אנו מודים לפרופסור Hiraoka לשליחת לנו זנים. אנו מכירים תמיכה מן גוסטפסון גוראן קרן האגודה למלחמה בסרטן שוודית (2008/939).

1. שמרים ביקוע תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אדינבורו מדיה מינימלי (EMM) ו EMM ללא ammoniumchloride (EMM-N) 8. כדי להפחית autofluorescence הפתרון גלוקוז לא צריך להיות autoclaved אלא לסנן מעוקר באמצעות 0.2 מיקרומטר לסנן והוסיף לאחר מכן לכלי התקשורת autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן שמרים תאים ביקוע גדלה טרי עם מדיה עשירה על צלחת אגר, yea 8, ב 3 מ&quot;ל של נוזל התקשורת EMM עם גלוקוז מעוקרים הסינון. השתמש צינורות 13mL עם דחף קלות על מכסה כדי להבטיח אוורור טוב של התאים. בואו התאים לגדול על ידי רועדת להם סל&quot;ד 225 ב 30 ° C. שמור את התאים לגדול בשלב יומן (1 X 06-02 אוקטובר 10 X 7 תאים / מ&quot;ל) עבור 2 ימים על ידי ספירת אותם באמצעות תא שודד גופות&#39; ואחריה דילול מתאים, כל בוקר וכל ערב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניסוי לוודא שיש תאים בשלב מוקדם יומן, 5 X 06-01 אוקטובר 10 X 7 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לא לגווע ברעבהוא התאים חנקן במהלך מתג 20 דקות מהתקשורת EMM כדי EMM-N התקשורת. הדבר נעשה על ידי קצירת 3 מ&quot;ל של תאים צינור 1.5 Eppendorf מ&quot;ל בצנטריפוגה ספסל העליון בבית RCF 1.5 מקסימום כמו צנטריפוגה במהירות גבוהה יותר עלולה לגרום תגובת הלחץ בשמרים ביקוע 9. השתמש בטכניקה ספינינג כפול, כלומר, ספין הראשון 2 דקות, ולאחר מכן להפעיל את הצינור Eppendorf 180 ° ו - ספין שוב עבור 1.5 RCF 2 דקות 10. זה עוזר לאסוף את כל התאים באחד גלולה בחלק התחתון של הצינור. שטפי פעם עם EMM-N ואז לפזר את גלולה EMM ב-N ו - דגירה על התאים למשך 15 דקות בקצב של 30 ° C רועדת 225 סל&quot;ד ולאחר מכן המשך בשלב 2. לדוגמה הכנה. </li></ol> 2. לדוגמה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר 1.5 מ&quot;ל של תאים צינור 1.5 Eppendorf מ&quot;ל בצנטריפוגה ספסל העליון בבית RCF 1.5 מקסימום כמו צנטריפוגה במהירות גבוהה יותר עלולה לגרום תגובת הלחץ בשמרים ביקוע 9. השתמש בטכניקה ספינינג כפול, meaning: הראשונה ספין 2 דקות, ולאחר מכן להפעיל את הצינור Eppendorf 180 ° ו - ספין שוב RCF 1.5 דקות 2 10. זה עוזר לאסוף את כל התאים באחד גלולה בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant, אבל להשאיר 10-15 μL ו resuspend התאים בתקשורת הנותרים. לחילופין להוסיף 10 μL התקשורת טריים resuspend גלולה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שיש שקופיות זכוכית שקופה ומכסה זכוכית (לא 1.5). בדרך כלל אתה לא צריך לנקות אותם, אבל לוודא שהם לא מלא אבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים מהמקפיא aliquot של פתרון מלאי של לקטינים 1mg/mL כי כבר מעוקרים הסינון. הפתרון לקטינים ניתן refrozen כמה פעמים. לקטינים משמש כדי לתקן את התאים שמרים על הזכוכית המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מקום μL של EMM עם גלוקוז מעוקרים לסנן על הזכוכית אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 5 μL של פתרון לקטינים בפינה של זכוכית המכסה. לאחר מכן מקום 5 μL של תרבית תאים באותה פינה, כלומר ירידה לקטינים. מערבבים ידי pipetting כמה פעמים ולאחר מכן להפיץ את התא תרבות לקטינים לערבב ברחבי זכוכית לכסות באמצעות צד ארוך של קצה פיפטה. בהתאם לצפיפות של תערובת הסלולרי שלך לעזוב הכל או להתחנף נוזל עודף בפינה הנגדית של הזכוכית המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מכסה זכוכית, למעלה, עם צד אחד על הזכוכית אובייקטיבי את הצד השני על הספסל. תן זכוכית לכסות יבש קצת לכמה דקות. זה צריך להיות ממש לא יבש לגמרי, אבל זה לא צריך להיות נוזלי יותר מדי על הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מכסה זכוכית עם מלאך 70 ° בקירוב מן הכוס אובייקטיבי על ידי ירידה של EMM. עזוב את מכסה הזכוכית, כך שהוא יפול מלמעלה למטה לתוך ירידה של EMM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסגור את הקצוות עם גריז סיליקון להכין מזרק 2 מ&quot;ל. חותכים את סוף רחב של טיפ 200 μl וצרף אותו המזרק. מלאו את המזרק עם כ 1 מ&quot;ל של שמן סיליקון. קו דק של סיליקון מוחל על הקצוות של זכוכית המכסה על ידי מוגלה בעדינותהינג את הבוכנה של המזרק. עכשיו יש לכם חדר קטן צמיחה ש pombe תאים. </li></ol> 3. מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Initialise מיקרוסקופ פלואורסצנטי ידי הפעלת מנורת כספית / קסנון, את המיקרוסקופ לבין המחשב. מניחים את השמרים צמיחה קאמרית מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש אובייקטיבי או 63 X 100 X מטרה עם NA = 1.3 ומעלה. אם אובייקטיבית שמן משמש, להוסיף שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשדה בהיר כדי למצוא את התאים לקבל תמונה חדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההגדרות עבור מיקרוסקופיה את הקרינה משתנות בהתאם fluorochromes המשמש תווית בתאי שמרים את המיקרוסקופ. אנו משתמשים במיקרוסקופ confocal Zeiss LSM 700 לייזר מיקרוסקופ סריקה באמצעות תוכנית Apochromat-63x עדשה אובייקטיבי שמן (NA = 1.4) עם הגדרת קו 16 מטוס הממוצע סריקה. חריר צריך להיות מוגדר 1-1.1 יחידות אוורירי, אשר נותן פרוסה אופטי של 0.8 מ&quot;מ. אנו מזהים ב-GFP מסלול 1 באמצעות הגדרת מסנן עבור Alexa 488 עם קרן splitter ב 582 ננומטר, ובכך דetecting באורכי גל שבין 488 ו - 582 ננומטר. במסלול 2 אנו משתמשים להגדיר מסנן אופטימלי mCherry באמצעות קרן splitter ב 578 ננומטר, ולכן גילוי באורכי גל שבין 578 ו - 600 ננומטר. פירוש הדבר כי מסלול 2 הן mRFP (SPB) ו NM (mCherry) יזוהו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמו הרבה תמונות צריך להיות מסוגל למדוד ב -60 תאים שונים עבור כל זן. בדרך כלל 15 תמונות של שדות מיקרוסקופיה עצמאי מספיק. מומלץ קאמרית צמיחה חדשים עם תאים טריים הוא עשה, אם הזמן מיקרוסקופיה שלך עולה 60 דקות. </li></ol> 4. מדידה כמותית של המרחקים subcellular <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונות בתוכנית זן Edition Zeiss אור. באמצעות כלי מדידה למדוד את המרחק בין מיקרומטר fluorochromes שונים כל התאים שבו כל האותות הן במישור מוקד זהה. התאם את עוצמת התאורה ואת הניגודיות לזהות את מרכז האות ניאון. זה פרוטוקול פשוט משתמשת רק שני ג שונהolours ומכאן SPB ו NM הם באותו ערוץ. SPB היא בחרה לצאת ידי המבנה העגול הגדול שלה NM. מעבירים את המרחקים גיליון פנקס. מדוד לפחות 60 תאים. תוכניות אחרות כגון ImageJ יכול לשמש גם למדוד את המרחק, אבל אור Zeiss זן עדיפה בגלל רזולוציה גבוהה יותר של התמונה ואת הקלות כדי להתקרב ולהתרחק באמצעות תוכנית. תמונות בפורמט LSM נפתח ImageJ יהיו שני ערוצים על גבי אחד את השני. כדי ליצור תמונה עם שני הערוצים, קודם לפצל את שני ערוצי ואילך למזג אותם. לאחר מכן הכלי קו ניתן להשתמש כדי למדוד את המרחקים כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את המרחקים subcellular אומר או החציוני בין זנים וטיפולים שונים באמצעות תוכנית סטטיסטית, למשל מבחן t או Mann-Whitney Test סכום דרגה, למשל באמצעות תוכנה SigmaStat-3.5. לעיתים קרובות המידע אינו מופץ בדרך כלל מאז תהיה בחירה עבור תאים עם קצרהמרחקים בין אותות ניאון מאז כל האותות צריכים להיות במישור המוקד אותו כדי להימדד. מבחן t ניתן להשתמש רק כאשר הנתונים יש התפלגות נורמלית בעוד Mann-Whitney Test סכום דרגה מאפשרת השוואה של סדרות נתונים חוסר ההתפלגות הנורמלית. במבחן-t ממוצע של שני מערכי נתונים שונים מושווים בעוד מבחן מאן ויטני-Sum דרגה החציוני בהשוואה. </li></ol> 5. נציג תוצאות מסננים PJ1185: (ח + + his7: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 + hphMX6 לאצו] sid4-mRFP: kanMX6 cut11-mCherry: natMX6 ura4-D18 leu1-32-DN ade6 / N) היה גדל EMM . המדגם היה מכונס רכוב בתא גידול קטן צולמו התמונות (איור 1 א + N). לאחר מכן בתקשורת הצמיחה הוחלפה ammoniumchloride EMM w / o (EMM-N), ותאי היו grown במשך 15 דקות תוך כדי רעד. התאים חנקן היו מורעבים רכוב אז בתא עם צמיחה EMM-N והתמונות נלקחו (איור 1A-N). כלי המדידה היה להשתמש בהם כדי למדוד את המרחק בין מוקד (GFP) ו SPB (איור 1B ו טבלה 1). בנוסף, המרחק בין מוקד (GFP) ואת NM נמדדה (איור 1B ו טבלה 2). המרחקים subcellular חציון לפני ואחרי דלדול חנקן הושוו באמצעות תוכנה 3.5 SigmaStat (לוח 3). לא היה שינוי משמעותי סטטיסטית לוקליזציה של אשכול גנים מתרחק NM כלפי SBP. נתוני מדידת המרחק בין ה-GFP לבין SBP היתה התפלגות נורמלית ולכן המרחקים אומר (1.777 מיקרומטר + ​​N ו-N 1587 מיקרומטר) ניתן להשוות באמצעות מבחן t (טבלה 1 ו -3). לא היה הבדל משמעותי בין שני הערכים הממוצעים (P = 0.008, t-test). נתוני מדידת המרחק בין ה-GFP ו NM לא היה לי די נורמליstribution ולכן המרחקים החציוני (0 מיקרומטר + N ו - 0.390 מיקרומטר-N) הושוו באמצעות Mann-Whitney סכום דרגה הבדיקה (טבלה 2 ו -3). לא היה הבדל משמעותי בין שני הערכים החציוני (P &lt;0.001, Mann-Whitney סכום מבחן דרגה). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" /> באיור 1. לוקליזציה של אשכול גנים בשם Chr1, המסומן על ידי ה-GFP, השתנה אחרי הרעבה החנקן. (א) בטור השמאלי, + N, גרעין התא נציג מתא גדל בטור הימני EMM,-N, גרעין התא נציג מתא גדל EMM-N. הירוק הוא אות ה-GFP תיוג אשכול Chr1, אדום הוא mRFP ו mCherry תיוג SPB ו NM, בהתאמה. (ב) לגרעין התא זהה (A), אבל עכשיו עם מרחקים subnuclear נמדד; צהוב: הקוטר של גרעין התא, כחול: המרחק בין SPB ו-GFP האות ורוד: המרחק בין האות ה-GFP ואת קרום הגרעין. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="טבלה 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg" /> <img alt="טבלה 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" /> <img alt="טבלה 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" /> טבלה 1. המרחקים subnuclear נמדד מיקרומטר של זן PJ1185 גדל EMM. שורה ראשונה, בקוטר של התא (ד), בשורה השנייה, המרחק בין ה-GFP לבין SPB, בשורה השלישית, המרחק בין ה-GFP לבין NM. <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" /> <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" /> <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" /> טבלה 2. המרחקים subnuclear נמדד מיקרומטר של זן PJ1185 גדל EMM-N. שורה ראשונה, בקוטר של התא (ד), בשורה השנייה, המרחק בין ה-GFP לבין SPB, בשורה השלישית, המרחק בין ה-GFP לבין NM. <imgalt = &quot;טבלה 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3454/3454table3.jpg&quot; /&gt; לוח 3. סטטיסטיקה תיאורית של מרחקים subnuclear שנצפתה זן PJ1185 לפני (+ N) ואחרי (-N) הרעבה חנקן. שורה ראשונה: מספר התא נמדד, שורה שנייה: פירוש (ד) קוטר, שורה שלישית: הקוטר החציוני (ד), ועוד שורה: כלומר המרחק בין ה-GFP ו SPB, שורה חמישית: המרחקים בין חציון GFP ו NM.

<ol>
	<li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-802 (1994).</li><li>Robinett, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).</li><li>Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14, 943-943 (1998).</li><li>Asakawa, H., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging+of+meiotic+chromosome+dynamics+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).</li><li>Alfredsson-Timmins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+chromatin+is+an+early+response+to+nitrogen+starvation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 118, 99-99 (2009).</li><li>Kristell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+depletion+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+causes+nucleosome+loss+in+both+promoters+and+coding+regions+of+activated+genes.">Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes.</a> Genome. Res. 20, 361-361 (2010).</li><li>West, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cut11(+):+A+gene+required+for+cell+cycle-dependent+spindle+pole+body+anchoring+in+the+nuclear+envelope+and+bipolar+spindle+formation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).</li><li>Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+protein+Cdc11p+links+Sid4p+to+the+fission+yeast+septation+initiation+network.">The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).</li><li>Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-dependent+specific+positioning+and+clustering+of+centromeres+and+telomeres+in+fission+yeast.">Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast.</a> J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).</li><li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).</li><li>Soto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+centrifugation-induced+gravity+forces+through+mitogen-activated+protein+kinase+pathways+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).</li><li>Hagan, I. M., Ayscough, K. R., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence microscopy in yeast. , (2000).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+and+exploiting+the+fluorescent+protein+paintbox+(Nobel+Lecture).">Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).</li><li>Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Imaging+of+Mitosis+After+siRNA+Transfection.">Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection.</a> J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).</li></ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

בעשור האחרון השימוש הדמיה תא חי כדי לפקח על אירועי הסלולר הפך יותר ויותר פופולרי. זה התחיל עם השימוש של חלבון פלואורסצנטי ירוק של מדוזה Aequorea ויקטוריה ועכשיו fluorochromes שונים זמינים פולטי הקרינה באמצעות ספקטרום רחב של ציאן (475 ננומטר) עד כה אדום (648 ננומטר) 11. אחד היתרונות העיקריים של הדמיה תא חי מעל immunofluorescence היא כי התאים אינם קבועים על ידי פורמלדהיד או אתנול / אצטון טיפול לפני במיקרוסקופ, ומכאן הימנעות חפצים אפשרי מתהליך קיבעון. בנוסף, הדמיה תא חי מציעה את האפשרות לעקוב אחר תאים בודדים לצלם במרווחים תכופים במהלך שעות או ימים של דגירה, כך שניתן לקבל עוד סרטים של אירועים הסלולר 12. בתאי יונקים יש את היתרון של בעל גודל גדול, עם קוטר של כ -100 מיקרומטר, לעומת תא שמרים קטנים בקוטר של 3-4 על &amp;מו: מ &#39; מצד שני, היתרון הוא עם שמרים הגנום מניפולציות בקלות. הומולוגיים רקומבינציה מתרחשת ביעילות רבה בשמרים והוא משמש הפתיל חלבונים עניין fluorochromes שונה 3. יתר על כן, באמצעות שילוב ממוקד של רצפי לאצו וביטוי הבאות של חלבון LacR-GFP מאפשר זיהוי של חלק מסוים של הגנום תוך גרעין התא 2. באמצעות ס תאים pombe במיקרוסקופ יש יתרונות נוספים שכן הם אורגניזמים unicellular טבעי לגדול עם הזמן דור מהיר בעלות נמוכה תנאי תרבית תאים. יתרה מזאת, ס &#39; pombe הוא אורגניזם מודל מצוין אוקריוטים שכן יש מטזואניים גנים הומולוגיים. אחת המגבלות העיקריות של טכניקה זו היא autofluorescence בתא שמרים להפריע לזיהוי של האות נכון. בעיה זו ניתן להתגבר באמצעות התקשורת צמיחה מינימלית עם גלוקוז מעוקרים לסנן במקום autoclaved. בתוךאת השמרים תאים בנוסף צריך להיות מבוגר עבור 2 ימים לפני שלב להיכנס גובר עליהם. הפרוטוקול המובא כאן מציע שיטה פשוטה יחסית, אך עדיין כמותי כדי לקבוע את subcellular לוקליזציה של חלבונים בתוך התא בשמרים. יתר על כן על ידי לצלם בנקודות זמן שונות נוכל לעקוב אירועים הסלולר.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערה </td></tr><tr><td> לקטינים </td><td> סיגמא </td><td> L1395 </td><td></td></tr><tr><td> סיליקון גריז </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ לייזר סורק LSM 700 </td><td> Zeiss </td><td> LSM 700 </td><td> מיקרוסקופ confocal אחרים יכול לשמש. </td></tr><tr><td> SigmaStat 3.5 </td><td> Statcon </td><td> SigmaStat 3.5 </td><td> כל תוכנה לניתוח סטטיסטי יכול לשמש. </td></tr></tbody></table>

quantitative live cell fluorescence-microscopy analysis of fission yeast

שיטות מיקרוסקופיה קיימות מספר היום כי ניתן לזהות חלבון מסוים בתוך התא. בעשור האחרון הדמיה תא חי באמצעות fluorochromes כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מחוברת ישירות לחלבון של עניין הפך יותר ויותר פופולרי 1. בעזרת ה-GFP ו fluorochromes דומה localisations subcellular ותנועות של חלבונים ניתן להבחין מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יתר על כן, גם לוקליזציה subnuclear באזור מסוים של כרומוזום ניתן ללמוד באמצעות טכניקה זו. ה-GFP הוא התמזגו לחלבון לאק repressor (LacR) והביע ectopically בתא בו חוזר טנדם של רצף לאצו כבר מוכנס לתוך האזור של עניין על כרומוזום 2. LacR-GFP יהיה לאגד את חוזרת לאצו וכי האזור של הגנום יהיה גלוי כנקודה ירוקה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שמרים מתאים במיוחד מאז הומולוגיים עבור סוג זה של מניפולציהרקומבינציה יעילה מאוד, ובכך מאפשרת שילוב ממוקד של חוזר לאצו חלבונים מהונדסים היתוך עם GFP 3. כאן אנו מתארים שיטה לניתוח כמותי של תא חי שמרים ביקוע. פרוטוקולים נוספים עבור ניתוח תא חי של שמרים ביקוע ניתן למצוא, למשל על איך לעשות סרט של 4 התנהגות meiotic כרומוזומליות. בניסוי הספציפי הזה אנחנו מתמקדים בארגון subnuclear וכיצד הוא מושפע במהלך אינדוקציה גן. יש לנו שכותרתו אשכול גנים, בשם Chr1, על ידי כניסתה של אתרי לאצו מחייב בקרבת הגנים. אשכול הגן מועשר עבור גנים המושרה מוקדם במהלך רעב חנקן של שמרים ביקוע 5. בשנת המתח בקרום הגרעין (NM) מסומן על ידי החיבור של mCherry כדי Cut11 NM חלבון והוליד אות ניאון אדום. הפולני ציר הגוף (SPB) הוא תרכובת Sid4 התמזגו חלבון פלואורסצנטי אדום (Sid4-mRFP) 6 </sלמעלה&gt;. בתאי שמרים vegetatively גדל centromeres מחוברים תמיד SPB המוטבע NM 7. SPB מזוהה כמבנה עגול גדול NM. על ידי הדמיה לפני 20 דקות לאחר דלדול של מקור חנקן אנו יכולים לקבוע את המרחק בין באשכול גנים (GFP) ואת NM / SPB. המרחקים אומר או חציון לפני ואחרי דלדול חנקן מושווים ואנחנו יכולים לכמת ולכן אם יש או אין שינוי לוקליזציה subcellular של אשכול הגנים לאחר דלדול חנקן.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast at JoVE.com

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

שמרים הביקוע,<em&gt; Schizosaccharomyces pombe</em&gt;, היא מערכת מודל טובה ללמוד תהליכים תאיים בסיסיים. כאן אנו מתארים שיטה לבצע ניתוח כמותי תא חי של שמרים ביקוע. בניסוי הספציפי הזה אנחנו מתמקדים בארגון של הגנום תוך גרעין התא, אך השיטה יכולה לשמש גם כדי לחקור גורמים cytosolic.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

quantitative-live-cell-fluorescence-microscopy-analysis-fission

Research

JoVE Journal

Biology

20.1K Views.  University of Uppsala. שמרים הביקוע, Schizosaccharomyces pombe, היא מערכת מודל טובה ללמוד תהליכים תאיים בסיסיים. כאן אנו מתארים שיטה לבצע ניתוח כמותי תא חי של שמרים ביקוע. בניסוי הספציפי הזה אנחנו מתמקדים בארגון של הגנום תוך גרעין התא, אך השיטה יכולה לשמש גם כדי לחקור גורמים cytosolic.

Video: Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

ניתוח Spatiotemporal של אירועים Cytokinetic שמרים ביקוע

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...