולת עם craniotomy זהה לזה שבוצע בעכברים לחיות תחת ה-LED. ראשית, למדוד את כוח האור בלי רקמות התרכזו LED. ואז, במקום כל בלוק של רקמות בין LED לבין photodetector של מד כוח, למדוד את הכוח. בנה עקומה של עובי רקמת לעומת חלק יחסי הילוכים, מחושב כיחס ביןבין הכוח נמדד דרך רקמות וללא רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר עם קטמין מ&quot;ג / ק&quot;ג 100 ו 10 מ&quot;ג / ק&quot;ג Xylazine, בדילול מלא מלוחים סטרילית. לנקות ולחטא ה-LED עם אתנול 70%. הסר את השיער מהקרקפת של החיה ולחטא את הקרקפת עם שלושה יישומים לסירוגין אתנול 70% ו בבטאדין. אז במקום חיה בתוך מסגרת stereotaxic. החל משחה העין כדי למנוע התייבשות של הקרניות. חבר את מחבר בעל stereotaxic. המיקום של הבר האף צריך להיות מותאם עד פני השטח של הגולגולת מעל הנורה חוש הריח הוא אופקי לחלוטין מקביל פני השטח של מיניאטורית ה-LED. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אזמל, לחתוך את הקרקפת של 3 מ&quot;מ קדמי על העיניים 3 מ&quot;מ האחורי של האוזניים. משוך את העור בצד לעגן אותה עם זוג מלחציים. לגרד ממנו את הקרומים על פני השטח של הגולגולת באמצעות סכין גילוח. נקי ויבש את הגולגולת. החלת כיסוי דקה של דבק cyanoacrylate לאפשר מודעות עוקבותhesion של אקריליק שיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מקדחה במהירות גבוהה כירורגי, לבצע craniotomy מלבני (1 מ&quot;מ הזנב ו 3 מ&quot;מ לרוחב, התרכזו 5.1 מ&quot;מ הזנב, 0 מ&quot;מ לרוחב מן גבחת) על נורות חוש הריח. כדי לעשות זאת, דק בזהירות את הגולגולת עד שרק שכבה דקה של עצם נשאר. מוציאים בזהירות את העצם הנותר בעזרת מחט מזרק כפופות. טיפול מיוחד צריך לקחת כדי למנוע ניקוב העניין הדורה ו פקיעת כלי הדם העיקריים העומדים בין שתי ההמיספרות ועל הגבול הזנב של נורות חוש הריח. הצטברות דם קרישה על פני המוח מונע חדירת אור אופטימלי לרקמת. שוטפים את craniotomy ואת פני השטח של המוח עם תמיסת מלח סטרילית ולאחר מכן לייבש את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את מיניאטורי LED למחבר. מנמיכים את מיניאטורי LED בחלק העליון של הנורות חוש הריח. הציר המרכזי של ה-LED זעירות צריך להיות מקביל לציר מקורי, הזנב של העכבר, נקו עם מי מלח סטרילית דר&quot;י גולגולת. ואז להבטיח את LED לגולגולת בשכבה הראשונה של אקריליק (מלט כלומר, polycarboxylate), ואחריו שכבה שנייה של אקריליק שיניים. התוספת של שני ברגים קטנים עשויים להידרש לתקן את LED. ברגים צריך להיות מוכנס על הגולגולת (האחורי לעמדת LED) ומכוסים אקריליק שניהם. בעוד אקריליק עדיין נוזלי, משוך לאחור דבק את הקצוות חינם של הקרקפת על פני השטח של אקריליק שיניים. הקפד לא חלים כל אקריליק על המחבר. לאחר אקרילי יש מוקשה, להסיר את החיה מן המנגנון stereotaxic ולתת לו להתאושש על כרית חימום לפני החזרה לכלוב. בעלי חיים נותרים מבודדים בתוך הכלוב שלהם להתאושש מהניתוח לפחות שבעה ימים. בנוסף, חיות אפשר לתת סטרואידיות נוגדות דלקת משכך כאבים (למשל, Carprofen 4mg/kg) מיד לאחר ו 3 ימים לאחר הניתוח. נוריות יש לבדוק לפני ההשתלה לאחר סיום הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אור electrical כבל משמש לקשור את בעל החיים בקר הנוכחית LED מצמידים את הגנרטור דופק (Master-8) כדי לשלוט על התזמון והעוצמה של ה-LED. כבל דק מאפשר חופש מוחלט של תנועה. תשמרי לכבד את הקוטביות של המחבר. היפוך קוטביות עשוי לשבור את LED. </li></ol> 3. נציג תוצאות: ChR2-YFP מתבטא transduced נוירונים כ 48 שעות לאחר ההזרקה, ונשאר יציב במשך מספר חודשים 7. איור 1 הוא תמונה מייצגת של קטע sagittal של חיה paraformaldehyde-קבוע של 15 ימים לאחר ההזרקה. שים לב תיוג צפוף בגודל של הזריקה ב-RMS. מספר גדול של תאים שזה עתה נולד היגרו לאורך RMS ליישב את השכבות השונות של הנורה חוש הריח (איור 1). החלבון היתוך מתבטא כל נוירון תאים, כולל סומה, דנדריטים, ואת עמוד השדרה. מיניאטורות LED impla<html> ntation מאפשר בקנה מידה גדול גירוי אופטי זול של אזור רחב של עניין. בעל חיים הוא קשור בקר ה-LED עם כבל חשמל אור המאפשר חופש מוחלט של תנועה. על ידי אפיון דיפוזיה אור רקמת המוח ואת סף של הפעלת ChR2, אנו מעריכים כי הפעלת אופטי יכול להיות מופעלות בעומק של ~ 2 מ&quot;מ מתחת לפני השטח של ה-LED (איור 2A). כדי לפקח על הפעלת תפקודית של ChR2-in vivo להביע עצב, ביטוי של c-פוס, סמן של הפעילות העצבית, ניתן לנתח לאחר גירוי אור חוזר (איור 2 ב). כחלופה, בהקלטות חוץ גופית של אלקטרו ChR2-לבטא נוירונים מצמידים את גירוי האור מוקד יכול להתבצע 14. לבסוף, שני הפוטונים ממוקד רופף, תיקון הקלטות שימשו במחקר הפעלה תפקודית של ChR2-לבטא נוירונים בקליפת המוח על ידי מיניאטורי דומה LED in vivo 9. ntent &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig1.jpg" /> באיור 1. ChR2-YFP ביטוי מן lentiviral הזרקה לתוך זרם נודדות מקורי. תמונות confocal נציג קטעים saggital של הנורה חוש הריח של העכבר 15 ימים לאחר זריקות של lentivirus ב RMS מקורי. הערה נוכחות מפוזרים נוירונים היילוד YFP נודדות מקצה ה-RMS של שכבות שונות של OB. רוב התאים היילוד (95%) הם תאים גרגיר, אשר שקר סומה בשכבת גרעין התא (GCL) ו דנדריטים arborize בשכבת Plexiform חיצוני (EPL). אוכלוסייה קטנה של נוירונים היילוד להעביר עד השכבה השטחית ביותר של OB, על שכבת גלומרולרי (GL). סרגל קנה מידה, 100μm. הגדלה הבלעה, גבוה של תא גרגר היילוד, מראה את הביטוי של קרום ChR2-YFP ב הדנדריטים וגם קוצים. סרגל קנה מידה, 20μm. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig2.jpg" /&gt; באיור 2. תרשים של מושתל LED בחלק העליון של הנורה חוש הריח ואת אור עורר c-Fos ביטוי ChR2-YFP להביע תאים גרעין חדש. ציור סכמטי של ה-LED מושתל מעל נורות חוש הריח. B, תמונות confocal נציג מראה פעמיים שכותרתו ChR2-YFP + c-Fos + תאים גרגיר כשעה לאחר גירוי האור של הנורה חוש הריח. C-Fos הביטוי מתגלה באמצעות אנטי c-Fos ארנבת הנוגדן הראשוני (Calbiochem, 1:5000) ו-A568 מצומדות נגד ארנב נוגדנים משני (Invitrogen, 1:1000). סרגל קנה מידה, 10μm.

<ol>
	<li>Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Alonso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+astrocytes+from+the+rostral+migratory+stream+into+neurons:+a+role+for+the+olfactory+sensory+organ.">Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ.</a> J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).</li><li>Mouret, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+survival+of+newly+generated+neurons:+when+time+matters.">Learning and survival of newly generated neurons: when time matters.</a> J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).</li><li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How,+when,+and+where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb.">How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).</li><li>Haubensak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+an+amygdala+microcircuit+that+gates+conditioned+fear.">Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear.</a> Nature. 468, 270-276 (2010).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+Production.">Lentivirus Production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature protocols. 5, 247-254 (2010).</li><li>Huber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+optical+microstimulation+in+barrel+cortex+drives+learned+behaviour+in+freely+moving+mice.">Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice.</a> Nature. 451, 61-64 (2010).</li><li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+light-induced+activation+of+neural+circuitry+in+transgenic+mice+expressing+channelrhodopsin-2.">In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 .</li><li>Albeanu, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED+arrays+as+cost+effective+and+efficient+light+sources+for+widefield+microscopy.">LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy.</a> PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).</li><li>Slotnick, B., Bodyak, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+Discrimination+and+Odor+Quality+Perception+in+Rats+with+Disruption+of+Connections+between+the+Olfactory+Epithelium+and+Olfactory+Bulbs.">Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs.</a> J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Affordable+LED+Arrays+for+Photo-Stimulation+of+Neurons.">Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons.</a> J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כלים Optogenetic הגדילו לאחרונה השליטה שלנו באוכלוסיות עצביות סלקטיבית, כולל נוירונים נולד מבוגר במערכת ההרחה. כאן אנו מתארים כיצד לבצע הזרקה stereotaxic של וקטור lentiviral להביע ChR2-YFP באוכלוסייה ספציפית של מבוגר יליד נוירונים. על ידי בקפידה ניטור בתקופה שלאחר הזריקה, אנו מסוגלים ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> קטמין </td><td> Merial </td><td> Imalgène 1000 </td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Bayer בריאות </td><td> Rompum 0.2% </td></tr><tr><td> פיפטה פולר </td><td> סאטר </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> זכוכית נימים (3.5 &quot;) </td><td> דראמונד מדעי </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Nanoject II Microinjector </td><td> דראמונד מדעי </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> מהירות גבוהה מקדח כירורגי </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 18000-17 </td></tr><tr><td> פלדה מיקרו מקדחה קוצים 0.7mm קוטר קצה </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 19008-07 </td></tr><tr><td> LED כחול CMS 4.6 W </td><td> OSRAM </td><td> LBW5SN </td></tr><tr><td> מחבר חשמל נקבה (2.54 מ&quot;מ) </td><td> פישר Elektronik </td><td> BL5.36Z </td></tr><tr><td> בקר מקומי עבור LED (מקסימום: 1A) </td><td> A1W Electronik </td><td> HKO-KL50-1000 </td></tr><tr><td> דופק גנרטור </td><td> AMPI </td><td> Master-8 </td></tr><tr><td> כוח אופטי מטר </td><td> Thor Labs </td><td> PM100 </td></tr><tr><td> Cyanoacrylate דבק </td><td> Loctite </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Polycarboxylate מלט (צמנט השכבה הראשונה) </td><td> Septodont </td><td> Selfast (# 0068Q) </td></tr><tr><td> Methacrylate מלט (צמנט שכבה שנייה) </td><td> GC InternationalCorp. </td><td> Unifast טראד - נוזלי (# 339292) Unifast טראד - פאודר (# 339114) </td></tr><tr><td> Carprofen </td><td> פייזר </td><td> Rimadyl </td></tr></tbody></table>

selective viral transduction of adult-born olfactory neurons for chronic in vivo optogenetic stimulation

Interneurons מקומיות מחדש ברציפות הנורה חוש הריח של מכרסמים הבוגרת 1-3. בתהליך זה, הנקרא neurogenesis למבוגרים, בתאי גזע עצביים בקירות החדר לרוחב להצמיח neuroblasts הנודדים של מילימטרים אחדים לאורך הנחל נודדות מקורי (RMS) כדי להגיע לשלב לתוך הנורה חוש הריח. כדי לחקור את השלבים השונים ואת ההשפעה של שילוב בוגרים שנולדו לתוך נוירון preexisting מעגלים חוש הריח, יש צורך סלקטיבי התווית לתפעל את הפעילות של האוכלוסייה הספציפי הזה של נוירונים. ההתפתחות האחרונה של optogenetic טכנולוגיות מציעה את ההזדמנות כדי להשתמש באור כדי להפעיל את זה בדיוק קבוצה ספציפית של נוירונים מבלי להשפיע על נוירונים סביב 4,5. כאן, אנו מציגים סדרה של נהלים virally להביע Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP במדגם מוגבלת temporally של neuroblasts ב RMS לפני שהם מגיעים הנורה הריח ולהיות מבוגר יליד נהurons. בנוסף, אנו מראים כיצד לכייל את השתל מיניאטורי LED עבור כרונית גירוי vivo של ChR2-לבטא נוירונים.

Watch this Scientific Journal Video about Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation at JoVE.com

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

נוירונים בוגרים שנולדו של הנורה חוש הריח יכול להיות נשלט באמצעות optogenetically Channelrhodopsin2-לבטא הזרקת lentiviral בזרם נודדות מקורי ו photostimulation כרונית עם מיניאטורי מושתל LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

selective-viral-transduction-adult-born-olfactory-neurons-for-chronic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

15.4K Views.  Institut Pasteur and Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). נוירונים בוגרים שנולדו של הנורה חוש הריח יכול להיות נשלט באמצעות optogenetically Channelrhodopsin2-לבטא הזרקת lentiviral בזרם נודדות מקורי ו photostimulation כרונית עם מיניאטורי מושתל LED.

Video: Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

שילוב של לימוד למבוגרים, יליד נוירונים

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

השרשה של סיבים אופטיות לגירוי Optogenetic כרוני של רקמת המוח

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...