この作品は、の&quot;ERA - NET NEURON&quot;のフレームで&quot;ANR - 09 - neuro -の異形004&quot;エコールデ神経科学パリ（ENP）、アジャンス国立デラルシェルシュ、&quot;ノヴァーリス- Taitbout&quot;生命保険会社によってサポートされていました欧州委員会によるFP7のプログラム、&quot;財団流動アラカルトルシェルシュMedicale&quot;、Letten財団とパスツール財団。

1。定位注射<ol><li>これらの実験で使用されているウイルスは、エクスプレスChannelrhodopsine2 - YFP（黄色蛍光タンパク質）の融合は、シナプシンプロモーター6によって駆動される構築するためにHIVウイルスに基づいて複製欠損レンチウイルスベクターです。プラスミドは、寛大にK. Deisserothの研究グループ（によって提供されていました<a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html">http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html</a> ）。レンチウイルスは、確立されたプロトコル7に記載の市販の供給源から入手または実験室で製造することができる。平均ベクトルの力価は、10 10形質導入単位/ mlのオーダーにあった。ウイルスのアリコートを-80℃で保存されており、ちょうどピペットのロード前に解凍する必要があります。複数の凍結/融解は避けてください。直接ドライアイスには決して暴露ウイルスソリューション。 </li><li>標準ピペットプラー（サッターPのホウケイ酸ガラス毛細管を用いて、ガラスピペットを準備-97ピペットプラー）。引き設定が適切に長いと剛性ピペットを得るために校正する必要があります。次に、直径30〜40μmの先端を得るためにハサミを使用してピペットの先端をカット。ストアは、埃のないボックスにピペットを引っ張った。 </li><li> 50 NLの配信のためにメーカーの指示でNanoject IIマイクロインジェクターを設定します。ミネラルオイルでバック充填することによりインジェクションピペットを準備し、インジェクタープランジャーに入れて下さい。定位フレームにインジェクターを取り付けます。ウイルス溶液を充填する前に、ガラスピペットから部分的に空のオイル</li><li>マイクロピペットで、パラフィルムの滅菌一部にウイルス溶液2μlを移す。優しくウイルス溶液の液滴にガラスピペットを下げ、1〜2μLをピペットを埋める。ピペット内に気泡がないことを確認してください。 </li><li>は100 mg / kgケタミンおよび滅菌生理食塩水で希釈した10 mg / kgのキシラジン、マウスを麻酔。の頭皮から髪を削除するげっ歯類のバリカン、かみそり、はさみ、または化学depilitory剤を用いて動物。 70％エタノールとbetadineを交互の3つのアプリケーションと頭皮を消毒する。すべての手術器具は、オートクレーブしてから、70％エタノールで消毒してください。頭がセキュアであることを保証する、耳のバーや鼻のバーと定位フレームに動物を置きます。角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。 </li><li>メスで、両目の間から耳の間に頭皮をカット。頭蓋骨を露出し、クランプのペアで皮膚を固定するために確保肌を引き出します。頭蓋骨の表面を清掃してください。定位固定装置は、ブレグマのガラスピペットの先端でゼロにされます。その後先端は注射部位（;メディオラテラル、それぞれ、左右半球のための± 0.82、、前部の後部、3.30）に配置されます。鼻のバーの位置が定位座標の計算に基づいて調整する必要があります。私たちの実験では、鼻のバーは、uを調整されntilブレグマと注射部位は、同じ高さに揃えられます。 </li><li>注射部位を特定する。高速外科ドリルを使用して、慎重に頭蓋骨に穴を開けます。先端にフック曲がった注射針で、硬膜を露出させる薄い骨の残骸を削除します。穴が正しい位置を中心としていることを確認します。掘削中に脳の表面に破裂血管にしないように注意してください。血管が破裂している場合は、ゆっくりと血流が停止するまで数秒のための小さな綿棒やティッシュペーパーで脳の表面に押してください。 </li><li>ピペットを下げて、ピペットの先端は、脳の表面に触れると背腹の高さをゼロに。その後、正しい背腹の深さ（背腹、脳の表面から2.9）の下側との圧力平衡のために30秒待ちます。 200 NLの合計ウイルスの4倍の50 NLを注入する。各注入の間に30秒待ちます。 </li><li>最後の注射から1分後、ゆっくりとパイプを撤回TTE。他の半球のためのポイント1.6から1.8を繰り返します。定位固定装置から動物を削除し、切開やステッチ外科のスレッドを使用してカット肌をきれいに。動物がケージに戻る前に温暖化パッドに回復することができます。さらに、動物は、直後に非ステロイド性抗炎症鎮痛剤（例えば、カルプロフェン4mg/kg）を与えられ、手術後3日間することができます。 </li></ol> 2。嗅球における in vivo optogeneticの刺激で慢性のLED注入<ol><li>レンチウイルス粒子を注入された動物は、二国間で次の慢性的に小型青色LED（オスラム、LED CMS 4.6W青）で注入される。コネクタがLEDの反対側に配置されるようにメスミニチュア電気コネクタへのはんだは、LEDピン。電気的な近道がないことを確認し、コネクタの正および負のピンを識別する。適切なケーブルも、LEDの現在のコントローラに接続してLEDをテストします。 </li><li>測定および/またはLEDの絶対的な光のパワーを設定するには、マウントマイクロマニピュレータとの位置にLEDが470nmのピーク光強度のパワーメータの光検出器と直接接触してLEDが。不透明な塩ビ板の直径3mmのピンホールを開けます。接辞は、このパワーメータにピンホールと光パワー対1mm 2あたりの消費電力を計算するために、入力電流の標準曲線を構築する。 </li><li> ° C ACSFはビブラトーム14を使用して0から4で脳を介して光の伝搬を測定するには、300の新鮮な脳組織のブロックをカット、500、1000、1500および2500μmの厚さ。 LEDの下に生きたマウスで行われたものと同一開頭と頭蓋骨の一部を置きます。最初に、LEDを中心に組織することなく光パワーを測定する。その後、LEDとパワーメータの光検出器の間の組織の各ブロックを配置し、電力を測定する。比率として計算された組織の厚さに対する相対的な透過率の曲線を、構築する組織を通じて、組織のない測定した電力間。 </li><li>は100 mg / kgケタミンおよび滅菌生理食塩水で希釈した10 mg / kgのキシラジン、マウスを麻酔。 70％エタノールでLEDを清掃し、消毒する。動物の頭皮から髪を削除し、70％エタノールとbetadineを交互の3つのアプリケーションと頭皮を消毒する。その後、定位フレームに動物を配置。角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。定位ホルダーにコネクターを取り付けます。嗅球上の頭蓋骨の表面は完全に水平とミニチュアの表面のLEDと平行になるまで鼻のバーの位置を調整する必要があります。 </li><li>メスで、耳の後方3mmまで目に前方3mmから頭皮をカット。わきの皮膚を引っ張り、クランプのペアとそれを固定してください。カミソリの刃を使用して頭蓋骨の表面に膜を削り取る。頭蓋骨を清潔で乾燥した。その後の広告を許可するようにシアノアクリレート接着剤の薄いカバーを適用する歯科アクリルのhesion。 </li><li>嗅球上、高速な手術ドリルを使用して、長方形の開頭（5.1ミリメートル尾を中心に、ブレグマから横方向0ミリメートル尾1mmと横3mm）を行います。慎重に薄い頭蓋骨、これを行うには骨の唯一の薄層が残っているまで。慎重に曲がった注射針の助けを借りて、残りの骨を取り除く。特別なケアは、硬膜を穿刺し、二つの半球間および嗅球の尾側縁に位置する主要な血管を破裂を避けるために注意する必要があります。脳の表面での血液の蓄積と凝固は、組織に最適な光の侵入を排除する。開頭し、滅菌生理食塩水で脳の表面を洗い流してから頭蓋骨を乾燥させる。 </li><li>コネクタにLEDのミニチュアを取り付けます。嗅球の上部にあるLEDミニチュアを下ろします。ミニチュアLEDの主軸は、滅菌生理食塩水とdとクリーンマウスの吻側 - 尾側軸に平行でなければなりませんRY頭蓋骨。その後、歯科アクリルの二層に続いてアクリルの最初の層（ すなわち 、ポリカルボキシレートセメント）と頭蓋骨、LEDを固定します。二つの小さなネジの加算は、LEDを修正するために必要となる場合があります。ネジは頭蓋骨に挿入（LEDの位置まで後方）との両方アクリルで覆われるべきである。アクリルはまだ液体である間、歯のアクリルの表面に頭皮のフリーエッジを引き戻すと接着剤。コネクタ上の任意のアクリルを適用しないように注意してください。アクリルが硬化した後は、定位固定装置から動物を取り外して、ケージに戻す前に、温暖化のパッドの上にリカバリできます。動物は、少なくとも7日間の手術から回復するために彼らのケージで隔離さ残っている。さらに、動物は、直後に非ステロイド性抗炎症鎮痛剤（例えば、カルプロフェン4mg/kg）を与えられ、手術後3日間することができます。 LEDは、実験着床前と終了後にテストする必要があります。 </li><li>光電気CALケーブルは、LEDのタイミングと強度を制御するパルス発生器（マスター- 8）に結合したLEDの電流制御器へのテザー動物のために使用されます。細いケーブルは、運動の完全な自由を可能にする。コネクタの極性を尊重するように注意してください。極性を反転させると、LEDが破損する恐れがあります。 </li></ol> 3。代表的な結果： ChR2 - YFPは、約48時間注入後の神経細胞を形質導入で発現しており、数ヶ月7のために安定しています。図1は、パラホルムアルデヒド固定動物の矢状断面15日間注射後の代表的な絵です。密なラベリングとRMSで注射部位のサイズに注意してください。新生児の細胞の多数は嗅球（図1）の異なる層を植民地化するRMSに沿って移行しています。融合タンパク質は、細胞体、樹状突起、および背骨を含むすべてのニューロンのコンパートメント、で表されます。 ミニチュアLED impla<html> ntationは大規模と関心の広範な地域の安価な光刺激することができます。動物は動きの完全な自由を可能にする光電気ケーブルとLEDコントローラにつながれている。脳組織における光の拡散とChR2活性化の閾値を特徴付けることによって、我々は、光活性化がLED（図2A）の表面の下に〜2mmの深さでトリガーすることができると推定している。の機能的活性化を監視するためにin vivoでの神経細胞をChR2を発現、c - fosの、神経活動のマーカーの発現は、反復的な光刺激（図2B）の後に分析することができます。別の方法として、焦点距離、光の刺激に結合ChR2発現ニューロンの in vitro電気生理学的記録の 14を実行することができます。最後に、2光子標的ルーズパッチ録音は in vivo 9 に LEDが同様のミニチュアでChR2発現皮質神経細胞の機能的活性化を研究するために使用されている。 ntent&quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig1.jpg" /> 図1。レンチウイルスの注射から吻側渡り鳥ストリームにChR2 - YFP発現15日後の吻側RMSのレンチウイルスの注射後のマウスの嗅球のsaggitalセクションの代表的な共焦点画像は、。 RMSの端からOBの別の層に移行する散乱YFP新生ニューロンの存在に注意してください。新生児の細胞（95％）のほとんどは、顆粒細胞層（GCL）と樹状突起の細胞体の嘘が外部網状層（EPL）の樹枝状にする顆粒細胞、です。新生ニ​​ューロンの小集団は、球状層におけるOBの最浅層部、（GL）まで移行する。スケールバー、100μmの。樹状突起にだけでなく、棘のChR2 - YFPの膜発現を示す新生児顆粒細胞のはめ込み、高倍率、。スケールバー、20μmの。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3380/3380fig2.jpg" /&gt; 図2。移植の図は、嗅球と新しい顆粒細胞を表すChR2 - YFPの光誘発c - fos発現の上にLEDが点灯します。 注入された嗅球上のLEDの、模式図。 B、​​一時間嗅球の光刺激後の二重標識ChR2 - YFP + c - fosの+顆粒細胞を示す代表的な共焦点画像。 C - fos発現は、ウサギ抗- c - fosの一次抗体（Calbiochem社、1:5000）とA568 -結合抗ウサギ二次抗体（Invitrogen社、1:1000）を用いて明らかにされる。スケールバー、10μmの。

<ol>
	<li>Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Alonso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+astrocytes+from+the+rostral+migratory+stream+into+neurons:+a+role+for+the+olfactory+sensory+organ.">Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ.</a> J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).</li><li>Mouret, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+survival+of+newly+generated+neurons:+when+time+matters.">Learning and survival of newly generated neurons: when time matters.</a> J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).</li><li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How,+when,+and+where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb.">How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).</li><li>Haubensak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+an+amygdala+microcircuit+that+gates+conditioned+fear.">Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear.</a> Nature. 468, 270-276 (2010).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+Production.">Lentivirus Production.</a> J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature protocols. 5, 247-254 (2010).</li><li>Huber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+optical+microstimulation+in+barrel+cortex+drives+learned+behaviour+in+freely+moving+mice.">Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice.</a> Nature. 451, 61-64 (2010).</li><li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+light-induced+activation+of+neural+circuitry+in+transgenic+mice+expressing+channelrhodopsin-2.">In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 .</li><li>Albeanu, D. 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Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).</li><li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics.">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li><li>Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Affordable+LED+Arrays+for+Photo-Stimulation+of+Neurons.">Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons.</a> J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

Optogeneticツールは、最近、嗅覚系における成人生まれたニューロンを含む選択的な神経集団、上の私たちのコントロールを増加している。ここでは、成人生まれのニューロンの特定の集団にChR2 - YFPの発現レンチウイルスベクターの定位注射を行う方法について説明します。注意深く期間ポスト噴射を監視することによって、我々は相対的に均質年齢の成人生まれのニューロンの集団の活動を...

<table border="1"><tbody><tr><td> 材 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>メリアル</td><td> Imalgène 1000年</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>バイエルヘルスケア</td><td> Rompum 0.2パーセント</td></tr><tr><td>ピペットプラー</td><td>サッター</td><td> P - 97 </td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー（3.5&quot;） </td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td> 3から000 - 203 - G / X </td></tr><tr><td> Nanoject IIマイクロインジェクター</td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td>高速外科ドリル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 18000〜17 </td></tr><tr><td>マイクロドリル鋼バリ0.7ミリメートルの先端径</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 19008〜07 </td></tr><tr><td> LED CMS青4.6 W </td><td>オスラム</td><td> LBW5SN </td></tr><tr><td>雌電気コネクタ（2.54 mm）の</td><td>フィッシャーElektronik社</td><td> BL5.36Z </td></tr><tr><td> LEDの現在のコントローラ（最大：1A） </td><td> A1W Electronik </td><td> HKO - KL50 - 1000 </td></tr><tr><td>パルスジェネレータ</td><td> AMPI </td><td>マスター- 8 </td></tr><tr><td>光パワーメータ</td><td>トール研究所</td><td> PM100 </td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>ロックタイト</td><td> 454 </td></tr><tr><td>ポリカルボキシレートセメント（第1層のセメント） </td><td> Septodont </td><td> Selfast（＃0068Q） </td></tr><tr><td>メタクリル酸セメント（第2層のセメント） </td><td> GC InternationalCorp。 </td><td> Unifastトラッド - 液体（＃339292） Unifastトラッド - パウダー（＃339114） </td></tr><tr><td>カルプロフェン</td><td>ファイザー</td><td> Rimadyl </td></tr></tbody></table>

selective viral transduction of adult-born olfactory neurons for chronic in vivo optogenetic stimulation

地元の介在は、連続して1月3日成人げっ歯類の嗅球に再生成されます。このプロセスでは、側脳室の壁の神経幹細胞は、嗅球に到達して組み込むことが吻側渡り鳥ストリーム（RMS）に沿って数ミリ程度のために移行する神経芽細胞を生じさせる、成体のニューロン新生と呼ばれる。異なる手順と嗅覚回路を既存のに成人生まれのニューロンの統合の影響を調べるために、それはニューロンのこの特定の集団の活性を選択的にラベルを付けたり、操作する必要があります。 optogenetic技術の最近の開発は、正確に4,5周囲のニューロンに影響を与えずに、ニューロンのこの特定のコホートをアクティブにするには、光を使用する機会を提供しています。ここで、我々は、彼らが嗅球に到達する前にRMSの神経芽細胞の時間的に制限されたコホートにおけるウイルス発現するChannelrhodopsin2（ChR2）- YFPへの一連の手順を提示し、成人生まれのNEになるurons。さらに、我々はChR2発現ニューロンの in vivo刺激で慢性のLEDミニチュアを移植し、キャリブレーションする方法を示します。

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Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

嗅球のアダルト生まれのニューロンはoptogenetically Channelrhodopsin2発現吻側渡り鳥ストリームとLEDが注入されたミニチュアと慢性的な光刺激にレンチウイルス注入を使用して制御することができます。

慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

15.4K ビュー.  Institut Pasteur and Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). 嗅球のアダルト生まれのニューロンはoptogenetically Channelrhodopsin2発現吻側渡り鳥ストリームとLEDが注入されたミニチュアと慢性的な光刺激にレンチウイルス注入を使用して制御することができます。

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Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

アダルト生まれのニューロンの統合を検討し

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

神経科学

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

嗅神経細胞のレンチウイルスを介した遺伝子操作と可視化 in vivoで</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

脳組織の慢性Optogenetic刺激のための光ファイバ注入

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

で逃避行動のOptogenetic刺激<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法<em&gt;インビボ</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

聴覚神経の光遺伝学的刺激

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...